Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы

6.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59856

⸱

9 июля 2019 г.

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.

Аннотация

Существует более 100 химически различных модификаций РНК, две трети из которых состоят из метилирования. Интерес к изменениям РНК, и особенно метилирования, вновь появился из-за важной роли, которую играют ферменты, которые пишут и стирают их в биологических процессах, имеющих отношение к болезням и раку. Здесь, чувствительный анализ in vitro для точного анализа деятельности писателя метилирования РНК на синтетических или in vitro транскрибированных РНК предоставляется. В этом ассее используется тритированная форма S-аденосил-метионина, что приводит к прямой маркировке метилированной РНК тритием. Низкая энергия излучения трития делает метод безопасным, а уже существующие методы усиления сигнала трития позволяют количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам. Хотя этот метод написан для РНК метилирования, несколько настроек сделать его применимым к изучению других изменений РНК, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как РНК ацетилирование с 14C ацетил кофермент A. В целом, этот вывод позволяет быстро оценить РНК метилирование условия, ингибирование с небольшими ингибиторами молекулы, или эффект РНК или фермента мутантов, и обеспечивает мощный инструмент для проверки и расширения результатов, полученных в клетках.

Введение

ДНК, РНК и белки подвержены изменениям, которыежестко регулируют экспрессию генов 1. Среди этих модификаций метилирование происходит на всех трех биополимерах. Метилирование ДНК и белка было очень хорошо изучено в течение последних трех десятилетий. В отличие от этого, интерес к метилированию РНК был только недавно возродился в свете важной роли, что белки, которые пишут, стирают или связывают РНК метилациляции играют в развитии и болезни2. В дополнение к более известным функциям в обильных рибосомных и передачи РНК, РНК метилирования пути регулируют конкретные посыльного РНК стабильности3,4, сращивание5 и перевод6,7, miRNA обработки8,9 и транскрипционной паузы и выпуска10,11.

Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в условиях лаборатории молекулярной биологии (обобщено на рисунке 1). Многие исследования оценивают активность РНК метилтрансферазы через точечную подрамность с антителом против изменения интереса РНК. Однако, точка-блот не проверяет целостность РНК при инкубации с метилтрансферазой РНК. Это важно, потому что даже незначительные загрязнения рекомбинантных белков с нуклеазой может привести к частичной деградации РНК и смешанные результаты. Более того, даже высокоспецифические антитела к модификации РНК могут распознавать неизмененные РНК с определенными последовательностями или структурами. In vitro RNA метилтрансферазы анализ сообщил здесь использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть трилциатна на метиловой группы донора (Рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител . Инструкции предусмотрены для экстракорпорной транскрипции и очистки стенограммы интереса и тестирования метилирования указанной транскрипта ферментом интереса. Этот метод является гибким и надежным и может быть скорректирован в соответствии с потребностями того или иного проекта. Например, в пробирке транскрибируются и очищены РНК, химически синтезированные РНК, но и клеточные РНК могут быть использованы. Этот ассси обеспечивает количественную информацию в виде сцинтилляции, а также качественную информацию, показывая, где именно метилированная РНК работает на геле. Это может обеспечить уникальное понимание функции РНК метилтрансферазы, особенно при использовании клеточных РНК в качестве субстрата, так как он обеспечивает метод непосредственного наблюдения размер РНК или РНК, которые предназначены для метилирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Транскрипция в пробирке и гель очищение целевой РНК

