Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Краткое содержание

Здесь мы представляем автоматизированный метод пищеварения белка плазмы для количественного протеомического анализа на основе масс-спектрометрии. В этом протоколе, жидкости передачи и инкубации шаги для денатурации белка, сокращение, алкилирование, и трипсин пищеварения реакции упорядочены и автоматизированы. Подготовка 96-хорошей пластины с желаемой точностью занимает около пяти часов.

Аннотация

Подготовка образцов для анализа масс-спектрометрии в протеомике требует ферментативного расщепления белков в пептидную смесь. Этот процесс включает в себя многочисленные инкубационные и жидкие шаги передачи для достижения денатурации, сокращения, алкилирования и расщепления. Адаптация этого рабочего процесса к автоматизированной рабочей станции может повысить эффективность и уменьшить коэффициенты дисперсии, обеспечивая тем самым более надежные данные для статистических сопоставлений типов выборки. Ранее мы описали автоматизированный протеомный образец подготовки рабочего процесса¹. Здесь мы сообщаем о разработке более эффективного и лучше контролируемого рабочего процесса со следующими преимуществами: 1) количество шагов передачи жидкости уменьшается с девяти до шести за счет объединения реагентов; 2) Pipetting время уменьшается путем селективного кончика пипеттинг с помощью 96-позиционная трубающая головка с несколькими каналами; 3) Потенциальная пропускная стоимость увеличивается за счет наличия до 45 палубных позиций; 4) Полное ограждение системы обеспечивает повышение температуры и экологического контроля и снижает вероятность загрязнения образцов или реагентов; и 5) Добавление стабильных изотопов пептидов, а также белка з-галактозидазы к каждому образцу делает возможным мониторинг и контроль качества на протяжении всего процесса. Эти аппаратные и технологические усовершенствования обеспечивают хорошую воспроизводимость и повышают точность внутри-ассирования и межпромизации (CV менее 20%) для количественной оценки белка на основе LC-MS и пептида. Весь рабочий процесс для переваривания 96 образцов в 96-хорошо пластины может быть завершена примерно в 5 часов.

Введение

Массовая спектрометрия (MS) на основе белка и пептида количественной все чаще применяется в качестве биоаналитического инструмента для анализа плазмы в фундаментальных исследованиях и клинических лабораториях^2,3. Необходимые приборы и информатики быстро продвинулись, как MS стал метод выбора для количественной оценки белков или модифицированных белков, ориентируясь на конкретные пептидные последовательности из-за его способности количественно сотни пептидов в одном MS запустить⁴. Подготовка образцов служит основой для любого протеомического анализа. До анализа MS, белки в биологическом образце, как правило, денатурированные, уменьшенные, алкилированные, перевариваются в триптические пептиды, и опресненные⁵. Алкилирование блокирует цистеина для предотвращения неконтролируемых модификаций и обеспечения того, чтобы все цистеини имели одинаковую массу. Далее добавляется трипсин для переваривания белков в пептиды. Каждый из этих шагов требует оптимизации, и весь процесс традиционно выполняется вручную, что позволяет внедрять аналитические ошибки.

Традиционный конвейер разработки биомаркеров состоит из двух основных процессов: дробовик протеомики для глобального открытия белка для создания углубленного инвентаризации белка⁶ и целевой протеомики для проверки и проверки, направленной на высокоточность и высокой пропускной состав белка^{количественной}оценки 7 . Независимо от подхода MS, подготовка образца одинакова и сосредоточена на ферментативном расклеивании белков в пептидную смесь. По предложению Ван Эйк и Sobhani⁸, имея метод, который позволяет для точного, точного и воспроизводимого анализа для открытия и целевых анализов желательно эффективно переместить открытие биомаркеров для клинических анализов. Для этого будет полезна автоматизация подготовки образцов и возможность повышения эффективности анализа высокой пропускной способности. Ручные методы обычно вводят аналитические ошибки за пределами допустимых пределов, указанных Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в пересмотренном биоаналитическом методе валидирования Руководство, которое включает в себя биомаркеры и диагностики^2,9. Разработка быстрого, высокоточного и громкого ms protein образца подготовки рабочего процесса будет необходимо для облегчения исследования биомаркеров, который требует подготовки и анализа тысяч биологических образцов. MS sample preparation has many steps where errors can be introduced, and the process is tedious and time-consuming.

В нашем усовершенствованном методе была запрограммирована автоматизированная рабочая станция для выполнения всех необходимых процедур подготовки образцов плазмы в общей сложности 6 шагов(рисунок 1),чтобы обеспечить: 1) точные передачи жидкости; 2) реакция инициируется и останавливается в постоянное время; 3) реакция выполняется при контролируемой температуре (т.е. инкубаторе); и 4) реакция имеет равномерное смешивание для всех реакций. Мы также внедрили добавление экзогенных белков контроля качества и внутренних стандартов (стабильных изотопных пептидных стандартов), чтобы обеспечить качественную и воспроизводимую пропускную силу белка и пептида на основе LC-MS в формате 96 скважин. Включая подготовку реагента, часы работы и в общей сложности 1 000 000 шагов по трубации, потребуется для обработки 96 образцов в отдельных трубах. Автоматизация сокращает практическое время и количество вовлеченных взаимодействий между людьми.

