Оценка минеральной доступности в кормах для рыб с использованием дополнительных методов, продемонстрированная на примере цинка в атлантическом лососе

Summary

В данной статье подробно объясняется системный подход к оценке наличия микроминеральности у атлантического лосося. Методология включает в себя инструменты и модели с возрастающей биологической сложностью: (1) химический анализ видообразования, (2) растворимость in vitro, (3) исследования поглощения в клеточных линиях и (4) исследования in vivo рыб.

Abstract

Оценка доступности диетических микроминералов является серьезной проблемой в минеральном питании видов рыб. Целью настоящей статьи является описание системного подхода, сочетающего различные методологии оценки доступности цинка (Zn) в атлантическом лососе(Salmo salar). Учитывая, что несколько химических видов Zn могут присутствовать в корме атлантического лосося, было выдвинуто предположение, что доступность Zn зависит от химических веществ Zn, присутствующих в корме. Таким образом, в данном исследовании первый протокол касается того, как извлечь различные химические виды Zn из корма и проанализировать их методом масс-спектроскопии плазмы с индуктивно-индуктивно связанной плазменной (SEC-ICP-MS) с помощью исключения размеров. Впоследствии был разработан метод in vitro для оценки растворимости диетического Zn в кормах атлантического лосося. Третий протокол описывает метод изучения влияния изменения химического видового состава Zn на поглощение Zn в модели эпителия кишечника рыбы с использованием клеточной линии кишечника радужной форели (RTgutGC). Вместе результаты методов in vitro сравнивались с исследованием in vivo, изучающим очевидную доступность неорганических и органических источников Zn, добавляемых в корма атлантического лосося. Результаты показали, что в кормах можно найти несколько химических видов Zn, и эффективность органического источника Zn очень сильно зависит от аминокислотного лиганда, используемого для хелатного Zn. Результаты методов in vitro имели меньшую корреляцию с результатом исследования in vivo. Тем не менее, протоколы in vitro, описанные в этой статье, предоставили важную информацию о наличии Zn и его оценке в кормах для рыб.

Introduction

Рыбная мука и рыбий жир традиционно использовались в кормах для атлантического лосося. Однако эти ингредиенты все чаще заменяются растительными ингредиентами¹. Вышеупомянутый сдвиг в составе кормов привел к низкой диетической доступности и увеличению потребности в улучшении минеральной доступности в кормах для атлантического лосося, особенно цинка (Zn)^2. Снижение доступности может быть результатом изменения уровня Zn, химических веществ Zn и/или антипитательных факторов, присутствующих в матрице корма. В этом сценарии появился новый набор добавок, которые в целом считаются «органическими источниками», которые могут стать более доступным источником диетических минералов для рыбы. Поэтому важно понимать фундаментальную химию и физиологию, регулирующие доступность минералов и их источников для рыб. Цинк является важным микроэлементом для всех живых организмов³. Роль Zn как сигнальной молекулы была описана как на параклеточном, так и на внутриклеточном уровне у рыб^4. У атлантического лосося дефицит Zn был связан со скелетными аномалиями и снижением активности различных металлоферментов^{Zn 5,6.}

Это исследование описывает систематический подход к пониманию доступности Zn путем его классификации на четыре различных отдела различной химической и биологической сложности. Используемые методы описаны в четырех разделах, как видно на фиг.1: (1)оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося с использованием размерно-исключающей хроматографии с индуктивно связанной плазменной масс-спектроскопией (SEC-ICP-MS) метод^7; (2) растворимость in vitro дополненного Zn в корме для атлантического лосося; (3) оценка поглощения химических веществ Zn кишечной моделью in vitro (RTgutGC)^8; и (4) очевидная доступность Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)^9. Аналогичные протоколы могут быть разработаны для других минералов (например, марганца, селена, меди), представляющих питательный интерес для видов рыб аквакультуры.

Protocol

Испытание кормления в разделе 4 проводилось в соответствии с норвежским (FOR-2015-06 - 18-761) и европейским законодательством (Директива 2010/63/EU).

1. Оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося методом SEC-ICP-MS

1. Экстракционный буфер (100 мМ Tris-HCl, pH 8,5)
   1. Готовят экстракционный буфер путем растворения соответствующего количества трис(гидроксиметил)аминометана для достижения желаемой ионной силы (100 мМ) в сверхчистом_H2O.
   2. Отрегулируйте pH раствора до pH 8,5 с раствором HCl, контролируя изменение pH с помощью pH-метра.
2. Подготовка образцов кормов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный образец корма был составлен на основе коммерческих кормов для атлантического лосося, содержащих источники белка в основном из растительных ингредиентов (т.е. приблизительно 5% рыбьего белка, 10% рыбьего жира, 68% растительного белка и 12% растительного масла). Сульфат цинка добавляли в корм.
   1. Измельчите образец корма вручную с помощью пестиков и ступки.
   2. Просеиваем образец корма, чтобы гарантировать, что экстракция выполняется в кормовой фракции с аналогичным размером частиц (от 850 мкм до 1,12 мм).
   3. Приступайте к извлечению Zn.
3. Извлечение цинка из образца корма
   1. Взвесите приблизительно 0,5 г корма в трехместных пробирках по 15 мл.
   2. Добавьте к образцам буфер экстракции (5 мл 100 мМ Tris-HCl, рН 8,5).
   3. Извлекайте образцы в ротаторе (20 об/мин) при 4 °C в течение 24 ч.
   4. Отделяют растворимые и нерастворимые фракции центрифугированием в течение 10 мин при 3000 х г.
   5. Используйте одноразовый шприцевой фильтр 0,45 мкм для фильтрации растворимой фракции.
   6. Перенесите отфильтрованные образцы в чистые пробирки.
   7. Выполните анализ видообразования Zn в растворимых фракциях с использованием SEC-ICP-MS, как описано в шаге 1.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое описание процедуры извлечения Zn из образца корма описано на рисунке 2.
4. Раствор подвижной фазы (50 мМ Tris-HCl + 3% MeOH, рН 7,5)
   1. Готовят раствор подвижной фазы, растворяя 6,057 г трис(гидроксиметил)аминометана в 1 л 3% раствора MeOH (v/v).
   2. Отрегулируйте pH раствора до pH до 7,5 с помощью раствора HCl, контролируя изменение pH с помощью рН-метра.
   3. Фильтруйте раствор подвижной фазы через мембранный фильтр 0,45 мкм.
5. Калибровка молекулярной массы диапазона разделения колонн SEC
   1. Откалибруйку диапазона разделения, выполнив калибровку молекулярной массы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовались тиреоглобулин (660 кДа), супероксиддисмутаза Zn/Cu (32 кДа), миоглобин (17 кДа) и витамин B12 (1,36 кДа).
   2. Готовят каждый из эталонов с известной концентрацией в сверхчистом_H2O.
   3. Приготовьте флакон с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), добавив во флакон 250 мкл стандартного образца.
   4. Загрузите флаконы со стандартами для последовательного выполнения образцов.
   5. Выполните калибровку молекулярной массы в начале и в конце аналитической последовательности, контролируя ¹²⁷I (тиреоглобулин), ⁶⁶Zn (супероксиддисмутаза Zn / Cu), 57 Fe (миоглобин) и ⁵⁹Co (витамин B12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка молекулярной массы выполняется одновременно с анализом видообразования Zn.
6. Анализ видообразования цинка с использованием SEC-ICP-MS
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ видообразования Zn методом SEC-ICP-MS был разработан на основе принципов, описанных в других разделах^10,11, и дальнейшая оптимизация была выполнена для анализа корма для атлантического лосося^7.
   1. Выполните анализ видообразования Zn на растворимых фракциях с помощью колонки исключающей хроматографии (SEC) и ВЭЖХ в сочетании с масс-спектроскопией плазмы с индуктивно связанной (ICP-MS).
   2. Приготовьте флакон вэжх, добавив во флакон 250 мкл растворимой фракции.
   3. Перед анализом дополняйте все образцы 0,5 мкл витамина B12. Этот шаг позволяет корректировать время удержания сдвигов, контролируя ⁵⁹Co.
   4. Разбавить растворимую фракцию экстракционным буфером (100 мМ Tris-HCl, рН 8,5) и довести до конечного объема 1 мл.
   5. Подготовьте последовательный запуск образцов в случайном порядке.
   6. Настройте ICP-MS в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Следуйте настройкам приборов для ВЭЖХ и ICP-MS, выполняющих анализ видообразования Zn (см. таблицу 1).

2. Растворимость in vitro дополненного Zn в корме для атлантического лосося

ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный образец корма был составлен на основе коммерческих кормов для атлантического лосося, содержащих источники белка в основном из растительных ингредиентов (т.е. приблизительно 5% рыбной муки, 10% рыбьего жира, 68% растительных ингредиентов и 12% растительного масла).