  1. Клон последовательность интереса в плазмиды, содержащие T7 и / или SP6 промоутеров с использованием установленных молекулярных методов клонирования12 или комплекты.
  2. Линейная версия шаблона ДНК для транскрипции in vitro
    1. Увеличьте последовательность интереса pcR плазмида с грунтовки предназначены для включения T7 промоутер региона через вставку, 20-30 bp вверх по течению и вниз по течению, как ранее описано13.
    2. Кроме того, дайджест 5 мкг плазмиды с помощью фермента ограничения (RE) сократить сайт доступны вниз по течению вставки в соответствии с инструкциями, предоставляемыми поставщиком RE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте перепроверить, что вставка не вырезана выбранным RE. Выбор RE, используемый в этом шаге, может существенно повлиять на доходность стенограммы. Преференциально, линейно с тупым или 5'-нависающие конца производства RE, чтобы избежать переключения шаблона T7 РНК полимераза на противоположной нити ДНК14. Попробуйте различные RE, если первоначальные урожаи недостаточны.
  3. Очистите полученную ДНК с помощью комплекта для экстракции и очистки геля агарозы. Выясните ДНК с 30 л воды.
  4. Хорошо перемешайте путем вихря, пайпета 1,5 л и измерить концентрацию ДНК с помощью микротомного спектрофотометра.
  5. Используйте 250 нг ДНК, чтобы проверить качество и размер очищенной ДНК на 1% агарозного геля электрофореза в 1x буфере TBE мигрировали в течение 1 ч при 4 V/cm.
  6. Оттепель замороженных реагентов комплекта транскрипции in vitro. Поместите T7 РНК Полимераза Mix на льду, а другие реагенты на nutator при комнатной температуре. Сразу же после полного оттаивания, быстро спина rNTP труб в течение 5 с, чтобы собрать раствор на дне труб и место на льду. Держите 10x Реакции буфера при комнатной температуре, чтобы избежать осадков.
  7. Труба в трубку 1,5 мл следующие компоненты реакции транскрипции 20 л при комнатной температуре в указанном порядке: 6 л воды, 2 л (0,1 - 1 мкг) линейного шаблона ДНК, 2 л раствора АТФ, 2 л раствора GTP 75 мМ , 2 л из 75 мм CTP раствора, 2 л из 75 мМ UTP раствор, 2 зл и 10x реакции буфера и 2 Зл T7 РНКА-микс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для шаблона ДНК, генерируемого ПЦР, используйте 100 - 200 нг ДНК; для шаблона ДНК, генерируемого ферментным дайджестом ограничения плазмиды,используйте 1 мкг. Активный рекомбинантный Его 6-тегами T7 РНК Полимераза может быть очищена в E. coli15.
  8. Тщательно перемешайте трубку. Быстрый спин в течение 5 с, чтобы собрать раствор реакции в нижней части трубки, а затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 2-4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая стенограмма будет вести себя по-разному в зависимости от шаблона ДНК, его длины, последовательности или структуры. Оптимизируйте условия транскрипции in vitro путем тестирования различных периодов инкубации до 6 ч; различные концентрации шаблона ДНК, T7 РНК Полимераза, или NTP; или добавление дополнительного MgCl2 к тому, что присутствует в T7 РНК Полимераза Mix.
  9. В конце инкубационного периода добавьте 1 qL DNase I на реакцию 20 л и инкубируют при 37 градусах По цельсии в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция транскрипции может быть временно сохранена на льду до тех пор, пока полиакриламид гель не будет готов.
