Мы представляем протокол для изолировать первичные фибробласты для взрослых простым, быстрым и надежным способом, выполняемым новичками (например, студентами). Процедура сочетает в себе ферментативное пищеварение тканей и механическое возбуждение с ультразвуковыми волнами для получения первичных фибробластов. Протокол можно легко адаптировать к конкретным экспериментальным требованиям (например, к тканям человека).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ультразвуковое дополненное первичное взрослое фибробластновая изоляция
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные фибробласты для взрослых стали важным инструментом для изучения фиброза, взаимодействия фибробластов и воспаления во всех тканях организма. Поскольку первичные фибробласты не могут делиться бесконечно из-за дифференциации миофибробластов или индукции сенесценции, необходимо регулярно устанавливать новые культуры. Однако в ходе процессов разработки надежного протокола изоляции и первичной изоляции фибробластов существует несколько препятствий: степень сложности метода (особенно для начинающих), риск бактериального загрязнения, требуется время, пока первичные фибробласты могут быть использованы для экспериментов, и последующее качество клеток и жизнеспособность. В этом исследовании, быстрый, надежный и простой в освоении протокол для изоляции и культуры первичных взрослых фибробластов от мыши сердца, легких, печени и почек сочетания ферментативного пищеварения и ультразвукового возбуждения предоставляется.
Введение
Фибробласты плоские, шпиндель-образные клетки с несколькими процессами стеллатаи обширным грубым эндоплазмическим ретикулумом 1,2. Средний фибробласт измеряет 30 - 100 мкм и имеет продолжительность жизни 57 и 3 дня1,3. Средняя продолжительность клеточного цикла фибробластов человека колеблется от 16до 48 ч в зависимости от условий культуры 4. Имеются данные, свидетельствующие о том, что репликационные возможности и функциональное качество культивируемых первичных фибробластов негативно коррелирует с возрастом донора, что позволяет по возможности предпочесть более молодых доноров (животных или пациентов) по возможности5,6 .
Фибробласты представляют собой преобладающий клеточный тип большинства тканей тела млекопитающих. Несмотря на их повсеместное присутствие, молекулярная идентификация фибробластов по-прежнему является проблемой7. Фибробласты мигрируют к развивающимся тканями органам из разных источников во время эмбрионального развития 8. По этой причине, есть множество маркерных белков, которые могут быть найдены в фибробластах, в то время как уникальные маркерные белки, которые присутствуют в каждой популяции фибробластов и эксклюзивные для фибробластов, по-прежнему отсутствуют. Таким образом, для идентификации фибробластов обычно используются шаблоны выражения нескольких распознаваемых маркеров. Среди наиболее узнаваемых маркеров – виментин, белок поверхности фибробласта человека (hFSP), рецептор домена дискоидин 2 (DDR2) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА).
Фибробласты являются основным внеклеточным матричным (ECM)- производящим тип клетки. Таким образом, фибробласты поддерживают упорядоченную архитектуру тканей и обеспечивают механическую поддержку соседних клеток1. Баланс между синтезом ECM и деградацией является хорошо регулируемым процессом. Сдвиги в сторону синтеза знаменуют собой начало чрезмерного осаждения ECM, которое, если не прекращается, приводит к фиброзу. Фиброз опосредовано миофибробластами, которые происходят из активированных фибробластов, претерпеваемых молекулярными и фенотипическими изменениями. Одной из отличительных черт миофибробластов является усиленная секреция ЭКМ и цитокинов и выражение упорядоченных микрофиламентов9.
Первичные фибробласты были в центре внимания последних исследований упором на фиброз, воспаление тканей и фибробласт-рак-клеток взаимодействий10,11. Однако, чтобы эффективно изучать фибробластные свойства в здоровье и болезни, необходимо изолировать жизнеспособные первичные фибробласты взрослого на регулярной основе. Есть несколько методов, доступных для изоляции фибробластов12,13,14. Три основных метода фибробластной изоляции являются выращение из тканей куски12,ферментативное пищеварение ткани15, и ферментативной перфузии полых органов9,13,16. Преимуществом роста является мягкий процесс изоляции без ферментативной деградации клеток. С другой стороны, культуры роста обычно требуют длительных периодов культуры, пока клетки могут быть использованы для экспериментов. Общее ферментативное пищеварение быстро, но несет риск заражения другими типами клеток (например, эндотелиальными клетками) или бактериями в процессе агитации, что необходимо для механического растворения ткани. Кроме того, эти методы часто являются сложными и требуют времени и навыков, чтобы узнать.
Что касается важности первичных фибробластов в исследованиях, то по-прежнему существует необходимость оптимизации существующих подходов к изоляции клеток с точки зрения быстроты, простоты и надежности. Здесь предоставляется новый ультразвуковой метод ферментатической изоляции фибробластов, обеспечивающий высокое качество клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Следующий протокол следует институциональным руководящим принципам по уходу за животными ВДШТовского университета, Германия (Номер файла: T 2014/4), а также международно признанным руководящим принципам по уходу за животными (FELASA)17. Рисунок 1 визуализирует процесс изоляции клеток.