Протокол

1. Программирование для автоматизированного обработчика жидкости

1. Создайте новый метод из меню файла(Файл Новый метод)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить шаги в заказе. Курсивный шрифт обозначает текст для ввода в программном обеспечении Biomek. Пожалуйста, свяжитесь с авторами для получения информации о методах и шаблонах pipetting.
2. Введите переменные шага запуска и их значения на начальном этапе, указанные в таблице 1.
3. Установите столбцы для селективного наконечника пипеттинг. Для шагов 1.3-1.7 щелкните шаг Set Global в панели инструментов под контролем Шагов и перетащите его к методу.
   1. Используя шаг Set Global, установите значение «FirstColumn» для переменных FirstColumn_Global,значение «LastColumn» для переменных LastColumn_Global,значение «LastColumn-FirstColumn» 1 для переменных столбцов,и значение «столбцы»8 к переменным Уэллсам.
   2. Выберите шаг скрипта в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Введите сценарий VB, указанный на рисунке 2.
4. Установка томов для смесей Set Global и решений.
   1. Используя шаг Set Global, установите соответствующие значения переменным объема, как показано в таблице 2.
   2. Нажмите на шаг If в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. В условиях введите Autosampler.
   3. Затемщелкните шаг Set Global в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод.
   4. Используя шаг Set Global, установите значение :(MobilePhase»Колонки)No10 к переменной MobilePhaseWell.
   5. Под Else щелкните шаг Set Global в панели инструментов под контрольные шаги и перетащите его в метод.
   6. Используя шаг Set Global, установите значение No0 к переменной MobilePhaseWell
5. Настройка управляемой лабораторной установки (GLS)
   1. Нажмите на шаг редактора палубы в панели инструментов под Утилиты. Создайте новую колоду, чтобы соответствовать макету палубы на рисунке 3 и пометьте ее как палубу 1.
   2. Нажмите на шаг настройки guided в панели инструментов под настройкой и устройствами и перетащите его к методу. Перетащите и падение labware типов в палубе позиции, как указано в таблице 3. После этого заполните вкладки в таблице, как показано в таблице 3 и рисунке 4 (Настройка управляемой настройки).
6. Настройка процедуры подсчета чаевых
   1. Нажмите шаг процедуры определения в панели инструментов под контрольные шаги и перетащите его в метод. Процедура имен как TipCount.
   2. Нажмите на шаг сценария в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Введите сценарий VB, указанный на рисунке 5 (Скрипт подсчета чаевых).
   3. Нажмите на шаг If в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод.
   4. В условиях типа TL5 и 0.
   5. Под Затем,нажмите шаг Move Labware в панели инструментов под настройкой и устройства шаги и перетащите его к методу. Перемещение лабораторной посуды с TL5 на TR3. Нажмите шаг Move Labware в панели инструментов, под настройкой и настройкой и шагами устройства и перетащите его в метод. Перемещение лабораторной посуды из TL2 в TL5. Наконец, нажмите на шаг Move Labware в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите его в метод. Перемещение лабораторной посуды с BC90 в TL2.
7. Определение процедуры инкубатора
   1. Нажмите шаг процедуры определения в панели инструментов под контрольные шаги и перетащите его в метод. Процедура названия как инкубатор.
   2. Введите HalfTime как переменное имя и 1800 как значение по умолчанию.
   3. Введите NextTemp как переменное имя и 22 как значение по умолчанию.
   4. Введите температуру как переменное имя и 60 как значение по умолчанию.
   5. Нажмите на шаг Enhanced Move Labware в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите его в метод. Перемещение лабораторной посуды с P11 на INHECO1.
   6. Нажмите шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шаги и перетащите его в метод. Процедура имен как TipCount.
   7. Нажмите на шаг inheco Incuba Incubate in the toolbar под интеграцией и перетащите ее к методу. Введите INHECO1 для использования устройства в положении, «Половина времени для инкубации для, «Температура для КК» и 3 для кв.с. целевой температуры. Выберите Shake при инкубации вариант и Orbital (по часовой стрелке)встряхнуть стиль. Для настроек введите 1,00 мм из стороны в сторону, 6,6 раза в секунду, 1,00 мм вперед и 6,6 раза в секунду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что inHECO Инкубатор программное обеспечение установлено.
   8. Нажмите на шаг inheco Incuba Incubate in the toolbar под интеграцией и перетащите ее к методу. Введите INHECO1 для использования устройства в положении, «Половина времени для инкубации для, «Температура для КК» и 3 для кв.с. целевой температуры. Выберите Shake при инкубации вариант и Orbital (против часовой стрелки)встряхнуть стиль. Для настроек введите 1,00 мм из стороны в сторону, 6,6 раза в секунду, 1,00 мм вперед и назад в 6,6 раза в секунду.
   9. Нажмите шаг паузы в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите ее в метод. Приостановите всю систему на 1 с.
   10. Нажмите шаг процедуры определения в панели инструментов под контрольные шаги и перетащите его в метод. Процедура названия как инкубатор.
   11. Нажмите на шаг inheco Incuba Incubate in the toolbar под интеграцией и перетащите ее к методу. Введите INHECO1 для использования устройства в положении, 1 для инкубации для, «NextTemp для КК и 3 для КС целевой температуры.
8. Определение процедуры для Orbital.
   1. Нажмите на шаг Enhanced Move Labware в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите его в метод. Перемещение лабораторной посуды с P11 на Orbital1.
   2. Нажмите шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шаги и перетащите его в метод. Выберите процедуру TipCount.
   3. Нажмите на шаг действий устройства в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите его в метод. Выберите устройство OritalShaker0, Команда TimedShake. Введите Скорость встряхивания 1000, Время для достижения полной скорости 2, Время, чтобы встряхнуть 30.