  10. Продолжить очистку полиакриламидным гелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку РНК чувствительна к рН и загрязнению RNase, используйте СПЕЦИАЛЬНОе оборудование РНК и реагенты без RNase.
  11. Определить процент полиакриламид для геля в зависимости от размера стенограммы процентов: 3,5% за 100-2000 nt (XC: 460 nt; BB: 100 nt), 5% за 80-500 nt (XC: 260 nt; BB: 65 nt), 8% за 60-400 nt (XC: 160 nt; BB: 45 nt), 12% за 40-200 nt (XC: 70 nt; BB: 20 nt), 15% за 25-150 nt (XC: 60 nt; BB: 15 nt), и 20% для 6-100 nt (XC: 45 nt; BB: 12 nt).
  12. Подготовка мочевины denaturing полиакриламид гель путем объединения следующих реагентов в 50 мл конической трубки: 9,6 г молекулярного класса мочевины, 2 мл 10x TBE, х мл 40% акриламид:bis-acrylamide смесь (29:1) и воды до 20 мл знака на трубе , где х 20 мл/(40%/процент геля %).
    ВНИМАНИЕ: Полякриламид гели часто содержат ООН-полимеризованный акриламид, который является токсичным материалом, который может производить опасность при введении в окружающую среду. Утилизация гелей полиакриламидов в рамках программы по химическим отходам учреждения.
  13. Микроволновая печь для 15 с при 30% мощности. Поставить на nutator в течение 10 минут при комнатной температуре или до полного растворения мочевины.
  14. В то время как гель смесь вращается, получить гель кассеты (18-ну, 1 мм толщиной; 13,3 х 8,7 см (W х L)), удалить гребень и положение кассеты для гель литья.
  15. Быстрый спин 50 мл трубки для 5 с, чтобы собрать гель раствор в нижней части трубки. Добавьте 125 л 10% раствора персульфата аммония (APS). Место на nutator в течение 1 мин. Быстрый спин снова в течение 5 с.
  16. Добавьте 25 л тетраметилэтиленэдиамиамин (TEMED) и тщательно перемешайте, прокладывая вверх и вниз 5 раз с помощью 25 мл пипетки, избегающей пузырьков.
  17. Пипетка в гель литые и тщательно вставить гель гребень избегая пузырьков.
  18. Затяните печать, добавив большой зажим связующего поверх кассеты.
  19. Разрешить гель полимеризации в течение 1 ч.
  20. После того, как гель затвердел, удалите связующего клипа. Вставьте кассету в коробку электрофореза. Добавьте буфер 1x TBE в верхние и нижние резервуары.
  21. Извлекаем реакцию транскрипции. Добавьте воду до 100 л, затем добавьте 100 зл 2x Гель Загрузка буфера. Подготовьте лестницу, смешивая рекомендуемое количество с водой до 10 л и 10 л 2x gel Загрузка буфера в отдельной трубке 1,5 мл.
  22. Инкубировать как лестницу и в пробирке транскрипции реакции в термомиксер на 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
  23. В то время как образцы денатурируются при 70 градусах Цельсия, тщательно удалите гребень, очистите колодцы, прокладывая вверх и вниз каждый колодец с пипеткой P1000, и сразу же предварительно запустить в течение 10 мин при 100 В.
  24. После того, как образцы завершили их 15 мин денатурации при 70 градусов по Цельсию, удалить трубки из термомиксера и сразу же поместите на лед.