1. Подготовка установки, материалов и средств массовой информации
- Подготовка среды клеточной культуры, раствор PBS, коллагенеза смесь бульона решение (восстановить 50 мг лиофилизированной коллагеназе смесь в 12 мл стерильной ультрачистой воды), и 0,25% трипсина раствора.
- Разогрейте среду, PBS и раствор трипсина до 37 градусов по Цельсию.
- Разогреть ультразвуковую водяную ванну до 37 градусов по Цельсию.
- Дезинфицирующие щипцы, шпатель из нержавеющей стали, скальпели (2x скальпеля на орган) и 2 стеклянных стакана с 70% этанола и поместите эти материалы под капот клеточной культуры.
- Заполните один стакан с 70% этанола, а другой стерильной водой или РАСТВОРом PBS. Эти клювы необходимы для дезинфекции и мыть прибор после каждого органа процессии.
- Поместите стерильные пластиковые трубки 15 мл, содержащие холодные PBS, на мокрый лед. Количество труб зависит от количества органов, от которых вы хотите изолировать фибробласты.
2. Рассечение мышей и удаление органов
- Носите две пары перчаток один над другой, так что первая пара может быть удалена, как только животное было вскрыто.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предотвращает распространение бактерий из меха и кожи животного по органам. - Эвтанизировать мышь (например, вывих шейки матки) и прикрепить тушу с помощью иглки к каждой конечности к полистироловой площадке.
- Дезинфекция туши мыши с помощью 70% этанола спрей. Убедитесь, что мех пропитан этанолом, чтобы волосы не закружились.
- Вырежьте мех прямо над урогенитальным трактом с помощью хирургических щипц и травматических ножниц. Вырежьте кожу рядом со средней линией от точки первоначального разреза до шеи (3 - 4 см) и добавьте рельефные порезы на конечностях.
ВНИМАНИЕ: Не перфорировать мышечный слой на этом этапе, чтобы избежать бактериального загрязнения! - Прикрепите кожу к прокладке пены полистирола, чтобы иметь оптимальный доступ к мускулатуре, покрывающей брюшную полость.
- Дезинфекция мускулатуры брюшной полости дважды с помощью 70% этанола. Пусть этанол высохнет, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Снимите первую пару перчаток. Используйте новый стерильный набор щипц и ножниц.
- Откройте брюшную полость и грудную клетку, разрезая мышечный слой хирургическими ножницами, чтобы аккуратно удалить органы по выбору. Поэтому держите орган осторожно хирургическими щипками (не прокалывайте орган, используйте минимальное давление) и разрезайте поставляя кровеносные сосуды возле точки входа в орган ножницами.
- Положите органы в стерильные трубки, содержащие холодные PBS. Закройте трубки плотно. Поместите трубки на мокрый лед до тех пор, пока не продолжитес шаг 3.1.
3. Тканевая обмокание, пищеварение и извлечение клеток
- Перенесите трубки под стерильный капюшон культуры клеток.
ВНИМАНИЕ: Носите новую пару перчаток и дезинфицировать трубки с 70% этанола перед передачей их под капотом! - Вынизуйте орган из трубки 15 мл с помощью стерильных щиптов. Поместите орган на половину стерильной 6 см Петри блюдо и мыть орган кратко с PBS, чтобы удалить избыток крови. Перенесите орган во вторую половину чашки Петри, удалите избыток PBS.
- Фарш ткани с помощью двух стерильных скальпелей. Остальные фрагменты ткани не должны быть больше 1 - 2 мм.
- Перенесите измельченную ткань в новую стерильную трубку 15 мл с помощью стерильного шпателя и добавьте 2 мл раствора трипсина 0,25%. Поместите трубку в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Вихрь трубки мягко (около 1400/мин) в течение 10 с.
- Остановите реакцию трипсина под капотом клеточной культуры, добавив 4 мЛ FCS-содержащей среды клеточной культуры (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), например).
- Добавьте 250 зЛ раствора смеси коллагеназа к каждой трубке, содержащей ткани сердца или легких, и 100 Л л для почек или печени, соответственно.
- Поместите трубки в ультразвуковую водяную ванну (37 градусов по Цельсию) и активируйте ультразвуковой звуковой элемент в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковая водяная ванна, используемая в этом протоколе, имеет операционную частоту 35 кГц и максимальную мощность 320 Вт. - Вихрь трубки мягко (около 1400/мин) в течение 10 с.
- Поместите трубки снова в ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут.
- Вихрь мягко (около 1400/мин) на 10 с.
- Дезинфекция труб с 70% этанола и передать их под стерильным капюшоном культуры клеток.
- Фильтр раствора с 40 мкм сетки в новую стерильную трубку 15 мл.
- Центрифуга трубки на 500 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и resuspend гранулы в 1 мл свежей среде.
