Методическая статья

Индуцирование и характеристика везикулярного стеатоза в дифференцированных клетках гепаррг

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59843

⸱

18 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы описываем подробный протокол для индуцирования печени везикулярный стеатоз в дифференцированных клетках HepaRG с жирным кислотным олеатом соли натрия и используем методы обнаружения и количественной оценки накопления липидов, включая когерентный анти-Стокс Рамана рассеяния (CARS) микроскопии, цитофторетриметрический анализ, Масло красный O окрашивания, и qPCR.

Аннотация

Печеночный стеатоз представляет собой метаболическую дисфункцию, которая является результатом накопления триггеросодержащих липидных капель в гепатоцитах. Чрезмерное накопление жира приводит к безалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), которая потенциально обратима и может перерасти в безалкогольный стеатогепатит (NASH) и в конечном итоге цирроз и гепатоцеллюля). Молекулярные механизмы, связывающие накопление липидов в гепатоцитах с прогрессированием в NASH, необратимые повреждения печени, фиброз, цирроз печени и даже HCC до сих пор остается неясным. С этой целью, несколько in vitro и in vivo модели были разработаны, чтобы выяснить патологические процессы, которые вызывают NAFLD. В настоящем исследовании, мы описываем клеточной модели для индукции печени везикулярный стеатоз, который состоит из DMSO-дифференцированных человеческих печеночных клеток HepaRG, обработанных жирными кислотами соли олеата. Действительно, олейт натрия обработанных клеток HepaRG накапливают липидные капли в цитоплазме и показывают типичные особенности стеатоза. Эта человеческая модель in vitro представляет собой ценную альтернативу моделям in vivo мышей, а также первичным человеческим гепатоцитам. Мы также представляем сравнение нескольких методов количественной оценки и оценки накопления жира в клетках HepaRG, включая окодело oil Red O, цитофторметрическое измерение Бодипи, метаболический анализ экспрессии генов qPCR и когерентный анти-Стокс Рамана рассеяния (CARS) микроскопии. Изображение CARS сочетает в себе химическую специфичность Раманской спектроскопии, метода химического анализа, хорошо известного в материалах, с преимуществами высокоскоростных нелинейных оптических микроскопов с высоким разрешением количественное увеличение накопления липидов и динамики липидных капель. Создание эффективной модели in vitro для индукции везикулярного стеатоза, наряду с точным методом количественной оценки и характеристики накопления липидов, может привести к развитию ранней стадии диагностики НАФЛД с помощью идентификации молекулярных маркеров и создания новых стратегий лечения.

Введение

Печеночный стеатоз определяется как внутрипеченое накопление жира, в триглицеридов, содержащих липидные капли, по крайней мере 5% от веса печени. Длительное хранение печеночных липидов является потенциально обратимым процессом, однако, это может привести к дисфункции обмена веществ печени, воспаление и передовые формы безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD), преобладающей причиной хронических заболеваний печени во многих частях мир1,2. НАФЛД является многофакторным заболеванием, которое может эволюционировать до более агрессивного безалкогольного стеатогепатита (NASH), который, в свою очередь, может прогрессировать до цирроза печени и, в небольшом проценте пациентов, гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1,3. Нет утвержденной терапии в настоящее время доступна в качестве конкретного лечения для NAFLD и сочетание диеты и изменения образа жизни остается столп НАФЛД и NASH управления4,5,6.

Молекулярные механизмы, ведущие к развитию печеночного стеатоза в патогенезаНАФЛД, еще предстоит выяснить 7. В этом контексте были разработаны модели мышей для изучения прогрессирования болезни стеатоза человека. Существует множество различных моделей, и каждая из них имеет свои преимущества и недостатки, включая генетические, питательные и химически индуцированные модели, сочетающие различные подходы. Генетически модифицированные (трансгенные или нокаутирующие) мыши спонтанно развивают заболевания печени. Однако следует отметить, что эти мутации очень редки у людей и удаление или чрезмерное выражение одного гена (например, об/об мышь) не могут имитировать этиологию многофакторного заболевания человека на молекулярном уровне8,9. Аналогичным образом, болезнь, приобретенная мышами после диетических или фармакологических манипуляций, не можетимитировать эффекты рациона человека, связанные с развитием НАФЛД у человека 8. Модели животных, однако, способствовали развитию понимания НАФЛД, и этот подход в настоящее время является наиболее часто используемой стратегией в лабораторных исследованиях. Тем не менее, репликация в организме человека результатов, полученных в животных моделях неоднократно не удалось, в результате чего плохой перевод в клинику10.

