Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка фотосинтетического поведения путем одновременного измерения отражения листьев и анализа флуоресценции хлорофилла

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59838

⸱

9 августа 2019 г.

1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем новый технический подход к изучению фотосинтетических реакций в высших растениях, включающий одновременные измерения хлорофилла флуоресценции и отражения листьев с помощью PAM и спектрального радиометра для обнаружения сигналов от той же области листьев в Арабидопсис.

Аннотация

Хлорофилл флуоресценции анализ широко используется для измерения фотосинтетического поведения в нетронутых растений, и привело к разработке многих параметров, которые эффективно измеряют фотосинтез. Анализ отражения листьев обеспечивает несколько показателей растительности в экологии и сельском хозяйстве, включая индекс фотохимического отражения (PRI), который может быть использован в качестве индикатора рассеивания тепловой энергии во время фотосинтеза, поскольку он коррелирует с нефотохимическое закалка (НПЗ). Однако, поскольку NP является составным параметром, для понимания характера параметра PRI требуется его проверка. Для получения физиологических доказательств для оценки параметра PRI мы одновременно измеряли флуоресценцию хлорофилла и отражаем листья в дефектных мутантах цикла ксантофилла(npq1)и растениях арабидопсис дикого типа. Кроме того, параметр qq, который, вероятно, отражает цикл ксантофилла, был извлечен из результатов анализа флуоресценции хлорофилла путем мониторинга релаксации кинетики NP после выключения света. Эти одновременные измерения проводились с использованием импульсно-амплитудной модуляции (PAM) хлорофилла флюорометра и спектрального радиометра. Волоконные зонды с обоих инструментов были расположены близко друг к другу для обнаружения сигналов из одного и того же положения листа. Для активации фотосинтеза использовался внешний источник света, а измерительные огни и насыщенный свет были предоставлены прибором PAM. Эта экспериментальная система позволила нам контролировать светозависимых PRI в нетронутой завода и показал, что светозависимые изменения в PRI значительно отличаются между диким типом и npq1 мутант. Кроме того, PRI сильно коррелировал с q, что означает, что q q е отражает цикл ксантофилла. В совокупности эти измерения показали, что одновременное измерение отражения листьев и флуоресценции хлорофилла является допустимым подходом для оценки параметров.

Введение

Отражение листьев используется для удаленного смысле растительных индексов, которые отражают фотосинтез или черты в растениях1,2. Нормализованный индекс растительности разницы (NDVI), который основан на инфракрасных сигналах отражения, является одним из наиболее широко известных растительных показателей для обнаружения свойств, связанных с хлорофилла, и используется в экологии и сельскохозяйственных науках как индикатор экологических реакций на деревья или сельскохозяйственные культуры3. В полевых исследованиях, хотя многие параметры (например, индекс хлорофилла (CI), индекс воды (WI) были разработаны и использованы, лишь немногие подробные проверки того, что эти параметры непосредственно (или косвенно) обнаружить были выполнены с использованием мутантов.

Импульсно-амплитуда модуляции (PAM) анализ хлорофилла флуоресценции является эффективным методом для измерения фотосинтетических реакций и процессов, участвующих в фотосистеме II (PSII)4. Хлорофилл флуоресценция может быть обнаружена с помощью камеры и использоваться для скрининга фотосинтеза мутантов5. Однако для обнаружения флуоресценции хлорофилла требуется комплексная обработка или импульсы насыщения света, которые трудно реализовать в полевых исследованиях.

Листья поглощается солнечной энергии света в основном потребляется фотосинтетических реакций. В отличие от этого, поглощение избыточной световой энергии может генерировать реактивные виды кислорода, что приводит к повреждению фотосинтетических молекул. Избыток световой энергии должен рассеиваться в виде тепла через нефотохимические механизмы закалки (NP)6. Индекс фотохимического отражения (PRI), отражающий светозависимые изменения параметров отражения листьев, получен из узкополосного отражения на уровне 531 и 570 нм (длина референтной волны)7,8. Сообщается, что он коррелирует с NP' в анализе флуоресценции хлорофилла9. Однако, поскольку NP является составным параметром, который включает цикл ксантофилла, традиции состояния и фотоингибионизацию, требуется детальная проверка, чтобы понять, что измеряет параметр PRI. Мы сосредоточились на цикле ксантофилла, системе теплового рассеивания, включающей деэпоксидацию пигментов ксантофилла (вилаксантин к анциклантину и зеаксантину) и основной компонент НПЗ, поскольку корреляции между PRI и преобразованием этих пигменты были зарегистрированы в предыдущих исследованиях8.