   4. Нажмите на шаг Enhanced Move Labware в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите его в метод. Перемещение labware Orbital1 на P11.
9. Настройка первого микса
   1. Нажмите шаг Select Tip в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его к методу. Выберите изменить положение TL4.
   2. Нажмите на шаг inheco Incuba Incubate in the toolbar под интеграцией и перетащите ее к методу. Введите INHECO1 для использования устройства в положении, 1 для инкубации для, 60 для КС и 3 для КС целевой температуры.
   3. Нажмите на шаг loop в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод, в пределах выберите шаг Совет. Введите col как переменный «FirstColumn как старт», «LastColumn как конец» и 1 как приращение.
   4. Нажмите Найдите шаг наведения на кнопку «Подсказки по выбору» select Tips Steps в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод в пределах этапа цикла. Выберите СОВЕТы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Советы Расположение из выпадающего меню. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в 1.
   5. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в пределах этапа цикла. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем «FirstMix,Аспират» в столбце 1 и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
   6. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в пределах этапа цикла. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем «FirstMix»,распределяйте сьюют в столбце «Кол» и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
   7. Нажмите на шаг выгрузки Select Tips в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в пределах этапа цикла. Выберите советы по разгрузке для TR1.
10. Настройка образцов
    1. Нажмите на шаг If в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Тип SamplePlate как условие.
    2. Затемщелкните Select Tips Наводите шаг в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его к методу. Выберите СОВЕТы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Советы Расположение из выпадающего меню. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в колонках .
    3. Нажмите Выберите Советы Аспират шаг в панели инструментов под жидким и перетащите его в метод, в течение этого. Выберите позицию типа и образца образцов Greiner96RoundPS. Введите объем :Образец,Аспират на столбце «Первая Колонна» и строка 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    4. Нажмите На шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в течение этого времени. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция плиты реакции. Введите объем «Образец»,распределите сьюет по столбце и FirstColumn и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    5. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидкими шагов обработки и перетащите его в метод, в течение этого. Выберите советы по разгрузке для TR1.
    6. После окончания шага If щелкните шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Выберите процедуру Инкубатор. Введите HalfTime как переменное имя и 1800 как значение по умолчанию. Введите NextTemp как переменное имя и 22 как значение по умолчанию. Введите температуру как переменное имя и 60 как значение по умолчанию.
11. Настройка блока цистеина
    1. Нажмите шаг петли в панели инструментов под контролем шаги и перетащите его в метод, в пределах Выберите отзыв шаг. Введите col как переменный «FirstColumn как старт», «LastColumn как конец» и 1 как приращение.
    2. Под петлей,нажмите Выберите Советы Загрузка Советы шаг в панели инструментов под жидким и перетащите его в метод. Выберите СОВЕТы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Советы Расположение из выпадающего меню. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в 1.
    3. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите ее в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем cysteineMix,аспирировать в столбце 2 и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    4. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция плиты реакции. Введите объем - CysteineMix, распределитесь по столбцоку и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    5. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидкими шагов обработки и перетащите его в метод, в течение этого. Выберите советы по разгрузке для TR1.
    6. После окончания цикла If щелкните шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Выберите процедуру Инкубатор. Введите HalfTime как переменное имя и 300 как значение по умолчанию. Введите NextTemp как переменное имя и 43 как значение по умолчанию. Введите температуру как переменное имя и 25 как значение по умолчанию.
12. Настройка второго микса
    1. Нажмите шаг петли в панели инструментов под контролем шаги и перетащите его в метод, в пределах Выберите отзыв шаг. Введите col как переменный «FirstColumn как старт», «LastColumn как конец» и 1 как приращение.
    2. Под циклом щелкните Select Tips Наводите шаг в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод. Выберите СОВЕТы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Советы Расположение из выпадающего меню. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в 1.
    3. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите ее в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем «SecondMix, Аспиратвия в столбце 3 и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    4. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция плиты реакции. Введите объем - SecondMix, Распределитель в столбце и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    5. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидкими шагов обработки и перетащите его в метод, в течение этого. Выберите советы по разгрузке для TR1.
    6. После окончания цикла If нажмите шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Выберите процедуру Orbital.
    7. Нажмите шаг паузы в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите ее в метод. Приостановите всю систему на 1 с.