- Перенесите клетки в подходящий сосуд клеточной культуры (например, 6-ну хорошо пластины) и поместите сосуд в инкубатор клеточной культуры на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
- На следующий день удалите среду, промойте 3 раза PBS, затем добавьте свежую среду (добавленный объем зависит от сосуда клеточной культуры выбора, 2 мл на колодец 6-хорошей пластины и т.д.).
- Изменение среды через день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты могут быть разделены после достижения оптического слияния 90% (обычно через 5-7 дней).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Была продемонстрирована способность этого протокола изолировать взрослые фибробласты из твердой ткани мурин. Были получены жизнеспособные фибробласты, которые могут быть использованы для последующих экспериментов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание или эксперименты по распространению(рисунок 2D-F, Рисунок 5A).
Взрослые фибробласты являются плоскими шпиндель-образными клетками с несколькими кле...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
По сравнению с увековеченными фибробластными клеточными линиями, первичные фибробласты предлагают несколько преимуществ. Они могут быть изолированы экономически эффективно в высоком качестве и количестве. Кроме того, первичные культуры предлагают возможность изучения клеток у нескольких людей, что повышает надежность полученных результатов и снижает вероятность простого изучения артефактов клеточной культуры. Непрерывное генерация новых первичных культур предотвращает генетические изменения, которые обычно происходят пос...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликта интересов объявлять не существует.
Благодарности
Мы благодарим г-жу Роми Кемпе и г-жу Аннетта Опица за экспертную техническую поддержку. Мы также благодарим г-на Бьорна Бинневерга за ИТ-поддержку. Эта работа была поддержана грантами от а) Фюрдеркрейс Дрезднер Херц-Крейслауф-Таге е.В., б) "Хабилитацииффдердерпрограмма фюр Фрауэн", Медицинский факультет Карл Густав Карус Дрезден и с) Эльза Крюнер-Форшунгсколлег (EKFK) Факультет медицины КарлА Гюрюна Карус Дрезден. Мы признательны за финансирование и поддержку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% Трипсин-ЭДТА | Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США | Антибиотики T4049-100ML | |
| Gibco-Life Technologies, Карлсбад, США | Gibco LS15140148 | Пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | |
| Колпак для клеточных культур | Thermo Fisher Scientific, Waltham, США 51023608 | HeraSafe KSP15 | |
| Инкубатор для клеточных культур | Thermo Fisher Scientific, Waltham, США 50049176 | BBD 6220 | |
| Планшеты для клеточных культур | Thermo Fisher Scientific, Waltham, США | зависит от емкости | 6-, 12-, 24-лунки Nunclon поверхностный |
| Всасывание клеточной культуры | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Вертхайм, Германия | 20727400 | Профессиональное |
| сетчатое фильтр для аспирационных ячеек BVC (сетка) | Corning, Tewksbury, США | 431750 | 40 &микро; m Нейлоновая |
| центрифуга | Thermo Fisher Scientific, Waltham, США 75007213 | Megafuge 8R | |
| Беспроводной контроллер дозирования | Hirschmann, Eberstadt, Германия | 9907200 | Pipetus |
| Одноразовые наконечники для пипеток | Sigma-Aldrich, St. Louis, США | зависит от объема | Наконечники SafeSeal для пипеток (10 & микро; L, 20 и микро; L, 100 & микро; L, 200 & микро; L, 1000 & микро; L) |
| Одноразовые пластиковые пипетки | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США | зависит от объема | 5 мл, 10 мл, 25 мл, 50 мл |
| Одноразовый стерильный скальпель | Myco Medical, Кэри, США | n.a.Techno | cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США | 41965-062 | Высокоглюкозные |
| трубки Eppendorf | Eppendorf, Гамбург, Германия | Зависит от объема | 50 & микро; L, 500 & микро; L, 1.500&микро; L, 2.000 &; L |
| Фетальная сыворотка теленка (FCS) | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США | F2442-50ML | |
| Коллагеназная смесь | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США 5401020001 | Liberase TL Research Grade | |
| чашка Петри 6 см | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США | P5481-500EA | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США | D8537-500ML | 500 мл |
| Набор для обнаружения старения | Abcam, Кембридж, Великобритания | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Штауфен им Брайсгау, Германия | n.a.MS2 | Minishaker (последующая модель: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Стерильные пластиковые трубки | Thermo Fisher Scientific, Waltham, США | трубки Falcon 352095 | BD Falcon (15 мл, 50 мл) |
| Ультразвуковая водяная баня | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Берлин, Германия | 312 | Sonorex RK100H |
| Хирургические ножницы (атравматические) | Aesculap AG, Туттлинген, Германия | NR 82 | |
| Хирургические ножницы | Aesculap AG, Туттлинген, Германия | eq 1060.09 | |
| Хирургические щипцы | Aesculap AG, Туттлинген, Германия | BD577 |
Ссылки
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098(2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