Таким образом, модели in vitro NAFLD могут играть основополагающую роль в выяснении молекулярных механизмов прогрессии NAFLD, и они представляют собой ценный инструмент для проверки большого количества соединений. Первичные клеточные культуры, увековеченные клеточные линии и биопсия печени широко используются в исследовательских целях11. Первичные гепатоциты человека очень похожи на клинические условия человека, но существует ограниченное число доноров, а первичные клеточные культуры показывают плохую воспроизводимость из-за изменчивости клеток. Эти наблюдения, наряду с этическими и материально-техническими вопросами, привели к тому, что использование первичных гепатоцитов человека было ограничено12. Таким образом, печеночные клеточные линии представляют собой удобную альтернативу, имеющая ряд существенных преимуществ перед первичной культурой, так как линии печеночных клеток постоянно растут, имеют почти неограниченный срок службы и имеют стабильный фенотип. Кроме того, клеточные линии легко доступны, а культурные условия линий печеночной клетки проще, чем у первичных гепатоцитов, и стандартизируются между различными лабораториями.

Здесь мы подробно описываем модель клеточного цитирования печени, представленную печеночными дифференцированными клетками HepaRG, обработанными олеатом натрия. Линия клеток HepaRG была создана из женщины,пациентки, пораженной инфекцией гепатита С, и Эдмондсона класса I хорошо дифференцированной опухоли печени14. Линия клеток HepaRG является человеческой бипотентной линии клеток-прародителей, способной дифференцироваться при воздействии 2% диметилсульфида (DMSO) на два различных клеточных фенотипа: желтоподобные и гепатоцитные клетки. Дифференцированные клетки HepaRG (dHepaRG) имеют некоторые особенности и свойства со взрослыми гепатоцитами и обладают способностью четко выражать гены, характерные для печени, такие как Альбумин, АлдолазеБ, Цитохром P450 2E1 (CYP2E1) и Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)13 (шаг 3). Лечение клеток dHepaRG жирным кислотным олеатом натрия (250 мкм) в течение 5 дней приводит к выработке цитоплазмических липидных капель, имитирующих эффекты жировой печени14,15,17,18 ( шаг 4). Накопление липидных капель может быть легко обнаружено маслом Red O окрашивания (шаг 5), лизохром жирорастворимый краситель, который окрашивает нейтральные триглицериды и липиды красно-оранжевый. Для эффективной количественной оценки липидов в жирной dHepaRG, здесь мы иллюстрируем цитофторетриметрический анализ после окрашивания с 4,4-дифторо-1,3,5,7-тетраметил-4-бора-3a,4a-диаза-с-индицен (Bodipy 505/515) (шаг 6), липофилии флоцентистые внутриклеточных липидных органов и был использован для обозначения липидных капель19. Кроме того, здесь мы показываем, как оценить стеатоз по количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) (шаг 7) генной экспрессии дерегуляции нескольких метаболических генов в клетках dHepaRG. Для дальнейшей характеристики и количественной оценки накопления липидных капель после лечения олеатом натрия, мы выполнили когерентную анти-Стокс Раман рассеяния (CARS) микроскопии (шаг 8), инновационный метод, который позволяет визуализации и количественной оценки липидные капли без маркировки20,21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка культурных СМИ и реагентов