13. Настройка дополнения Trypsin
    1. Нажмите шаг петли в панели инструментов под контролем шаги и перетащите его в метод, в пределах Выберите отзыв шаг. Введите col как переменный «FirstColumn как старт», «LastColumn как конец» и 1 как приращение.
    2. Под петлей,нажмите Выберите Советы Загрузка Советы шаг в панели инструментов под жидким и перетащите его в метод. Выберите советы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Из меню drop-down. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в 1.
    3. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите ее в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем :Trypsin, Аспират в столбце 4 и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    4. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция плиты реакции. Введите объем :Trypsin, Распределитена на столбеце и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    5. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидкими шагов обработки и перетащите его в метод, в течение этого. Выберите советы по разгрузке для TR1.
    6. После окончания цикла If щелкните шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Выберите процедуру Инкубатор. Введите HalfTime как переменное имя и 3600 как значение по умолчанию. Введите NextTemp как переменное имя и 25 как значение по умолчанию. Введите температуру как переменное имя и 43 как значение по умолчанию.
    7. Нажмите на шаг inheco Incuba Incubate in the toolbar под интеграцией и перетащите ее к методу. Убедитесь, что программное обеспечение INHECO Инкубатор установлен. Введите INHECO1 для использования устройства в положении, 1 для инкубации для, 25 для КК и 5 для КС целевой температуры.
14. Настройка закалки
    1. Нажмите на шаг loop в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод, в пределах выберите шаг Совет. Введите col как переменный «FirstColumn как старт», «LastColumn как конец» и 1 как приращение.
    2. Под петлей,нажмите Выберите Советы Загрузка Советы шаг в панели инструментов под жидким и перетащите его в метод. Выберите СОВЕТы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Советы Расположение из выпадающего меню. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в 1.
    3. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите ее в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем «Утолить»,Аспиратируй в столбце 5 и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    4. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция плиты реакции. Введите объем «Утоление»,распределитесь по столбцоку и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    5. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидкими шагов обработки и перетащите его в метод, в течение Затем. Выберите советы по разгрузке для TR1.
    6. После окончания цикла If нажмите шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Выберите процедуру Orbital.
    7. Нажмите шаг паузы в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите ее в метод. Приостановите всю систему на 1 с.
    8. Нажмите шаг паузы в панели инструментов под настройкой и шагами устройства и перетащите ее в метод. Выберите Пауза всей системы и отобразить это сообщение. Введите сообщение "Продолжить после центрифугации".
15. Настройка пластины для автосэмпера
    1. Нажмите на шаг If в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод, в пределах шага Выберите Совет. Тип Автосэмпера как условие.
    2. Затемщелкните шаг петли в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его к методу. Введите col как переменный «FirstColumn как старт», «LastColumn как конец» и 1 как приращение.
    3. Под петлей,нажмите Выберите Советы Загрузка Советы шаг в панели инструментов под жидким и перетащите его в метод. Выберите СОВЕТы BC230, местоположение TL6 и резервное копирование TL2 Советы Расположение из выпадающего меню. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в 1.
    4. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите ее в метод, в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция пластины реагента. Введите объем :MobilePhase, Аспират в столбце 6 и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    5. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в цикле. Выберите Bio_RadPCR96 тип лабостеров и позицию плиты Autosampler. Введите объем :MobilePhase, Распределитель на столбеце и строке 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    6. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидкими шагов обработки и перетащите его в метод, в течение Затем. Выберите советы по разгрузке для TR1.
    7. После окончания цикла If щелкните шаг процедуры выполнения в панели инструментов под контролем шагов и перетащите его в метод. Выберите процедуру TipCount.
    8. Нажмите На кнопку Select Tips Load Tips шаг в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его к методу. Выберите советы BC90, местоположение TL5 и резервное копирование TL2 Из меню drop-down. Выберите одиночную колонку (ы) и введите в колонках .
    9. Нажмите на шаг Select Tips Aspirate в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите ее к методу в цикле. Выберите BCDeep96Round Labware Тип и позиция плиты реакции. Введите объем «DigestTransfer»,Аспир на столбце «первая колонна» и строка 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    10. Нажмите на шаг выберите советы диспенса в панели инструментов под шагов по обработке жидкости и перетащите его в метод, в цикле. Выберите Bio_RadPCR96 тип лабостеров и позицию плиты Autosampler. Введите объем :MobilePhase, Распределитель на столбце «Первая Колонна» и строка 1. Выберите оптимизированную технику из меню выпадения техники.
    11. Нажмите Выберите Советы Выгрузить шаг в панели инструментов под жидким и перетащите его в метод в течение Затем. Выберите советы по разгрузке для TR1. Выбрать советы шаг заканчивается здесь.
    12. Сохранить и назвать метод.

