Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интравитальная визуализация интраэпителиальных лимфоцитов в Murine Small Intestine

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59853

⸱

24 июня 2019 г.

 , 
1Center for Immunity and Inflammation, Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers New Jersey Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод визуализации GFP-маркированных IELs с помощью интравитальной визуализации тонкой кишки murine с помощью перевернутой вращающейся дискки конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет отслеживать живые клетки в слизистой оболочке до 4 ч и может быть использован для исследования различных кишечных иммунно-эпителиальных взаимодействий.

Аннотация

Интраэпителиальные лимфоциты, выражающие рецептор Т-клеток (яп. Отчасти из-за отсутствия окончательного лиганд для рецептора т-клеток, наше понимание регуляции активации IEL и их функции in vivo остается ограниченным. Это требует разработки альтернативных стратегий для изучения сигнальных путей, участвующих в регулировании функции IEL и реагирования этих клеток на местную микросреду. Хотя широко понимается, что IL ограничивают транслокацию патогенов, использование интравитальной визуализации имеет решающее значение для понимания пространственно-временной динамики взаимодействия IEL/эпителии в стабильном состоянии и в ответ на инвазивные патогены. В этом случае мы представляем протокол для визуализации мигрирующего поведения IEL в небольшой слизистой оболочке кишечника GFP и T-клеточной мыши с использованием перевернутой вращающейся дисковой конфокальной лазерной микроскопии. Хотя максимальная глубина изображения этого подхода ограничена по сравнению с использованием двухфотонных лазерно-сканирующих микроскопий, вращающийся диск конфокальной лазерной микроскопии обеспечивает преимущество высокоскоростного приобретения изображения с уменьшенным фотоотбелением и фотоповреждения. Использование 4D программного обеспечения для анализа изображений, поведение наблюдения Т-клеток и их взаимодействие с соседними клетками могут быть проанализированы после экспериментальных манипуляций, чтобы обеспечить дополнительную информацию об активации IEL и функции в слизистой оболочке кишечника.

Введение

Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) расположены в кишечном эпителии, и находятся как вдоль мембраны подвала и между соседними эпителиальными клетками в боковом межклеточном пространстве1. Существует примерно один IEL на каждые 5-10 эпителиальных клеток; эти IELs служат в качестве часовых для обеспечения иммунного наблюдения за большим пространством кишечного эпителиального барьера2. IEl, выражающий рецептор т-клеток (TCR), составляют до 60% от общей численности IEL в тонкой кишке мурин. Исследования на Т-клеточных недостаточномых мышах демонстрируют в значительной степени защитную роль этих клеток в ответ на кишечные травмы, воспаление и инфекцию3,4,5. Несмотря на поколение Tcrd нокаут мыши6, наше понимание биологии IEL остается ограниченным, отчасти из-за того, что лиганды, признанные TCR еще предстоит определить7. В результате, отсутствие инструментов для изучения этой популяции клеток затрудняет изучение роли активации ТКР и функционирования в физиологических и патологических условиях. Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали живые методы визуализации для визуализации миграционного поведения и взаимодействия с соседними энтероцитами в качестве средства для получения дополнительного анализа функции IEL и отзывчивости внешних стимулов in vivo.

За последнее десятилетие, интравитальная визуализация значительно расширила наше понимание молекулярных событий, участвующих в нескольких аспектах кишечной биологии, в том числе эпителиальной клетки пролить8, регулирование эпителиальной функции барьера9 ,10, миелоидные клетки выборки содержания светила11,12, и принимающей-микроб взаимодействия11,13,14,15,16 . В контексте биологии IEL, использование интравитальной микроскопии пролило свет на пространственно-временной динамики подвижности IEL и факторы, посредничающие их поведение наблюдения13,14,15, 16. Развитие TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) репортер мышей, который этикетки IELs по ядерной gFP выражение17, показал, что IL являются весьма motile в эпителии и проявлять уникальное поведение наблюдения, что реагирует на микробные инфекция17,13,14. Недавно была разработана еще одна мышь-репортер t(Tcrd-GDL), которая выражает GFP в цитоплазме, чтобы обеспечить визуализацию всей ячейки18. Аналогичная методология была использована для исследования потребности конкретных рецепторов хемокина, таких как G белковых рецепторов (GPCR)-18 и -55, на динамике подвижности IEL19,20. В отсутствие клеточного репортера флуоресцентные конъюгированные антитела против CD8 были использованы для визуализации и отслеживания подвижности IEL in vivo19,20. Хотя двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия обычно используется для интравитальной визуализации, использование вращающейся дисковой конфокальной лазерной микроскопии обеспечивает уникальные преимущества для захвата высокоскоростных и высокопроизводительных многоканальных изображений с минимальным фоновым шумом. Эта технология идеально подходит для выяснения пространственно-временной динамики иммунных/эпителиальных взаимодействий в сложной микросреде слизистой оболочки кишечника. Кроме того, с помощью различных трансгенных и / или нокаут мыши модели, эти исследования могут обеспечить понимание молекулярной регуляции иммунной и /или эпителиальной функции клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования были проведены в Ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход (AALAC) аккредитованных объекта в соответствии с протоколами, утвержденными Ратгерс Нью-Джерси Медицинская школа сравнительной медицины ресурсов.