  1. Пролиферирующая среда: дополнить среду Уильяма E с GlutaMAX, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина и 0,5 мкмизона здоров.
  2. Дифференциация среды: дополнить Уильяма E среды с GlutaMAX, 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, 5 мкг /мл инсулина, 50 мкмизонов емисуччинаии 50 мкмизонов и 2% DMSO.
  3. Замораживание среды: дополнение размножающейся среды с 10% DMSO.
  4. Олеят натрия: растворить в 99% метанола при концентрации 100 мМ, перемешать O/N и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  5. Нефть Красный O: подготовить фондовый раствор. Взвесить 0,35 г масла Red O и растворить в 100 мл изопропанола. Перемешать O/N, фильтр (0,2 мкм) и хранить на RT. Подготовьте рабочее решение: смешайте 6 мл раствора Oil Red O Stock с 4 мл ddH2O. Пусть сидеть при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут, а затем фильтр с 0,2 мкм фильтра. Правильная фильтрация настоятельно рекомендуется для успешного окрашивания, чтобы избежать фона.
  6. Бодипи (505/515): растворяют краситель Bodipy (505/515) в DMSO при концентрации запасов 100 мкм, хранят при -20 градусов по Цельсию в темноте и используют при окончательной концентрации 100 нм.
  7. Приобретайте прозрачные стеклянные блюда для экспериментов CARS.

2. Таяние, усиление и криоконсервация клеток HepaRG

  1. Оттепель азота криоконсервированных клеток HepaRG путем погружения партии в ванну 37 градусов по Цельсию до размораживания. Выберите пакет с низким проходом (Злт;20). Клетки HepaRG доступны на коммерческой уровне.
  2. Быстро переносите клетки в трубку 15 мл, содержащую 10 мл размножающейся среды и центрифуги в течение 5 мин (200 х г, 4 кв. C).
  3. Откажитесь от супернатанта и отрепримите клетки с помощью 5 мл размножающейся среды.
  4. Подсчитайте клетки и разбавьте, чтобы пластина 2,5 х 104 клетки /см2.
  5. Обновлять среду каждые 2 или 3 дня. Клетки размножаться с удвоением времени около 24 ч.
  6. Отсоединить клетки HepaRG при 80% стоечности на 3-5 мин инкубации с раствором трипсина 0,05%. Соберите клетки в пролиферирующей среде и центрифуге в течение 5 мин (200 х г,4 кв. C).
  7. Откажитесь от супернатанта и отрепримите клетки с помощью 5 мл размножающейся среды.
  8. Подсчитайте клетки и разбавьте, чтобы пластина 2,5 х 104 клетки /см2.
  9. На этом этапе, усиливать клетки, повторяя шаги 2.5-2.8 для того, чтобы достичь соответствующего количества клеток, чтобы начать эксперименты, или криоконсервации, как в шаге 2.10.
  10. Чтобы криоконсервировать клетки HepaRG, отсоедините клетки 24 ч после покрытия на 3-5 мин инкубации с раствором трипсина 0,05%. Соберите клетки в пролиферирующей среде и центрифуге в течение 5 мин (200 х г,4 кв. C). Откажитесь от супернатанта, отрепримите клетки в 1 мл/пакет замораживающей среды, 1,5 х 106 ячеек/пакет и криоконсервируют партии в жидком азоте.

3. Дифференциация клеток HepaRG (День 0-21)(Рисунок 1A)