  25. Очистите каждый колодец геля снова с пипеткой P1000. Загрузите 20 зл лестницы на первой скважине влево, 20 зл и л образца РНК на 10 отдельных скважинах и 20 Зл 1x гель-загрузочный буфер на неиспользованные скважины.
  26. Выполнить гель при 100 В в течение 60 -240 мин, в зависимости от % полиакриламид геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: красители в гель Загрузка Буфер будет отделяться на две полосы, как они пересекают гель, медленно мигрирующих Bromophenol Blue (BB) синяя полоса, и быстро мигрирующих Xylene Cyanol (XC) голубой группы. Приблизительная миграция этих полос в различных полякриламидных гелях хорошо известна (см. шаг 1.11) и может быть использована для оценки миграции РНК в геле.
  27. После того, как гель был остановлен, тщательно удалить гель из кассеты.
  28. Поместите гель в чистую коробку, содержащую раствор 50 мл 1x буфера TBE с 50 злящееся нуклеиновой кислоты геля и инкубировать в течение 5 минут на рокер, чтобы испачкать РНК.
  29. Возьмите до и после группы иссечения изображение геля на гель изображений системы, предпочтительно с помощью синего света вместо УФ-трансиллюмина.
  30. Акциз каждой группы интересов с помощью nuclease-бесплатно одноразовый гель резки отзыв. После каждого хорошо, передача наконечник, содержащий гель ломтик 1,5 мл трубки и кратко спина, чтобы собрать ломтик геля. Повторяйте до тех пор, пока все полосы не будут собраны в ту же трубку 1,5 мл.
  31. После того, как все ломтики геля были собраны, добавьте 100 л безнулевой воды или TE буфера в трубку 1,5 мл. Хранить при 4-C для 48 ч. Это позволяет РНК выйти из геля ломтики в раствор.
  32. После 48 ч, pipet воды или TE буфера для свежей трубки 1,5 мл. Удалите оставшиеся ломтики геля. Очистите РНК с помощью комплекта очистки следующим образом.
    1. Равновесие спиновой колонки при комнатной температуре не менее 30 мин.
    2. К 100 л раствора РНК в новой трубке 1,5 мл со ступени 1,32, добавьте 350 л буфера RLT и хорошо перемешайте в течение 2 мин на nutator. Спин для 1 с при 200 х г, чтобы собрать раствор в нижней части трубки.
    3. Добавьте 675 кл. 100% EtOH и хорошо перемешайте в течение 2 мин на nutator. Спин для 1 с при 200 х г и сразу же перейти к следующему шагу.
    4. Передача 565 л смеси на спин-колонку и вращаться в течение 1 мин при 15000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
    5. Повторите предыдущий шаг со второй половиной выборки.
    6. Добавьте 500 кЛ буфера RPE к столбце и закрутите в течение 1 мин при 15 000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
    7. Добавьте 750 л 80% этанола в колонку и закрутите в течение 1 мин при 15 000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
    8. Поместите колонку в новую трубку коллекции 2 мл с открытой крышкой и вращаться при 15 000 х г в течение 5 минут.
    9. Перенесите колонну на новую трубку 1,5 мл.
    10. Добавьте 17 кл воды в центре колонны и вращайтесь при 15 000 х г в течение 1 мин. Elute снова с помощью еще 17 л воды. Общий объем извлеченных должен составят 32 л.
  33. Хорошо перемешайте путем вихря, пайпета 1,5 зл и измерить концентрацию РНК с помощью микротома спектрофотометра.
  34. Проверьте качество очистки РНК с помощью геля полиакриламидного полиакриламида, так как в шагах 1.11-1.29.