1. Подготовка мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура, включая подготовку животных и операцию, займет 30-40 минут. До операции включите микроскоп и разогрейте закрытый инкубатор на микроскопе до 37 градусов по Цельсию.

  1. Выполняйте эксперименты на мышах TcrdEGFP на 8-10 недель на фоне C57BL/6, которые были получены от Бернара Малисана (INSERM, Париж, Франция). Согласно утвержденной IACUC процедуре, анестезируют мышь путем инъекций и.п. кетамина (120 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) на основе веса животного. Оцените уровень анестезии по частоте дыхания (55-65 вдохов в минуту)21,щепотка ног и пальпебральный рефлекс.
  2. Как только хирургическая анестезия плоскости достигается, обеспечить задние ноги мыши с помощью ленты на грелку для поддержания температуры тела, которые могут контролироваться ректального термометра. Если есть признаки того, что анестезия изнашивается (например, повышенная скорость дыхания, мигает и/или глазная мышца подергивает ответ на палпебральный рефлекс), реадрезмешь 50 Зл кетамина/ксилазина в то время, пока мышь не будет полностью успокоительна.
  3. Подготовка ядерного красителя путем разбавления 50 л хохста 33342 (10 мг/мл) с 315 л 0,9% сольения; окончательная концентрация составляет 37,5 мг/кг в зависимости от веса мыши (200 л приблизительного объема). После того, как мышь обезврежена, медленно вводить Hoechst с помощью шприца туберкулина через ретро-орбитальной венозной синуса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите 1–2 мин, прежде чем перейти к следующему шагу, чтобы позволить мыши акклиматизироваться к изменению циркулирующего объема после ретро-орбитальной инъекции.
  4. Поместите небольшое количество смазки на глаза, чтобы предотвратить их от высыхания.

2. Хирургия мыши: Лапаротомия для того чтобы подвергнуть действию кишечная mucosa

  1. Сделайте 2 см вертикальный разрез через кожу и брюшной полости вдоль средней линии нижней части живота, чтобы вытеснять область кишечника, чтобы быть изображены.
  2. Используя угловые щипточки, тщательно вытащите цекум из перитонеальной полости и определите область тонкой кишки для изображения. Будьте осторожны, чтобы не рвать мезентерические кровеносные сосуды во время этого процесса. Чтобы свести к минимуму потенциальное повреждение или кровотечение, избежать захвата или щипать кишечник с щипками.
  3. Найдите подходящую область тонкой кишки (2-3 см) для визуализации, которая содержит минимальное фекатовочное содержимое. Аккуратно верните цекум и оставшийся тонкий кишечник в полость перитонеальной полости, оставляя сегмент интереса экстернализованным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокола cecum или нарушения мезентерической сосуды во время этого шага.
  4. Поместите две пары щипцов по обе стороны от основной мезонтерии между кровеносными сосудами, и осторожно руб кончики щипцов вместе, чтобы создать отверстие в мембране (Рисунок 1)22. Это позволит игле пройти через мезентию при закрытии перитонеальной полости под кишечником.
  5. Закройте разрез, сохраняя при этом петлю кишечника экстернализованной. Используя угловые щипчи и изогнутую, конусную точечную иглу, прикрепленную к шову на 5 см, проникают с одной стороны перитонеума, проникают через отверстие, сделанное на предыдущем этапе, и вверх через другую сторону перитонеальной подкладки. Поместите один шов в верхней части, а другой в нижней части разреза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения сосуды во время этого шага.
  6. Повторите этот процесс, чтобы закрыть кожу под кишечной петлей, поместив один шов в середине разреза, между предыдущими швами в основной перитонеум.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно только экстернализировать область, которая должна быть изображена; это уменьшит постороннее движение во время визуализации. Будьте уверены, чтобы избежать связывания от брюшной артерии.
  7. Используйте электрокаутерию, чтобы сделать линию перфорации вдоль антимезентерической границы. Сразу же после прижьтера, нанесите несколько капель воды на поверхность кишечника, чтобы предотвратить дополнительное тепло-индуцированное повреждение тканей. Пятно с Kimwipe для удаления остаточной воды.
  8. Вырежьте небольшую горизонтальную щель на дистальном крае прижатой ткани с помощью ножниц Vannas и приступаем к разрезу по длине прижатой линии к проксимальному концу экстернуаемого сегмента ткани (примерно 1,5 см в длину), чтобы разоблачить слизистую оболочку Поверхности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить избыточное фекическое содержимое, оставшееся на открытой поверхности слизистой оболочки.
  9. Обложка живота мыши с влажным Кимвайп, чтобы предотвратить ткани от обезвоживания. Транспорт мышь к микроскопу в крытом сосуде.