  1. День 0. Семена HepaRG клетки с низкой плотностью (2,5 х 10 104 клетки/см2) в культуре обработанные блюда с соответствующим объемом пролиферации среды(рисунок 1B). Два блюда должны быть покрыты для каждого анализа (Масло Красный O окрашивание, анализ FACS, qPCR): один для контрольных клеток и один для олеат-обработанных клеток. При выполнении измерений CARS (шаг 8), семена клеток параллельно в прозрачные стеклянные bottomed блюда. В качестве контроля, урожай одного необработанного блюда (пролиферации клеток День 0) для выполнения анализа экспрессии генов дифференциации маркер генов (см. шаг 3.6).
  2. День 2 и День 4. Измените среду с соответствующим объемом пролиферации среды и пусть клетки растут до слияния.
  3. День 7. Клетки должны быть 100% конфлюентными(рисунок 1C). Вымойте клетки один раз с 1x фосфат-буферный солен (PBS). Удалить 1x PBS и добавить соответствующий объем дифференциации среды.
  4. День 8, 9, 12, 15, 18.  Вымойте клетки один раз с 1x PBS. Удалить 1x PBS и добавить соответствующий объем дифференциации среды.
  5. День 21. Наблюдайте клетки HepaRG под микроскопом и убедитесь, что клетки совмещены дифференцированными культурами(рисунок 1D).
  6. В качестве контроля, урожай один контроль блюдо (дифференцированные клетки День 21) для выполнения анализа экспрессии генов (шаг 7) дифференциации маркер генов(Рисунок 1E).
  7. На 21-й день дифференцированные клетки HepaRG могут быть криоконсервированы в жидком азоте.

4. Индукция везикулярного стеатоза (День 21-26)

  1. День 21. Разбавить олеатом натрия (100 мМ) с соответствующим объемом полной дифференциации среды до конечной концентрации 250 мкм (1:400). Добавьте 99% метанола 1:400 (такой же объем, как у олеата натрия) в другой аликот дифференциации среды, чтобы сделать лечение управления транспортным средством. (Например: добавьте 25 л олеата натрия к 10 мл среднего и параллельно добавляем 25 л 99% метанола к 10 мл среднего). Вымойте клетки один раз с 1x PBS и добавить транспортного средства или олеата натрия среды.
  2. День 23 и День 25. Измените среду с соответствующим объемом свежеприготовленной среды как в шаге 4.1.
  3. День 26. Обратите внимание с помощью оптического микроскопа, что липидные капли накапливаются в клетках, обработанных олеатом натрия, и легко видны как полупрозрачные капли в цитоплазме, как на рисунке 2А.

5. ОценкаЛипидперевая перегрузка и индукция стеатоза: Нефть Красная O окрашивание

  1. Вымойте он клетки один раз с 1x PBS и удалить 1x PBS полностью.
  2. Добавьте 4% параформальдегида (разбавленного в 1x PBS) и инкубировать в течение 15 мин на RT.
    ПРЕДЕКТО: Параформальдегид является токсичным, поэтому этот шаг должен быть выполнен в дымовой капот, с защитным оборудованием, включая перчатки, лабораторное пальто и маску.
  3. Удалить параформальдегид и мыть клетки дважды с 1x PBS. Клетки могут храниться в 1x PBS при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких дней до окрашивания. Оберните парафильмом и накройте алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить высыхание клеток.
  4. Удалите 1x PBS. Инкубировать клетки с 60% изопропанола в течение 5 мин на RT.
  5. Удалить изопропанол и дайте клеткам высохнуть полностью на RT.
  6. Добавьте рабочее решение Oil Red O и инкубинуте на RT в течение 30 мин. Объем рабочего решения, необходимого для каждого образца, соответствует объему носителей, используемых для культивирования клеток.
  7. Удалить масло Красный O раствор и сразу же добавить ddH2O. Вымойте клетки 4 раза с ddH2O.
  8. Приобретение изображений под микроскопом для анализа(рисунок 2B).
  9. Чтобы выпустить масло Красный O краситель: удалить всю воду и дайте высохнуть; добавить 1 мл 100% изопропанола и инкубировать в течение 10 минут с нежной тряской на RT.
  10. Pipet изопропанол с eluted Масло Красный O краситель вверх и вниз несколько раз, гарантируя, что все масло Красный O находится в растворе. Перенесите раствор в кювет. Измерьте OD500 nm спектрофотометрией и используйте 100% изопропанол как пустой(рисунок 2C).