Многие мутанты, связанные с фотосинтезом, были изолированы и идентифицированы в арабидопсисе. Npq1 мутант не накапливает сядевие, потому что он несет мутации в альтоксантин де-эпоксидазы (VDE), который катализает преобразование альтаксантин зеаксантин10. Чтобы установить, обнаруживает ли PRI только изменения в пигментах ксантофилла, мы одновременно измерили ФЛуоресценцию PRI и хлорофилла в одной и той же области листьев в npq1 и диком типе, а затем расчленяли NP в разной временной шкале темного расслабления для извлечения компонент11,связанный с ксантофилом. Эти одновременные измерения обеспечивают ценную технику для назначения индексов растительности. Кроме того, поскольку PRI коррелирует с валовой первичной производительностью (GPP), возможность присваивать PRI точно одному компоненту имеет важное применение в экологии12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выращивание растений арабидопсис

  1. Замочите семена Arabidopsis thaliana в стерилизованной деионизированной воде в микротрубке, и инкубировать в течение 2 дней при 4 градусах Цельсия в темноте.
  2. Поместите примерно четыре из впитанных, холодных обработанных семян на поверхность почвы с помощью микропипетта. Инкубировать посаженные горшки в камере роста с 16 ч свет (120 фотонов м-2 s -1) и 8 ч темный период при 22 и 20 градусов по Цельсию, соответственно.
  3. Выращивайте одно растение на горшок, истончив другие саженцы после прорастания. Подготовьте не менее пяти горшков. Инкубировать растения в камере роста в течение дополнительных 4 недель. Для экспериментов используются три растения.
  4. Используйте самый молодой, полностью открытый зрелый лист для измерения фотосинтеза.

2. Настройка этапа выборки, фотосинтетических инструментов и источника света

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, специально построенный этап образца был использован для фиксации листьев и обнаружения зондов(рисунок 1).

  1. Прикрепите 10 см2 стальной пластины с отверстием диаметром 1 см на специально сделанной стадии образца. Размер отверстия в этой пластине может быть изменен для размещения различных образцов листьев или видов растений. Этап имеет зажим для фиксировать зонды обнаружения и регулятор для того чтобы отрегулировать расстояние между зондами и образцом листа.
  2. Подготовьте тонкие волокна зондов для измерения флуоресценции хлорофилла и отражения листьев. Эти тонкие волокна зонды будут расположены близко так, что они измеряют сигналы из той же позиции листа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фторометр хлорофилла ПАМ и спектральный радиометр были адаптированы для обнаружения сигнала хлорофилла флуоресценции и отражения листьев, соответственно. Оба прибора используют тонкие волоконные зонды диаметром 1 мм и 2 мм соответственно.
  3. Fit эти два зонда плотно вместе и оберните их с пластиковой лентой.
  4. Закрепите заклеенные лентой зонды на стадии образца с помощью держателя коаксиального объектива (см. Рисунок1), и расположите их вертикально на поверхность листа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поле зрения волоконно-оптического кабеля в спектральном радиометре составляет 25 евро. В этом методе расстояние между кончиками волоконного зонда и поверхностью листа короче 1 см. Таким образом, площадь измерительного листа почти такая же, как у волокна.
  5. Прикрепите двухстворчатое световое направляющее из стеклянных волокон к источнику галогенного света и облучайте этап образца с обоих направлений под углом примерно 45 градусов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Галогенная лампа, которая близка к распределению длины волны естественного солнечного света, используется в качестве актинового света для индуцирования фотосинтеза. Источник галогенного света был адаптирован со встроенным холодным фильтром, который удаляет длинные длины волн из ближнего инфракрасного излза, чтобы предотвратить повышение температуры поверхности листа (от 400 до 800 нм).
  6. Отрегулируйте источник света так, чтобы свет равномерно освещал этап образца без отбрасывания теней.

3. Настройка одновременных измерений отражательной установки листьев и флуоресценции хлорофилла

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги выполняются в темной комнате, чтобы избежать обнаружения света, кроме актимного света. Слабо-зеленый свет (например, зелено-целлофановый свет) должен быть выключен до фактических измерений.