2. Подготовка образца, лабораторного посуды и реагентов

1. Передача 5 Зл объединенной здоровой плазмы человека в полипропилен, 96-круглый Deep Well Plate.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для реагентов и материалов, используемых в этом протоколе. TPCK Лечение трипсин был приобретен и трипсин субстрата соотношение и время инкубации была оптимизирована специально. Если используется другой сорт трипсина, например, рекомбинантный трипсин по последовательности, необходимо протестировать и оптимизировать фермент субстрата и время инкубации.

3. Операционная процедура

1. Дважды нажмите значок программного обеспечения.
2. Под вкладкой Метод выберите Home All Axes, чтобы сориентироваться и подготовить автоматизированный обработчик жидкости. Убедитесь, что все рабочие шприцы не содержат видимых пузырьков воздуха.
3. Под файлом, выберите Открытый Метод.
4. Выберите метод(рисунок 6).
5. Начните метод, нажав на значок Run в форме зеленого треугольника.
6. Чтобы иметь autosampler пластины подготовлены в конце метода, введите значение "правда" в введите значение для использования для "Автосэмпемер" запрос, а затем нажмите OK. Если табличка autosampler не готовится, введите значение 'ложный', а затем нажмите OK.
7. Введите значение '1' в значении Enter, чтобы использовать для запроса 'firstcolumn', а затем нажмите OK.
8. Введите значение '12' в значение Enter, чтобы использовать для запроса 'lastcolumn', а затем нажмите OK.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг и шаг 4.7 сказать рабочей станции для выполнения пищеварения на 12 столбцов 96-ну хорошо пластины, в результате чего все колодцы пластины используются для пищеварения
9. Если пример пластины используется с объемом выборки, по крайней мере 20 зл,введите значение "правда" в Введите значение для использования для 'SamplePlate' запрос, а затем нажмите OK. Если пример пластины не используется, введите значение "ложный", а затем нажмите OK.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец пластины не используется, добавить 5 зл и выбываемого образца к каждой соответствующей скважине реакционной пластины.
10. Следуйте указаниям в окно настройки Guided Labware и нажмите Продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее окно описывает макет для "Реагент плиты", которая будет подготовлена(Рисунок 7, Дополнительная таблица 1). Следующие тома будут отожелены в каждой из 8 скважин одной колонны в 1 мл Deep Round 96-коловидной пластины:
    Колонка 1: 540 л реакции Mix 1.
    Колонка 2: 50 л цистеиного блока.
    Колонка 3: 730 л реакции Mix 2.
    Колонка 4: 130 л трипсина.
    Колонка 5: 130 л раствора утоления.
    Колонка 5: 1090 Л мобильного фазового решения (Если пользователь вошел в "истинное" в шаге 6).
11. Нажмите Далее, и в следующем окне описывается минимальный объем (20 л), который необходимо процитировать в пластине Sample. Если пользователь ввел значение "ложный" для запроса, связанного с sample Plate (шаг 9), пользователю будет предложено добавить образец 5 Л л в Reaction Plate.
12. Нажмите далее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее окно показывает, что пустой 90 л наконечник поле должно быть помещено на автоматизированной палубе обработчик жидкости.
13. Нажмите Далее еще раз, выкладывая палубу автоматизированного жидких обработчика, как указано и проиллюстрировано(Рисунок 8)в том числе реагент плиты, Реакция плиты, образец плиты, Autosampler плиты, 6 полный 90 Л. наконечник коробки, пустой 90 л наконечник поле, и полный 230 л кончик поле.
14. Нажмите Закончить, чтобы начать метод.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После нажатия Finishпользователь не может попасть в автоматизированный обработчик жидкости. Это позволит "сломать световой занавес" машины и остановить жидкий обработчик в качестве меры предосторожности.
15. На Продолжить после центрифугации подсказку, получить реакционную плиту и центрифуги его в течение 30 минут при 3000 об/мин.
16. После того, как центрифугация завершена, верните плиту реакции к автоматизированному жидком обработчику в положение, в котором она находилась до центрифугации, и нажмите Продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный обработчик жидкости снова остановится, когда метод будет завершен. Если пользователь ввел "истинное" для шага 6, то плита Autosampler может быть удалена с рабочей станции и помещена в автосэмпемер жидкого хроматографического инструмента для анализа.

4. LC-MSMS

1. Разрешить пептиды на высоком потоке HPLC, состоящий из C18 2,1 мм х 100 мм, 3,5 мкм колонки с скоростью потока 0,25 мл / мин и проанализированы вставка на тройной четырехполюсный масс-спектрометр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После переваривания пептида, целевой метод LC-MSMS для количественной оценки пептидов из роботизированных подготовленных образцов подробно описан¹ после краткого описания LC-MSMS.
2. Установите температуру в духовке колонки до 40 градусов по Цельсию. В качестве двух передвижных фаз используйте буфер А (2% ACN, 98% воды, 0,1% для противокислоты) и буфер B (95% ACN, 5% воды, 0,1% для метакислоты).
3. Равновесие столбца с 5% B в течение 5 минут после загрузки. Выясните пептиды в течение 30 минут с линейным 5% до 35% градиент буфера B.
   1. Утилизировать столбец перед загрузкой следующего образца, смыв с 98% B в течение 10 минут, а затем 5% B в течение 5 минут.
   2. Для он-лайн утечки, отвлечь пост-колонки eluent отходов, прежде чем он вошел в источник иона с помощью двухфазного коммутационного клапана.
4. Обработайте данные MRM.

Результаты

Автоматизированный протеомики образец подготовки рабочего процесса на автоматизированной рабочей станции был адаптирован из нашего предыдущего автоматизированного протокола с надежным методом приобретения LC-SRM-MS¹ для альбумина, выбранного белка плазмы, и q-galactosidase (я-гал), экзогенный белок, используемый для контроля качества. После обработки, образцы были запущены на тройной четырехполюс LC-MS в SRM-обзор ориентации сыворотки альбумин, к-galactosidase. Коэффициент вариации (CV) сигнала SRM для каждого перехода использовался для мониторинга воспроизводимости автоматизированного протокола пищеварения.

Мы автоматизировали добавление реагента и смешивания шагов для переваривания 5 образцов плазмы с 2-часовой трипсин-инкубации на палубе. Для определения воспроизводимости 5 зЛ плазменного бассейна были впиканы в несколько колодцев реакционной пластины с многоканальной головкой (96 шт.). Чтобы следить за консистенцией, мы добавили белок q-gal перед снижением и алкилацией реакций. Автоматизированный рабочий процесс подготовки протеомики был протестирован с помощью надежного метода приобретения LC-SRM-MS, включая альбумин, белок плазмы с высоким изобилием и белок, используемый для контроля качества. Три пептида и два пептида альбумина были проверены из обработанных белков плазмы альбумина и шипами белка -гал (Таблица 4).