6. Оценка липидной перегрузки и индукции стеатоза: Бодипи окрашивание и цитофторетриметрический анализ

  1. Вымойте клетки один раз с 1x PBS. Инкубировать с 100 нм Bodipy разбавленной в 1x PBS в темноте в течение 40 мин при 37 градусов по Цельсию. Неокрашенный контроль должен быть включен в измерения цитометрии потока. С этого момента, защитить образцы от света как можно больше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем раствора окрашивания, необходимого для каждого образца, соответствует объему носителей, используемых для культивирования клеток.
  2. Удалить окрашивающий раствор и мыть клетки один раз с 1x PBS. Переходки к шагам 6.3-6.6. для анализа FACS (fluorescence-activated cell s) или для шага 6.7 для визуализации микроскопа.
  3. Аккуратно соскребите клетки с 1x PBS и передать его в трубку 15 мл. Центрифуга в течение 10 мин (200 х г, 4 кв. C).
  4. Аккуратно удалите супернационты, не нарушая гранулы и мыть с 3 мл 1x PBS. Центрифуга в течение 5 мин (200 х г, 4 кв. C).
  5. Удалить супернационты и повторно в 300 Зл 1x PBS, а затем передать в трубку FACS.
  6. Немедленно измеряйте интенсивность флуоресценции Bodipy цитофториметрическим анализом с возбуждением/длиной волн выбросов 505/515 нм(рисунок 3A,B).
  7. Вымойте клетки один раз с 1x PBS и удалить PBS полностью.
  8. Добавьте 4% параформальдегида (разбавленного в 1x PBS) и инкубировать в течение 15 мин на RT.
    ПРЕДЕКТО: Параформальдегид является токсичным, поэтому этот шаг должен быть выполнен в дымовой капот, с защитным оборудованием, включая перчатки, лабораторное пальто и маску.
  9. Удалить параформальдегид и мыть образцы 3x в течение 5 мин в PBS. Клетки могут храниться в 1x PBS при 4 градусах Цельсия или изображены сразу(рисунок 3C). Для хранения, оберните парафильмом и накройте алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить высыхание клеток.

7. Оценка перегрузки липидных и стеатозной индукции: qPCR

  1. Вымойте клетки один раз с 1x PBS. Очистите клетки с 1x PBS, центрифуга на 200 х г, и отбросить супернатант. На этом этапе, клетки могут быть собраны при -80 градусов по Цельсию или обработаны как в шаге 7.2.
  2. Выполняйте полную изоляцию РНК стандартными методами с использованием коммерческих реагентов в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Оцените концентрацию РНК с помощью УФ-спектрофотометрических измерений, гарантируя высокую чистоту РНК (близко к 2,0) на основе чтения A260/A280.
  4. Синтезировать кДНК из 1 мкг общей РНК со стандартным набором синтеза кДНК.
  5. Разбавить кДНК до окончательного объема 50 Л л с H2O.
  6. Проанализируйте каждый образец cDNA в тройном qPCR: подготовьте одну мастерскую смесь qPCR(Таблица1), которая достаточна для необходимых реакций для каждого грунтовки, включая праймеры, специфичные для трех генов домашнего хозяйства в качестве элементов управления: глицеральдеид-3-фосфато deidrogenasi (GAPDH), актинB и ribosomal 18S (см. Таблица материалов для грунтовых последовательностей):
  7. Распределить 18 зл мастер смеси на хорошо в ПЦР многостенной пластины.
  8. Добавьте 2 злицита образца кДНК в каждом колодце. Запечатать тарелку.
  9. Запустите образцы в соответствии с инструкцией Thermal Cycler.