  1. Измерение расстояния между образцом листа и зондами на стадии образца.
    1. Поместите пробный лист на держатель листа стадии образца в темноте. Прижмите лист к стальной пластине на сцене (черный квадрат на рисунке 1).
    2. Включите PAM и облучите образец листа измерительным светом. Значения интенсивности флуоресценции хлорофилла подтверждаются с помощью программного обеспечения для управления PAM (см. ТаблицуМатериалов).
    3. Переместите регулятор так, чтобы интенсивность флуоресценции измеряла примерно 100. Измерьте расстояние между зондом и листом. Зафиксировать регулятор и зафиксировать значение расстояния на регуляторе.
    4. Выключите измерительный свет. Удалите тестовый лист.
  2. Измерение интенсивности излучения актиния света
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения за светозависимым фотосинтетическим поведением используется актинийный свет различной интенсивности для облучения образца листьев.
    1. Установите легкий квантовый метр в положении, где будет размещен образец листа.
    2. Излучайте свет от галогенного источника света и измеряйте интенсивность.
    3. Определите, какие позиции циферблата источника света будут генерировать интенсивность 30, 60, 120, 240 и 480 фотонов м-2 с-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Арабидопсис растения выращиваются под 120 фотонов м-2 с -1; поэтому интенсивность излучения актиния света выбрана для обеспечения целого ряда малых и больших интенсивностей.
    4. Отметьте каждую интенсивность облучения на циферблате.
  3. Измерьте стандарт отражения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета коэффициента отражения листьев требуется стандарт отражения листьев при каждой интенсивности излучения.
    1. Поместите белую пластину в качестве стандарта отражения в положении образца листа.
    2. Включите спектральный радиометр. Сигнал отражения показан спектральным радиометром, контролирующим программное обеспечение. В настоящее время нет спектральных данных, потому что нет облучения света.
    3. Включите галогенную лампу, чтобы облучить с 480 фотонами м-2 s -1, самая высокая интенсивность излучения в этом тесте.
    4. Отрегулируйте силу обнаружения радиометра, чтобы избежать насыщения.
    5. Запись спектрального отражения между 450-850 нм с интервалом 1 нм под освещением с 30, 60, 120, 240 и 480 фотоновм -2 s-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: базовый электрический сигнал (темный ток) корректируется и вычитается при каждом спектральном измерении.

4. Одновременные измерения отражения листьев и хлорофилла флуоресценции, а также расчет фотосинтетических параметров