2. In vitro РНК метилтрансферазы анализ

  1. Настройка 100 Л РНК метилтрансферазы асссе в 1,5 мл трубки на льду следующим образом: 23 л воды, 10 мЛ 10x TBS (500 мм Tris-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 2 л 0,05 М EDTA, 5 мЛ 100 мМ DT , 40 зл 50% глицерола, 4 Зл из 58 ММ 3H-SAM, 5 Зл 20x Протеазы Ингибитор Коктейль, 1 Зл RNaseOUT (по желанию), 5 Л РНК и 5 Л метилтрансферазы.
    ВНИМАНИЕ: Радиоактивные трииатированные материалы опасны и должны обрабатываться только во время ношения перчаток, лабораторного пальто и любого другого необходимого СИЗ. Все наконечники пипетки и трубки, контактные с радиоактивным материалом, считаются твердыми радиоактивными отходами. Утилизировать все твердые и жидкие радиоактивные отходы в соответствии с утвержденным лабораторией протоколом радиоактивных отходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите контрольные образцы без метилтрансферазы и без РНК. Концентрации реагентов могут потребовать оптимизации и/или включения растворимых солей катионов, таких как MgCl2, или немаркированных SAM. Оптимальный диапазон конечной концентрации РНК составляет от 50 нм до 1 ММ, в то время как концентрация метилтрансферазы составляет от 25 нм до 300 нм.
  2. Тщательно перемешайте, аккуратно завихряя трубку. Спин 5 с на 200 х г, чтобы собрать раствор в нижней части трубки. Инкубировать трубку (ы) при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
  3. Очистка реакции с помощью очистки столбца, как в шаге 1.32.
    ВНИМАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы правильно утилизировать любые радиоактивные материалы, особенно во время колонны моет (пипетка из вместо аспирации отходов из коллекторских труб).
  4. Выполните количество жидких мерцаний
    1. Настроили стойку сцинтилляции с одним флаконом на образец, один флакон для измерения фона и один флакон для теста салфетки. Заполните флаконы 5 мл раствора сцинтилляции.
    2. Добавьте 10 кл/л каждого электорарадиового образца РНК в 1 флакон, затяните крышку и аккуратно перемешайте.
    3. Подготовьте флаконы теста салфетки. Тщательно руб ватные тампоны на всех поверхностях и оборудования, используемых во время протокола. Добавьте тампоны в флаконы, наполненные 5 мл раствора сцинтилляции, и затяните крышку.
    4. Запустите образцы на счетчике сцинтилляции следующим образом. Откройте капот, вставьте стойку в машину и закройте капот. Выберите граф ат-тач. Выберите пользовательскую программу. Выберите или создайте программу, которая измеряет тритий (3H) для 60 s. Hit Count Rack. Повторите сцинтилляцию рассчитывать три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование будет измерять количество сцинтилляции каждого образца и выход как на экране, так и на распечатку. Протокол можно приложить здесь при желании. Оставшиеся образцы РНК со ступени 2.3 должны быть заморожены при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
  5. Продолжить с авторадиограммы
    1. Подготовка и предварительно запустить мочевины денатурируя полиакриламид гель, как в шагах 1.11-1.20.
    2. Пипетка 20 л радиоактивного РНК-материала в новую трубку 1,5 мл, содержащую 20 л 2x гель-загрузочный буфер. Хорошо перемешать. Подготовьте лестницу как в шаге 1.21. Инкубировать образцы при 70 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
    3. Вымойте скважины геля еще раз непосредственно перед загрузкой образца. Нагрузка 20 зл и лестницы, 20 зл и 20 зл 1x Гель Загрузка буфера на оставшихся полосах. Выполнить гель при 100 В в течение 60-180 мин, в зависимости от процента полиакриламид.
    4. Как только гель заканчивает работу, удалите гель из кассеты и поместите его в коробку, содержащую 50 мл 1x буфера TBE с 5 Зл ультрачувствительных нуклеиновой кислоты гель пятно.
    5. Инкубировать в течение 5 минут на рокер, чтобы испачкать РНК.
    6. Аккуратно возьмите гель из коробки и поместите его на УФ-трансиллюнтор системы гель изображений с колодцами вверх и лестницей слева.
    7. Сосредоточьте камеру на гель, включите ультрафиолетовый свет, а затем принять изображение геля, подвергая от 50 мс до 1 с в зависимости от интенсивности сигнала.
    8. Выключите УФ-экспозицию и сохраните изображение в виде файла Tiff.
    9. Поместите гель обратно в коробку. Удалить TBE. Закрепите гель с 50 мл крепячего раствора (50% метанола, 10% уксусной кислоты, 40% ультра-чистой воды) в течение 30 минут при комнатной температуре на рокере.