8. Оценка липидной перегрузки и индукции стеатоза: CARS

  1. Исправьте клетки, предварительно приготовленные на стеклянных посудах, как описано в шагах 5.1-5.3.
  2. Включите коммерческую настраиваемую picosecond импульсную лазерную систему, настраивая ее на получение двух выходов разной длины волн. Разница в частоте между выходами должна быть 2840 см-1 для генерации интенсивного светового сигнала CARS, соответствующего метиленовой симметричной растяжке; для выходной на фиксированной длине 1064 нм ("Стокс" свет), другая длина волны должна быть настроена до 817 нм ("насос" свет).
  3. Убедитесь, что выход 817 нм пространственно и временно перекрывается с выходом 1064 нм: используйте соответствующее дихроическое зеркало (т.е. с разрезом между 817 и 1064 нм), чтобы пространственно комбинировать лучи и использовать оптическую линию задержки для получения временного перекрытия лазера Импульсов.
  4. Убедитесь, что два копропагата т.д. являются коллимимированными и что их диаметры имеют одинаковые значения, соответствующие оптической системе в микроскопе, которая сфокусирует их на образце; при необходимости, отдельно сосоединить балки перед дихроческим зеркалом, которое их объединяет.
  5. Включите коммерческую перевернутую систему микроскопа, которая должна включать инфракрасный лазерный сканирующий блок и двухканальный красный/зеленый блок обнаружения эпи и выровнять копропагатные лазерные лучи в сканирующее устройство.
  6. Открывая двухканальный блок обнаружения эпи, удалите куб и замените его фильтр обнаружения красной волны фильтром, который может выбрать сигнал 2840 см-1 CARS, который сосредоточен на 663 нм для насоса 817/1,064 нм/Стокса Схема. Фильтр с узкой полосой (20 нм) предпочтительнее, чтобы избежать сбора высоких уровней флуоресцентных фоновых сигналов.
  7. Поместите блюдо на сцене перевернутого микроскопа CARS, и, используя 100x цель погружения масла, сдвиг вертикальное положение цели сосредоточиться на клетках.
  8. Настройка микроскопа программного обеспечения для сбора высокого разрешения (1024 х 1024 пикселей) изображения на поле зрения, охватывающих 127 мкм х 127 мкм.
  9. Установите программное обеспечение микроскопа для непрерывного приобретения и отображения изображений поля обзора 127 мкм x 127 мкм и проверки отображаемых изображений при оптимизации параметров сбора изображений. Убедитесь, что лазерные силы сбалансированы для быстрого сбора изображений и минимального повреждения, вставляя соответствующие фильтры нейтральной плотности в пути луча по мере необходимости, и выберите время обитания пикселя, что позволяет сбор изображений с хорошим сигналом к шуму соотношение в выбранных условиях лазерной мощности.
  10. Приобрести и сохранить изображения нескольких различных полей зрения в блюдо в оптимизированных условиях. Дополнительно, мультифотон флуоресценции изображения, созданные зелено-волновой эмиссии (в основном из двух-фотонных возбуждения на 817 нм), могут быть одновременно собраны через другой детектор эпи. Повторите шаги 8.7-8.10 для каждого блюда.
  11. Для анализа изображений CARS обрабатывает изображения с помощью реализации ImageJ FIJI. Управляйте функцией Despeckle (или аналогичным инструментом денозирования) на каждом изображении перед дальнейшим анализом для улучшения соотношения сигнала к шуму без потери детализации.
  12. Используйте FIJI, чтобы выбрать клетки вручную, а затем автоматически подсчитать липидные капли в сегментированных отдельных клетках для получения статистики по липидным капле и числам для каждой клетки и для всего набора данных изображений для каждого блюда.

9. MtT Cell Viability

  1. Плита дифференцировала клетки HepaRG в 96-колодецную пластину с плотностью 1 х 105 клеток/колодца в окончательном 100 л объема среды культуры дифференциации.
  2. 24 ч после посева, лечить клетки с 99% метанола (транспортное средство) и с 100 МКм, 250 ММ и 500 ММ олеат натрия и пальмитат натрия разбавленной в 100 л дифференциации культуры среднего / хорошо в тройной.
  3. Измените среду с 99% метанола и с 100 мкм, 250 мкм и 500 ММ олеатом натрия и пальмитатом натрия, разбавленными в 100 л культуры дифференциации среднего/хорошо каждые 24 ч.
  4. 96 ч после метанола/ натрия олеат / натрия пальмитат лечения, лечить клетки с 2 ММ доксорубицин разбавленной в 100 л дифференциации культуры среднего / хорошо в тройной в качестве контроля.
  5. 18 ч после лечения доксорубуцином, изменить среду с 100 Зл культуры среды.
  6. Пипет 20 ЗЛ 3-(4,5-диметилтиазол-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий реагент MTT (Таблица Материалов) в каждую скважину 96-хорошо, асай пластины, содержащие клетки в 100 средних . Включите фоновый контроль путем пайпетации 20 зл реагента в контрольный колодец без ячеек в 100 Л культуры дифференциации среды в тройном.
  7. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в увлажненной, 5% CO2 атмосфере.
  8. После инкубации в течение 30, 60 и 90 минут с реагентом MTT tetrazolium, запишите абсорбцию на 490 нм с помощью 96-хорошо плиты читателя. Вычесть фоновое поглощение неклеточных управляющих скважин из значений абсорбции для других образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы вызвать и охарактеризовать везикулярный стеатоз в DMSO дифференцированных клеток HepaRG натрия олеат лечения(рисунок 1A).