3. Приобретение изображения прядильным диском Конфокальная микроскопия

  1. Пипетка 150 л из 1 мкм AlexaFluor 633 в HBSS на стеклянное покрывало дно 35-мм блюда. Расположите мышь так, чтобы открытая поверхность слизистой непосредственно контактирует с крышкой.
  2. Наклоните голову микроскопа назад и поместите мышь на покрывало блюдо на этапе визуализации в предварительно разогретом инкубаторе. Кроме того, накройте мышь нагревательным одеялом для поддержания температуры тела.
  3. Запуск программного обеспечения для визуализации. Интенсивность возбуждения и время экспозиции для каждого лазера не должны превышать 10-15 мВт или 120-150 мс, соответственно, чтобы избежать фотоотбелевания и свести к минимуму интервал между временными точками. Отрегулируйте среднее значение кадра до "2" и включите функцию em-прибыли, чтобы уменьшить фоновый шум. Выберите объективную калибровку 63x для обеспечения правильного измерения размера пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки, описанные выше, предназначены для обеспечения первоначальной ссылки, но будут варьироваться в зависимости от отдельных конфигураций микроскопа.
  4. Используя 405 нм лазера и 20x воздуха цели, визуализировать ядра, чтобы найти поле вилли, которые не имеют заметного движения или дрейфа на глаз. Избегайте областей артефактного движения из-за дыхания, перистальции или сердцебиения.
  5. Используя сканирование XY, запишите координаты XY области интереса и переключитесь на цель погружения в глицерол 63X.
  6. Подтвердите, что вилли в выбранном поле стабильны, приобретая живое изображение на канале 405 нм на срок до 1 мин.
  7. При приобретении живого изображения на канале 405 нм, отрегулируйте фокус, чтобы найти ортогональный план прямо под злобным кончиком. Приобретайте стеки, начиная с чуть ниже villous tip epithelium вниз villus, пока не будет трудно решить ядра, около 15-20 мкм, используя 1,5 мкм шаг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации с тремя каналами (405, 488, 640 нм) с использованием описанного выше времени экспозиции можно приобрести все три канала с интервалом примерно с 20 синтервалями.
  8. Откройте программное обеспечение в режиме анализа, 3-5 минут после начала приобретения, чтобы подтвердить стабильность изображения и подвижность IEL. Продолжайте приобретать изображения в течение 30-60 минут для каждого поля villi. Запись 2-3 полей для каждой мыши. Во время визуализации следите за мышью каждые 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если анестезия начинает стираться, используйте щипцы, чтобы аккуратно потерть шею мыши, чтобы ввести 50 зл кетамина / ксилазина за один раз. Продолжайте следить за уровнем анестезии и повторно администрировать, когда это необходимо.
  9. Не рекомендуется изображение одной мыши дольше, чем 4 ч. После того, как приобретение изображения завершено, жертвумы мышей шейки матки дислокации следуют двусторонние пневмоторакса.