    10. Аккуратно переместите гель снова в свежий черный ящик, содержащий 25 мл саморапривающего раствора. При отсутствии черного ящика накройте коробку алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света.
    11. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре на рокере.
    12. Аккуратно поднимите гель и поместите его лицом вниз на лист полиэтиленовой пленки с колодцами вверх и лестницей на правой стороне. Поместите два листа хроматографической бумаги на заднюю часть геля. Аккуратно переверните весь стек.
    13. Предварительно разогреть гель сушилку до 80 градусов по Цельсию. Отодвите пластиковую крышку на сушилке для геля. Вставьте пленку, гель и хроматографию бумаги стек под пластиковой крышкой и переместить пластиковую крышку обратно вниз, чтобы создать печать.
    14. Высушите 1 ч при 80 градусах По Цельсия в сушилке для геля.
    15. Выключите гель сушилку и аккуратно снимите стек. Удалите пленку и вторую хроматографической бумагу. Лента оставшихся хроматографии бумаги с высушенным гелем в авторадиограмме кассеты.
    16. Добавьте 1 лист ауторадиграфической пленки в темной комнате.
    17. Поместите кассету при -80 градусов по Цельсию и разработайте пленку через 1 ч до 4 недель в зависимости от интенсивности сигнала, о чем можно судить по ранее измеренным подсчетам мерцания: 1-4 недели для 250-1000 cpm, 24 ч до 1 недели для 1000-10000 cpm и 1 h до 24 h для М.
    18. После того, как фильм разработан, поместите пленку на верхней части кассеты и тщательно отметьте лабораторным маркером 4 края геля, каждый хорошо, и положение красителей XC и BB.
    19. Сканирование пленки на 300 или 600 пикселей на дюйм разрешение и сохранить изображение как файл Tiff.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Реакция транскрипции в пробирке
Рисунок 2 A представляет собой типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой РНК T7 7SK snRNA, которая является относительно короткой (331 nt) и высоко структурированной РНК. Как показано на этом исходном изображении, есть несколько нежелательных полос, как короче, так и дольше, чем 7SK, вероятно, в результате случайных транскрипционных событий инициации или прекращения. Из-за этого, очистка геля после реак...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в отношении конкретных транскриптов. Ассаи использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть тритиациарет на метилгруппы донора(рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител. Однако, важно отметить, что этот анализ не может указать, какие остатки или химической группы метилируется ферментом. Для выявления или проверки того, что конкретный остаток метилирован, другие...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Турью Канти Дебнатх за помощь в ChemDraw. Исследования в лаборатории Xhemal'e поддерживается Министерством обороны - Конгресс направлены медицинские исследования программы - Рак молочной железы Прорыв премии (W81XWH-16-1-0352), NIH Грант R01 GM127802 и запуск средств от Института сотовой и Молекулярная биология и Колледж естественных наук техасского университета в Остине, США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 b.p DNA LadderInvitrogen10821-01510 b.p DNA Ladder kit.
10% персульфат аммония (APS)Н/ДН/ДДля полиакриламидного геля для денатурации мочевины (Для 10 мл растворите 1 г в 8 мл воды milliQ; отрегулируйте объем до 10 мл с помощью воды milliQ; отфильтруйте раствор с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного 0,45 & микро; м).
10X TBE BufferN/AN/AДля денатурирующего мочевину полиакриламидного геля (Для 1 л добавьте 108 г трисового основания, 55 г борной кислоты в цилиндр с мешалкой; добавьте 800 мл дистиллированной воды и дайте раствориться; добавьте 40 мл 0,5 М Na2EDTA (pH 8,0); отрегулируйте объем до 1 л с помощью milliQ воды; отфильтруйте раствор с помощью 0,22&микро; м).
10 столовых ложекн/д/дДля 1 л добавьте 60,5 г Tris Base, 87,6 г NaCl в цилиндр с мешалкой; добавьте 800 мл дистиллированной воды и дайте раствориться; отрегулируйте pH до 7,5 с помощью концентрированной HCl; отрегулируйте объем до 1 л с помощью milliQ воды; отфильтруйте раствор с помощью 0,22 & микро; m filter. 
Акриламид: бис-акриламид 29:1 (40% раствор/электрофорез), биореагенты FisherBP1408-1Для мочевины денатурирующий полиакриламидный гель.
АДЕНОЗИЛ-L-МЕТИОНИН, S-[МЕТИЛ-3H]; (ЗРК[3H])Перкин ЭлмерNET155V250UCДля метилирования РНК in vitro; Концентрация = 1,0 мКи/мл; Удельная активность = 17,1 Ди/ммоль; Молярность =