  1. Установите растение в положении образца листа.
    1. Перенесите растение Arabidopsis из выращенной камеры в контролируемую темную комнату с той же температурой и влажностью, что и камера роста.
    2. Инкубировать растение в течение 1 ч в темноте при 22 градусах Цельсия, чтобы рассеять электроны из центра реакции PSII и расслабиться от нефотохимического закалки.
    3. Поместите темно-адаптированное целое растение на лабораторный домкрат под стадией образца(рисунок 1).
    4. Закрепите образец листа к держателю листа так, что поверхность листа перпендикулярна зондам обнаружения.
  2. Измерение максимальной квантовой урожайности PSII.
    1. Включите PAM и начните запись кривой. Это значение называется 0.
    2. Включите измерительный свет и подождите около 30 с, чтобы кривая откликлась. Это значение называется F0.
    3. Дайте насыщенный пульс 4000 фотонов м-2 s -1 для 0,8 с от PAM.
    4. Получить наивысшее значение всплеска кривой с повышенной интенсивностью флуоресценции. Это значение называется FM.
    5. Рассчитайте максимальную квантовую доходность PSII в темноте (FV/FM),используя следующее уравнение.
      FV/FM (FM - F0) / FM
  3. Измерение фотосинтетического поведения в стабильном состоянии.
    1. Включите галогенную лампу в качестве внешнего источника света с измерительным светом после записи FM (см. 4.2.4). Во-первых, облучать образец листа с самым слабым светом (30 фотонов м-2 с-1).
    2. Включите спектральный радиометр в то же время, чтобы контролировать отражение листа.
    3. Подождите 20 минут или дольше, чтобы фотосинтетическая реакция достигла стабильного состояния в условиях света. Интенсивность флуоресценции устойчивого состояния называется Fs.
    4. Поставка насыщенного импульса с интервалом 1 мин во время освещения с актинийным светом. Максимальное значение флуоресценции, достигнутое при импульсном свете, называется FM.
    5. Запись данных FMна 20 минут после включения актиния света.
    6. Возьмите данные отражательного листа, усреднев 10 сканирований в оптимизированное время интеграции, с темным вычитанием тока.
  4. Расчет фотосинтетических параметров в стабильном состоянии.
    1. Рассчитайте квантовые урожаи фотохимии PSII ( PSII), которые можно оценить путем облучения насыщенными импульсами под актинийным светом, используя следующее уравнение.
      PSII (FM-- F S) / FM
    2. Оцените линейный поток электронов (LEF) из центра реакции PSII следующим образом: 4.
      LEF - Интенсивность излучения актиния света -PSII 0,5 и 0,84
    3. Рассчитайте NP, который может быть выражен теплового рассеивания, используя следующее уравнение.
      NP - (FM - FM) / FM
      ПРИМЕЧАНИЕ: Световая энергия в основном потребляется реакцией фотосинтеза. Однако, когда растения поглощают больше энергии света, чем энергия, потребляемая фотосинтезом, механизмы теплового рассеивания индуцируются, чтобы избежать избыточной энергии.
    4. Используя спектральные данные, полученные с помощью радиометра в тех же условиях освещения, вычислите коэффициент отражения листьев следующим образом.
      Коэффициент отражения - Rлист / Rстандарт
    5. Рассчитайте PRI от 531 нм и 570 нм следующим образом. Эти две длины волн извлекаются из соотношения отражения.
      ПРИ (R531-R570) / (R531R 570)
      ПРИМЕЧАНИЕ: R является отражением.
  5. Измерение релаксации кинетики нефотохимического закалки.
    1. Выключите актиний свет после приобретения Fs и лист отражения.
    2. Монитор хлорофилла флуоресценции PAM в течение 10 минут после выключения света.
    3. Обеспечить насыщенный пульс с интервалом в 1 мин во время темного расслабления. Максимальное значение флуоресценции, индуцированное пульсом насыщения под темным, называется FM. Получите десять FMв одном тесте.
    4. Сохраните данные FMна 2 мин и 10 минут после выключения актиния света.
    5. Включите актиний свет на множестве к следующей интенсивности облучения, 60 моль фотонов м-2 s -1.
    6. Повторите световую адаптацию в течение 20 мин и темное расслабление в течение 10 минут с пульсирующим насыщенным светом с интервалом в 1 мин. Запишите все данные, описанные выше. Повторите все шаги и измерения с помощью облучения на 120, 240, и 480 моль фотонов м-2 s -1.
  6. Расчет параметров нефотохимического закалки от релаксационной кинетики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Светозависимая индукция NP' смягчается, выключив источник света13. Можно фракционировать каждую функцию NP, регулируя временные шкалы релаксации.
    1. Оцените qE (энергозависимую утоление) фракцию с использованием FMq после 2-минутной темной адаптации.
      qE (FM2m-FMq) / FM
      ПРИМЕЧАНИЕ: фракция qE быстро меняется в течение 1-2 мин. Эта фракция включает в себя в основном протонацию PsbS и часть преобразования ксантофилла, которые зависят от свето-индуцированного зпХ через тилакоидную мембрану13. Оба являются обратимыми при разбивке градиента.
    2. Рассчитайте q q (зеаксантин зависимых закалки) фракция с помощью FM» после 10-минутной темной адаптации.
      q » (FM10m»--FMq) / FM
      ПРИМЕЧАНИЕ: Релаксация кинетика NP ' примерно на 10 минут после актиний света от отражает цикл xanthophyll14. Большая часть ксантофилла конверсии обращена вспять в более длительные сроки примерно 10 мин (кв) потому что преобразование требует VDE (альтоксанин де-эпоксидазы) ферментатической реакции. Фракция также смягчается при разбивке зпХ по всей тилакоидной мембране.
    3. Рассчитайте qI (фотокомингиторное состояние) следующим образом.
      qI (FM- FM10m) / FM
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самое медленное восстановление среди фракций NP, как полагают, фотоповреждения PSII (с указанием оборота D1). Эта доля фотокомбинторного состояния (qI), которое не восстанавливается на 10 мин15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлена схематическая схема экспериментального набора для одновременного измерения флуоресценции хлорофилла и отражения листьев. Волоконные зонды PAM и спектральный радиометр были установлены перпендикулярно поверхности листа на держателе листьев на заказной стадии образца, и галогенная лампа была использована для актинивного облучения света как с левого, так и с правого направления без литья Тени. Сигналы отражения ЛИСТЬЕВ PAM и листьев был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы получили дополнительные доказательства, чтобы показать, что PRI представляет пигменты ксантофила, одновременно измеряя флуоресценцию хлорофилла и отражательный лист.