4D анализ изображений

  1. Непосредственно импортировать файлы изображений в программное обеспечение 4D-рендеринга.
  2. Создавайте отдельные поверхности для IELs и просвета, а затем отслеживайте поверхности с течением времени, используя параметры, изложенные в таблице 1 в качестве первоначальной ссылки. Для IELs включите сплит касаясь объектов, используя указанный диаметр точки семени.
  3. Используйте алгоритм автоматического отслеживания для определения подвижности IEL. Хотя алгоритм отслеживания относительно точен, необходимо визуально проверить треки для каждого отдельного IEL. Если трек неправильный, исправьте его с помощью функций Disconnect и Connect под вкладкой Edit Tracks.
  4. Чтобы определить расстояние от каждого IEL до просвета, выберите lumen Surface и выполните функцию преобразования расстояния в меню Tool. При запросе выберите Outside Surface. После расчета преобразование расстояния будет отображаться как 4-й канал.
  5. Фильтр Интенсивность мин 4-го канала, чтобы выбрать iELs, которые находятся в боковом межклеточном пространстве (LIS). Это значение должно быть близко к 15 мкм, в зависимости от высоты колонной эпителиальной клетки. Процент от общего числа IEL в этом диапазоне, как сообщается, как частота IL в LIS.
  6. Для дальнейшего анализа экспортные статистические данные, включая: скорость трека IEL, смещение треков, прямоту треков и длину трека. Кроме того, проанализируйте данные с помощью модуля Vantage. В зависимости от эксперимента, получить дополнительные метрики из полученных данных, в том числе время пребывания в LIS или IEL / эпителиальных взаимодействий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя интравитальную визуализацию мышей-репортеров TcrdEGFP, мы ранее показали, что «IELs» демонстрируют динамическое поведение наблюдения, в котором они патрулируют эпителий, мигрируя по мембране подвала и в боковое межклеточное пространство (LIS) на устойчивом состояние(рисунок 2, Фильм1).

Этот подход также может быть использован для оценки того, как ингибирование конкретных клеточных сигнальных путей и/или рецепторов влияет на миграционное ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Развитие методов интравитальной микроскопии дало беспрецедентную возможность наблюдатьреорганизацию субклеточных структур 8,9,22,клеточных взаимодействий12, 25 и клеточного миграционного поведения13,14,15,16,26

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIH R21 AI143892, Нью-Джерси Фонд здравоохранения Грант, Буш биомедицинских Грант (KLE). Мы благодарим Мадлен Ху за помощь в редактировании рукописи и предоставлении данных, показанных в репрезентативных результатах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тарелка 35 мм, No 1,5 CoverslipMatTekP35G-1,5-14-C
Alexa Fluor 633 ГидразидInvitrogenA30634
BD PrecisionGlide Иглы для подкожных инъекций - 27 гThermo Fisher Scientific14-826-48
BD Slip Tip Стерильный шприц - 1 млThermo Fisher Scientific14-823-434
BD Туберкулиновый шприцThermo Fisher Scientific14-829-9
Ножницы для препарированияThermo Fisher Scientific08-940
ЭлектрокоагуляцияThermo Fisher Scientific50822501
Закрытая инкубационная камераOKOLABИглы
для глаз, размер #3; 1/2 круга, конусная точка, длина хорды 12 ммRobozRS-7983-3
Hank's Сбалансированный солевой растворSigma-Aldrich55037C
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Imaris (v. 9.2.1) с модулями Start, Track, XTBitplaneSoftware
Inverted DMi8Leica
Microscope IQ3 (v. 3.6.3)AndorSoftware
KetaminePutneyAnesthesia
KimwipesVWR21905-026
Ножницы McPherson-Vannas 3" (7,5 см) Длинный 5 x 0,15 мм Прямой SharpRobozRS-5600
Нерассасывающийся хирургический шовный материал, шелковая катушка, черная плетенаяFisher ScientificNC0798934
Nugent 4,25" (11 см) Длинноугловой гладкий наконечник 1,2 ммRobozRS-5228
Puralube Vet OintmentDechraСмазывающая глазная мазь
Вращающийся диск Yokogawa CSU-W1 с 63x 1,3 N.A. HC PLAN APO глицериновый иммерсионный объектив, камера iXon Life 888 EMCCD, диодный лазер 405 нм, DPSS лазер 488 нм, диодный лазер 640 нмКонфокальная системаAndor
XylazineAkornAnesthesia
щипцы

Ссылки

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090(2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

gamma delta IELgamma delta T
Интравитальная визуализация интраэпителиальных лимфоцитов в Murine Small Intestine
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.