(1,0 Ки/л)/(83,2 Ки/ммоль) = 0,0584 ммоль/л = 58,4 &микро;M.    После получения замороженной трубки 3H-SAM, разморозьте ее при температуре 4°С; С, 20 и микро; L aliquots, и заморозьте их при -30°C. Никогда не замораживайте повторно и не используйте частично использованную аликвоту.
Гиперкассетные кассеты для авторадиографии AmershamHealthcareRPN11649для экспонирования гелем на авторадиограмме.
Amersham Hyperfilm MPGE Healthcare28906846Для экспонирования гелем авторадиограммы.
Счетчик сцинтилляции BeckmanLS6500Для жидкостного сцинтилляционного подсчета.
Мини система горизонтального электрофореза Biorad1704466мини система горизонтального электрофореза.
cOmplete Mini EDTA-free Protage Inhibitor CocktailTablets Roche Applied Science4693159001Для раствора 20X растворите 1 таблетку в 0,525 мл воды, не содержащей нуклеазы.
Criterion CellBiorad345-9902РНКаза свободная пустая кассета для полиакриламидного геля.
Criterion пустые кассетыBiorad1656001Вертикальная ячейка для электрофореза миди формата.
DeNovix DS-11 Микрообъемный спектрофотометрDeNovixDS-11-SМикрообъемный спектрофотометр для измерения концентрации ДНК и РНК.
Ecoscint OriginalNational DiagnosticsLS-271Для жидкостного сцинтилляционного подсчета.
Fisherbrand 7 мл HDPE Сцинтилляционные флаконыFisher03-337-1Для жидкого сцинтилляционного подсчета.
Фтор-Ганс-Быстродействующий усилитель авторадиографииRPI CORP112600Для предварительной обработки гелем авторадиограммы.
Гелевая сушилкаBiorad1651745Для сушки геля.
Гелевый загрузочный буфер IIAmbionAM8547Для загрузки РНК в денатурирующий полиакриламид мочевинный гель (состав: 95% формамид, 18 мМ ЭДТА и 0,025% SDS, ксилолцианол и бромфеноловый синий).
Одноразовые насадки для иссечения геля GeneCatcherGel CompanyNC9431993Для удаления полос из агарозных и полиакриламидных гелей.
Megascript KitAmbionAM1333Для транскрипции in vitro с РНК-полимеразой Т7.
Perfectwestern Extralarge ContainerGenhunter CorporationNC9226382 (прозрачный)/ NC9965364 (черный)Коробка для окрашивания гелем.
pRZAddgene#27663Плазмида для получения транскриптов in vitro с однородными концами
Qiagen RNeasy MinElute CleanupQiagen74204Для очистки РНК используйте модифицированный протокол, предусмотренный в протоколе.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704Набор для экстракции геля и очистки фрагмента дцДНК, используемого для транскрипции in vitro.
Saran Premium Plastic Wrap SaranWrapAmazonДля сушки геля.
SYBR GoldInvitrogenS11494Ультрачувствительный гель для нуклеиновых кислот.
SYBR SafeInvitrogenS33102Гель-краситель для нуклеиновых кислот.
TESigma93283-100ML10 мМ Tris-HCl, 1 мМ динатрия ЭДТА, pH 8,0
TEMEDFisher110-18-9Для мочевины денатурирующий полиакриламидный гель.
Термомиксер с SMARTBLOCK 24X 1,5 мл TUBESeppendorf5382000023/5361000038Для инкубации пробирок объемом 1,5 мл с регулируемой температурой.
TOPO TA Cloning KitLife technologiesНаборы для быстрого клонирования Taq-полимеразы; амплифицировали продукты ПЦР в векторы, содержащие промоторы T7 и/или SP6 для транскрипции РНК in vitro.
ТУРБО ДНКаза (2 U⁄ &микро; L)AmbionAM2238Для удаления ДНК из реакций транскрипции in vitro.
МочевинаSigma51456-500GДля мочевины денатурирующий полиакриламидный гель.
Ватман 3мм бумагаGE Healthcare3030-154Хроматографическая бумага для сушки геля.
н GE

Ссылки

  1. Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
  2. Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).
  3. Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
  4. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  5. Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
  6. Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
  7. Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
  8. Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
  9. Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
  10. Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
  11. Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
  13. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).
  14. Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
  15. Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
  16. Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
  17. Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).
  18. Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
  19. Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
  20. Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitro
Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.