В попытке сэкономить время и упростить процедуру, мы сократили шаги передачи жидкости добавления/смешивания/инкубации реагента и реакционной смеси с рабочей станцией с девятиступенчатого рабочего процесса на шестиступенчатый рабочий процесс (рисунок 1). Общий протеомный рабочий процесс состоял из двух экспериментальных компонентов: автоматизированная подготовка образца и LC-MS/MS. Во-первых, мы оценивали точность получения данных LC-MS/MS SRM на восемь последовательных инъекций из одного и того же колодца из пластины автосэмпера. Точность автоматизированного рабочего процесса подготовки выборки была рассчитана по проценту коэффициента дисперсии (%CV) от общего протеомического рабочего процесса SRM минус%CV LC-MS/MS(рисунок 9B). При обтекаемой процедуре пищеварения плазмы на автоматизированной рабочей станции, экспериментальная точность автоматизированной подготовки образцов была менее 11,4% для экзогенных протеинов с шипами (10,0% в среднем), и менее 14,9% для наиболее обильного человеческого альбумина сыворотки (9,9% в среднем)(рисунок 9). Хорошая интенсивность сигнала наблюдалась как для человеческого сывороточного альбумина, так и для белков, как ожидалось(рисунок 9C).

Для каждого шага по передаче трубиков и жидкости были специально оптимизированы методы. Для контроля точности жидких переносных шагов, мы шипами стабильные изотоп-маркированные (SIL) пептидные стандарты для эндогенного человеческого белка сыворотки альбумина и экзогенного белка в трех независимых шагов реагента передачи: Реакция Mix 1, Cysteine Блокатор, и реакция Mix 2 (Рисунок 10). MRM сигналы из этих пяти пептидов SIL были приобретены для мониторинга точности автоматизированных шагов передачи жидкости. Среднее %CV для пептидов, ДДНПНЛПРПрА, и GDF-FNISR ( представляет N15 помечены аминокислоты) от реакции Mix 1 шаг варьировался от 1,8% до 11,2%. Среднее %CV одного пептида (IDPNAWVER) от шага Cysteine Blocker колебалось от 6,6 до 8,8%. Средний %CV двух пептидов (WVGYG-DSR и LVNEVTEFAK) варьировался от 6,2% до 11,9%(рисунок 10).

Для проверки автоматизированного рабочего процесса подготовки образца протеомики мы оценили воспроизводимость через несколько белков и несколько дней для альбумина сыворотки человека, экзогенного и 40 дополнительных белков плазмы. Мы обработали 21 репликат образцов (объединенные нормальной плазмы человека), хорошо расположение показано на рисунке 11А, в три разных дня. Внутридневное резюме было рассчитано из 21 скважины, подготовленных в тот же день. Средний внутридневный %-cVs для 40 белков варьировался от 4% до 20%(рисунок 11B). Для оценки эффекта края автоматизированного рабочего процесса на основе пластины% было рассчитано из определенных скважин в пределах обозначенных столбцов и строк(рисунок 12А для карты столбцов и строк). Интенсивность сигналов MRM была одинаковой во всех конфигурациях столбцов и строк с %CV в диапазоне от 3% до 22%(рисунок 12B).

Таким образом, оптимизированный автоматизированный рабочий процесс дает 96 равномерно обработанных образцов менее чем за пять часов с отличной экспериментальной точностью. Для совместимости с автоматизированным рабочим процессом мы отобрали реагенты, которые имеют незначительные неспецифические побочные реакции, стабильны в освещении окружающей среды, являются дружественными LC-MS/MS и могут храниться в виде замороженных aliquots.