Дифференциация клеток HepaRG.
Чтобы эффективно вызвать дифференциацию, пролиферирующие клетки должны быть посеяны при низкой плотности (2,5 х 10 104 клетки/см2) в среде распространения. При посеве при низкой плотности клетки активно делят...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает, как дифференцировать клетки HepaRG и как вызвать везикулярный стеатоз лечения олеатом натрия(рисунок 1A). Действительно, по сравнению с другими человеческими линиями клеток гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), клеточная линия HepaRG демонстрирует особенности взрослых гепатоцитов человека, что представляет собой ценную альтернативу бывшим виво культивируемым первичным гепатоцитам человека13,14 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим профессора Кристиана Трепо (INSERM U871, Лион, Франция), который любезно предоставил клетки HepaRG. Мы благодарны Рите Апподиа за административную помощь. Эта работа была поддержана MIUR-Ministero dell'istruzione, dell'universite e della ricerca (FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC) и Римским университетом Сапиенца (протеже. C26A13T8PS; Прот. C26A142MCH; Прот. C26A15LSXL).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Hyclone HyClone Fetal Clone II GE HealthcareSH30066
Уильям s Е среда с GlutaMAX Thermofisher32551087
пенициллин/стрептомицин SIGMAP4333
Инсулин SIGMAI9278
Гидрокортизона гемисукцинатSIGMAH2270
DMSO, диметилсульфоксидSIGMAD2438     
Олеат натрияSIGMAO7501 
МетанолSIGMA179337
ИзопропанолSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
Раствор формальдегидаSIGMA252549
РНКазы свободная ДНКазаPromegaM198A 
Посуда со стеклянным дномWillco WellsGWST-5040
Масло Красный растворSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR oligo name>Sequence
ACACB FORCAAGCCGATCACCAAGAAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
β-актин FORGCACTCTCTCCAGCCTTCCT
β-актин REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
АЛЬБУМИН ДЛЯTGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
АЛЬБУМИН REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCTC
ALDOB FORGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 ДЛЯCTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A ДЛЯTCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 ДЛЯTTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FORCTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FORTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FORTCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTTGAATAA
IL6 ДЛЯCCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 ДЛЯACAGACAGGAAACCCAAGCCACAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 ДЛЯTTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 ДЛЯAATGAGTTGGAGGGGGGGGGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAAGTAGC
SCD ДЛЯTCTAGCTCCTATACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 ДЛЯTGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S ДЛЯCGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTC

Ссылки

  1. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  2. Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), Suppl 47-64 (2015).
  3. Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
  4. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  5. Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).
  6. Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).
  7. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  8. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).
  9. Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).
  10. Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).
  11. Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
  12. Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  13. Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
  14. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  15. Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).
  16. Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).
  17. Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638(2018).
  18. Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025(2016).
  19. Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).
  20. Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).
  21. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), 51092(2012).
  22. Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  23. Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).
  24. Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  25. Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).
  26. Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).
  27. Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
  28. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
  29. Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, Suppl 5 627-636 (2015).
  30. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).
  31. Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).
  32. Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).
  33. Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).
  34. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), Pt B 1260-1272 (2017).
  35. Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
  36. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Oil Red OBODIPYCARSin vitro

Похожие статьи