Галогенный свет, который имеет длины волн, похожие на солнечный свет, был адаптирован для использования в качестве актинового источника света для активации фотосинтеза. Мы первоначально использовали белый источник светодиодного света, чтобы избежать теплового повреждения поверхности листа, но это привело к м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны доктору Куки Хикосаке (Университет Тохоку) за стимулирование дискуссий, помощь в работе и инструменты для экспериментов. Работа была частично поддержана KAKENHI (гранты 18K05592, 18J40098) и Naito Foundation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Галогенный источник светаOptoSigmaSHLA-150
Световой квантовый метрLI-CORLI-1000
PAM Хлорофилловый флуориметрWalzJUNIOR-PAM
PAM управляющее программное обеспечениеWalzWinControl-3.27
Стандарт отраженияLabsphere, Inc.SRT-99-050
Спектральный радиометрADS Inc.Field Spec3
Программное обеспечение для управления спектральным радиометромADS Inc.RS3

Ссылки

  1. Xue, J., Su, B. Significant remote sensing vegetation indices: A review of developments and applications. Journal of Sensors. 1353691, (2017).
  2. Cotrozzi, L., Townsend, P. A., Pellegrini, E., Nali, C., Couture, J. J. Reflectance spectroscopy: a novel approach to better understand and monitor the impact of air pollution on Mediterranean plants. Environmental Science and Pollution Research. 25 (9), 8249-8267 (2018).
  3. Han, L., Yang, G., Yang, H., Xu, B., Li, Z., Yang, X. Clustering Field-Based Maize Phenotyping of Plant-Height Growth and Canopy Spectral Dynamics Using a UAV Remote-Sensing Approach. Frontiers in Plant Science. 9, 1638(2018).
  4. Baker, N. R. Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In. Vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  5. Cruz, J. A., et al. Dynamic Environmental Photosynthetic Imaging Reveals Emergent Phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  6. Ruban, A. V. Quantifying the efficiency of photoprotection. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1730), 20160393(2017).
  7. Gamon, J. A., et al. Remote sensing of the xanthophyll cycle and chlorophyll fluorescence in sunflower leaves and canopies. Oecologia. 85 (1), 1-7 (1990).
  8. Gamon, J. A., Peñuelas, J., Field, C. B. A narrow-waveband spectral index that tracks diurnal changes in photosynthetic efficiency. Remote Sensing of Environment. 41 (1), 35-44 (1992).
  9. Rahimzadeh-Bajgiran, P., Munehiro, M., Omasa, K. Relationships between the photochemical reflectance index (PRI) and chlorophyll fluorescence parameters and plant pigment indices at different leaf growth stages. Photosynthesis Research. 113 (1-3), 261-271 (2012).
  10. Niyogi, K. K., Grossman, A. R., Björkman, O. Arabidopsis mutants define a central role for the xanthophyll cycle in the regulation of photosynthetic energy conversion. Plant Cell. 10 (7), 1121-1134 (1998).
  11. Kohzuma, K., Hikosaka, K. Physiological validation of photochemical reflectance index (PRI) as a photosynthetic parameter using Arabidopsis thaliana mutants. Biochemical and Biophysical Research Communications. 498, 52-57 (2018).
  12. Hikosaka, K., Noda, H. M. Modeling leaf CO2 assimilation and Photosystem II photochemistry from chlorophyll fluorescence and the photochemical reflectance index. Plant, Cell and Environment. 42 (2), 730-739 (2019).
  13. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), E2733-E2740 (2013).
  14. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  15. Davis, G. A., et al. Limitations to photosynthesis by proton motive force-induced photosystem II photodamage. Elife. 5, 16921(2016).
  16. Wong, C. Y. S., Gamon, J. A. The photochemical reflectance index provides an optical indicator of spring photosynthetic activation in evergreen conifers. New Phytologist. 206 (1), 196-208 (2015).
  17. Miyake, C., Amako, K., Shiraishi, N., Sugimoto, T. Acclimation of Tobacco Leaves to High Light Intensity Drives the Plastoquinone Oxidation System—Relationship Among the Fraction of Open PSII Centers, Non-Photochemical Quenching of Chl Fluorescence and the Maximum Quantum Yield of PSII in the Dark. Plant and Cell Physiology. 50 (4), 730-743 (2009).
  18. Munekage, Y., et al. Cyclic electron flow around photosystem I is essential for photosynthesis. Nature. 429 (6991), 579-582 (2004).
  19. Tubuxin, B., Rahimzadeh-Bajgiran, P., Ginnan, Y., Hosoi, F., Omasa, K. Estimating chlorophyll content and photochemical yield of photosystem II (ΦPSII) using solar-induced chlorophyll fluorescence measurements at different growing stages of attached leaves. Journal of Experimental Botany. 66 (18), 5595-5603 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Arabidopsis
Оценка фотосинтетического поведения путем одновременного измерения отражения листьев и анализа флуоресценции хлорофилла
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.