Рисунок 1: Схема рабочего процесса подготовки образца. Перечислены основные 6 шагов по передаче жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Совет загрузки скрипта. Подробности сценария VB приведены здесь. Скрипт определяет условия загрузки наконечников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Автоматизированная рабочая станция палубе макет. Палуба состоит из 1x1 ALPs, Tip Загрузка ALPs, Корзина, Совет мыть, Пелтиер и инкубатор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Свойства пластины реагента. Показаны свойства, необходимые для лабораторной программы Reagent Plate при доступе с помощью управляемой установки Labware. Выберите соответствующий столбец и введите переменные, указанные в рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Скрипт подсчета наконечников. Этот скрипт помогает отслеживать количество советов на палубе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Обзор метода переваривания и алицитирования образцов плазмы. Шаги для расчетов реагентов, настройки лабораторного программного обеспечения и жидкостных манипуляций в методе обработчика жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Укладка пластины реагента. Показаны химические реагенты, необходимые для пищеварения плазмы и аутопробера подготовки и распределены по labware пластины реагента. Эта цифра была изменена из технической записки¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 8: Укладка для лабораторного посуды на палубе автоматизированной рабочей станции. Показана компоновка палубы для метода пищеварения плазмы для обработчика жидкости. Эта цифра была изменена из технической записки¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 9: Точность общего протеомического рабочего процесса состоит из резюме рабочей станции и целевого LC MS/MS CV.
Пять пептидов из з-гал и альбумина были проверены, хроматограммы и время удержания пептида для каждого пептида показано (A), Точность была определена из 30 скважин / образцов обработки репрезентативный эксперимент, CVs% для общего протеомического рабочего процесса, LC MS / MS анализа и автоматизированной обработки образцов были рассчитаны (B). В целом, переваренные пептиды показали хорошие сигналы в диапазоне от 1x10⁵ до 1x10⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 10: Определение точности для шагов передачи жидкости. Синтетические пептиды были шипами в шаг конкретных реагентов, и автоматизированная передача жидкости была определена total%CV. Из 30 скважин/образцов экспериментируют минус% CV LC MSMS (определяется 8 повторными инъекциями LC MSMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 11: Многодневное воспроизводимость автоматизированного рабочего процесса подготовки протеомического образца с 42 анализом протеинового МРМ. (A) Реакция пластины карта для каждого из трех дней показано здесь, 5 плазмы л был добавлен в каждой из 21 скважин. 3 скважины, полученные 5 ul воды были использованы в качестве отрицательного / пустой контроля. (B) Средняя интенсивность 190 переходов, состоящих из 75 пептидов и 42 белков (слева) и%CV для каждого перехода MRM была рассчитана из 21 скважины пищеварения на каждый день (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 12: Воспроизводимость конкретных мест расположения скважин (положение колонн и рядов). (A) Здесь показаны столбцы и строки с картой пластин. (B) Колонка и расположение строки конкретных сигналов MRM средней интенсивности от указанных скважин (слева) и cv% (справа) от одной пластины пищеварения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 13: Скриншот редактора техники. Для каждого шаблона Pipetting определите свойства зондирования уровня жидкости, обнаружения сгустка, пирсинга, жидкого типа, общего, аспирата, дозирования, смешивания и калибровки. Шаблон и методы, используемые в этом протоколе, показаны в дополнительной таблице 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Переменной	Переменной	Значение	Описание
Автосамплер	Логических	Истинный	Использование автосэмпера
Бетагал	Целое число	5	Бетагальный том
BG1	Целое число	0.8	Объем BG1
BG2	Целое число	0.8	Объем BG2
BG3	Целое число	0.8	Объем BG3
ЦистейнБлокер	Целое число	1.25	Объем блокатора цистеина
ЦистейнБуфер	Целое число	0.45	Объем буфера цистеина
Денатурант	Целое число	5	Denaturant том
ДайджестТрансфер	Целое число	10	Объем передачи дайджеста
Первый буфер	Целое число	25.9	Первый объем буфера
Первая колонка	Целое число	1	Первая колонка
HSA1	Целое число	0.8	Объем HSA1
HSA2	Целое число	0.8	Объем HSA2
lastcolumn	Целое число	12	Последняя колонка
MobilePhase	Целое число	90	Объем мобильной фазы
Утолить	Целое число	10	Утоленная колонка
Редуктагент	Целое число	5	Уменьшение столбца агента
Образец	Целое число	5	Колонка примеров
ОбразецПлита	Логических	Истинный	Использование образца пластины
Второйбуфер	Целое число	58.4	Второй объем буфера
Трипсин	Целое число	10	Столбец трипсин

Таблица 1: Переменные шага запуска

Значение	Переменной
«Первый буфер»Денатурант, РедукцияАгент»Бетагал»BG1»HSA1	FirstMix
«ЦистейнБлокер»ЦистеинБуфер»BG2	CysteineMix
«Второй буфер»BG3»HSA2	SecondMix
(FirstMix-Колонки)	FirstMixWell
- (CysteineMix-Колонки)	CysteineWell
(SecondMix-Колонки))	SecondMixWell
(Трипсина-колонны)	ТрипсинВелл
(Утоления)	Уточвелл
(FirstMixWell)100	FirstMixStock
«ЦистейнВелл» 8 х 20	CysteineMixStock
(SecondMixWell)100	SecondMixStock

Таблица 2: Переменные объемной смеси

Тип	Имя	Позиции	Глубина	Вариантов размещения	Использовать?
BCDeep96Round	Реагентная плита	P5	1 (вверху)	#	Не Образная плита
BCDeep96Round	Реагентная плита	P5	1 (вверху)	#	«Образецплита»
BCDeep96Round	Реакционная плита	P11	1 (вверху)		Истинный
Bio_RadPCR96	Образцы	P9	1 (вверху)		«Образецплита»
Bio_RadPCR96	Автосэмпера плиты	P10	1 (вверху)		Автосэмпемер
BC90	Пустой		1 (вверху)		Истинный
BC90			1 (вверху)		Истинный
BC90			1 (вверху)		Истинный
BC230			1 (вверху)		Автосэмпемер
BC90			1 (вверху)		«Колоноки»-gt;1
BC90			1 (вверху)		«Колономы»gt;3
BC90			1 (вверху)		«Колономы»gt;5
BC90			1 (вверху)		«Колономы»gt;7
BC90			1 (вверху)		«Колономы»gt;9
Примечание: Вопрос: Соответствует 96 хорошо Bio-Rad пластины. В: Нажмите свойства, а затем введите переменные объема, указанные на рисунке 6.

Таблица 3: Настройка управляемой установки

Белок ID	Пептидная последовательность	No 1 Масса (Da)	No 3 Масса (Da)	Время (мин)	Фрагмент Ион	Потенциал декластеризации	Энергия столкновения	Потенциал выхода из ячейки столкновения
спе P00722 BGAL_ELOCI	ГДФНИЗР	542.3	262.1	19.7	No2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	No2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	No2y6	61	25	18
	ИПЛНАВВер	550.3	436.1	18.1	No2y7-2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	No2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	No2y6	61	33	8
	ВВГКЗЗСР	534.3	782.1	12.1	No2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	No2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	No2y4	90	25	8
спе P02768 ALBU_HUMAN	ДДНПНЛПРОЛ	470.8	596.2	9.2	No2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	No2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	No2y6	61	27	18
	ЛВНЕВТЕФАК	575.3	694.4	18.2	No2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	No2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	No2y7	73.1	29.6	18

Таблица 4: Параметры MRM

Дополнительная таблица 1: Реагент пластины Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Шаблон протокола Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Обработка образцов для массовой спектрометрии требует денатурации белка, сокращения и алкилирования, чтобы блокировать цистеины, и пищеварение трипсина, чтобы расщеплять белки в пептиды. Каждая химическая или ферментативная реакция должна быть инициирована в назначенное время и выполнена при контролируемой температуре, и каждый шаг в этом процессе включает в себя несколько шагов передачи жидкости, где экспериментальные изменения могут быть введены. Автоматизированная обработка образцов обеспечивает решение этой дилеммы. В настоящее время доступные системы обработки жидкостей имеют возможность передавать реагенты в 96-колодцы пластины с точностью и точностью менее 5%, в зависимости от головы и наконечника типа используется, и инкубировать образцы, с тряской при желании, при контролируемых температурах, начиная от 14 градусов по Цельсию до 70 градусов по Цельсию. Мы использовали автоматизированный обработчик жидкости для обработки плазмы для SRM-анализов в формате 96 скважин.

Есть много тысяч протеазы расщепления сайтов в сложных смесях белков в сыворотке крови, плазме и других биологических образцов; и каждый из этих белков обладает уникальными свойствами, влияющими на доступность участка расщепления и стабильность полученных пептидов. Поэтому невозможно разработать процедуру обработки образцов, оптимальную для каждого белка. Лучшая альтернатива заключается в том, чтобы быть как можно более последовательным.

Для обеспечения согласованности мы оптимизировали каждый этап трубации, выполняемый автоматизированным обработчиком жидкости. Сначала мы рассмотрели требуемый объем и ограничения, налагаемые типом жидкости (плазма, aqueous, или органические) и соответствующие свойства (вязкость, сплоченность и волатильность), оборудование (рабочая станция трубач-головки и пластины захвата оружия), и labware. Затем мы изменили скорость и задний разрыв воздуха для устремления, скорость и громкость выдува для дозирования, а также силу и продолжительность смешивания, в то время как включение наконечник акосновения после устремления и / или дозирования, если это необходимо, для устранения жидкости придерживаясь за пределами советы (Рисунок 13, Дополнительная таблица 1). Уникальный пептид SIL, предварительно проверенный на стабильность, был проложен в каждый реагент, чтобы можно было контролировать точность каждого шага обработки жидкости. После оптимизации, процесс резюме для большинства переходов были менее 10%, демонстрируя хорошую воспроизводимость с автоматизированной рабочей станции(Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11 и Рисунок 12).

Представленный здесь автоматизированный рабочий процесс обеспечивает последовательное ферментативное пищеварение с улучшенной воспроизводимостью и пропускной связью по сравнению с ручными методами(рисунок 9, рисунок 10). Такой подход обещает повысить точность и надежность обнаружения и проверки биомаркеров масс-спектрометрией.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Объединенная здоровая человеческая плазма	биорекультивации Inc.		В плазме крови человека были протестированы в манускрипте
Ацетонитрил, ВЭЖХ Grade	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	растворителем LC MS/MS
B-ГАЛАКТОЗИДАЗА рекомбинант	экзогенных контрольных белков	Sigma-Aldrich	G3153-5MG
Автоматизированная рабочая станция Biomek i7	Beckman Coulter, Inc.		Протеомная рабочая станция для подготовки образцов: автоматизированные рабочие станции Biomek не предназначены и не валидированы для использования в диагностике заболеваний или других состояний
Biomek i-Series Tips 230µ L Нестерильная	компания Beckman Coulter, Inc.	B85903	Насадки, расходники i7
Советы Biomek i-Series 90&микро; L Нестерильная	компания Beckman Coulter, Inc.	B85881	Насадки, расходники i7
FG, Kit Trypsin TPCK	Sciex	4445250	Трипсин, используемый в
разложении Hard-Shell 96-Well PCR Plates, низкопрофильные, тонкостенные, с юбкой, зеленые/прозрачные	Bio-Rad	#hsp9641	Пластина автосамплера
Octyl B-D-Glucopyranoside	Sigma-Aldrich	O9882-5G	моющее средство, используемое при сбраживании
Полипропилен, 96-круглые глубоколуночные пластины Sterile	Beckman Coulter, Inc.	267007	Реагент и метантенковая пластина
Prominence UFLCXR HPLC система	Shimadzu, Япония		Высокопоточная система LC
QTRAP 6500	SCIEX		Масс-спектрометр
Вода, ВЭЖХ Grade	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS растворитель
Xbridge BEH30 C18 2,1 мм x 100 мм	Вода	186003564	колонка LC MSMS