1. Измельчите образцы корма для атлантического лосося в течение 10 с при 3000 об/мин с помощью ножевой мельницы и храните при 4 °C до дальнейшего анализа.
2. Взвесьте ~0,2 г образцов подачи, измельченных на этапе 2.1, и добавьте радиоинследователь Zn⁽⁶⁵Zn) известной удельной активности в пробочку объемом 5 мл (с колпачком).
   ВНИМАНИЕ: Эта процедура должна выполняться внутри радионуклидного набора. Человек, выполняющий этот шаг, должен быть обучен и сертифицирован для работы с радиоизотопами. Необходимо строго соблюдать меры безопасности и предосторожности, рекомендованные администрацией радиационной безопасности института.
3. Затем готовят пресноводный кишечный просветный буферный раствор, как описано ниже.
   1. Для солевого раствора А взвесьте 11,65 г NaNO_3,0,55 г KNO₃ и 0,4 г MgSO_4. Растворите соли в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 60 мл.
   2. Для солевого раствора B взвесьте 0,31 г Ca(NO₃₎₂· _{4 4 H2}O. Растворите соли в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 10 мл.
   3. Используйте 500 мМ раствора HEPES в качестве раствора соли C.
   4. Для солевого раствора D взвесьте 1,2 г_MgCl2,растворите соль в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 20 мл.
   5. Для солевого раствора Е взвесьте 0,9 г MgSO_4,растворите соль в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 20 мл.
   6. Готовят раствор пирувата, растворяя 0,55 г CH₃COCOONa в 10 мл сверхчистого_H2O.
   7. Растворить 0,9 г галактозы_(С6Н12О₆₎в сверхчистом_Н2О.
   8. Хорошо растворяют с помощью магнитной мешалки и стерилизуют растворы солей A, B, D и E путем автоклавирования, а раствор С, пируват и галактозу фильтрацией через шприцевой фильтр 200 мкм.
   9. После приготовления различных бульонных растворов, чтобы приготовить 100 мл рабочего раствора буфера, смешать вышеуказанные приготовленные растворы в следующей пропорции: 6,8 мл солевого раствора А, 4,14 мл В, 5 мл С, 2,5 мл D, 1,5 мл Е и 1,14 мл пирувата и галактозы. Внесите объем до 100 мл с помощью деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный выше буфер теперь будет представлять ионный состав кишечного просвета, обнаруженного у пресноводных лососевых.
4. Подготовьте шесть других аликвот буфера, описанного на этапе 2.6, и добавьте одну из следующих аминокислот (цистеин, метионин, глицин, гистидин, лизин и аргинин) для достижения конечной молярной концентрации 5 мМ.
5. Добавьте к образцу корма просветный буфер пресной воды кишечника (реакционный объем = 3 мл; рН 7,4).
6. Повторите этап 2.5 с буферами, описанными в 2.4 (в присутствии различных аминокислот в концентрации 5 мМ).
7. Закройте трубки и дайте им вращаться во вращательном спиннере в течение 30 минут при 25 оборотах в минуту.
8. Отделяйте растворимые и нерастворимые фракции центрифугированием в течение 10 мин при 1157 х г.
9. Используйте гамма-кассер для измерения количества в минуту (cpm) ⁶⁵Zn в растворимых и нерастворимых фракциях.
10. Рассчитайте долю радиоизотопов Zn⁽⁶⁵Zn), присутствующих в растворимых и нерастворимых фракциях.

3. Оценка поглощения химических веществ Zn с использованием кишечной модели in vitro (RTgutGC)

1. Культура клеток RTgutGC
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все рабочие материалы, используемые на этом этапе, должны быть стерильными.
   1. Осторожно оживите замороженные клетки RTgutGC на водяной бане при температуре 20 °C.
   2. Аккуратно вылейте в пипетку раствор, содержащий клетки, и суспендируйте их в 10 мл среды L15, содержащей 10% фетальной бытовой сыворотки (FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10% FBS используется только для восстановления замороженных клеток. Для последующего прохождения используется FBS на уровне 5%. Состав ФБС может варьироваться между партиями, поэтому желательно покупать и запасать столько, сколько требуется из одной партии, чтобы избежать межсерийных вариаций в составе сыворотки.
   3. Добавьте клеточную суспензию в колбы для 75^см2 культуры клеток и инкубируют в инкубаторе, установленном при 19 °C при нормальной атмосфере.
   4. Проверяют клетки и при слиянии (80% слияние, оценивают визуально, исследуя плотность клеточной поверхности под микроскопом), расщепляют клетки на новые колбы (последующее прохождение) или собирают урожай для использования в экспериментах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример клеток RTgutGC через 1 ч и 1 неделю после посева в колбы для культивирования клеток показан на фиг.3.
2. Сбор клеток и подготовка к экспериментам по воздействию
   1. Дважды промыть клетки раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 1 мл. После каждой промывки выкачивайте раствор ЭДТА с помощью стерильной всасываемой трубки.
   2. Обработайте клетки трипсином (0,7 мл трипсина, в 0,25% в фосфатно-буферном физиологическом растворе [PBS]).
   3. Осторожно поверните колбу под острыми углами, чтобы распределить трипсин по всей поверхности колбы.
   4. Продолжайте вращение в течение 2 мин, пока клетки отсоеся.
   5. После осторожного вращения в течение 2 мин добавьте 10 мл среды L15/FBS для нейтрализации трипсина.
   6. Декантированную клеточную суспензию в коническую нижнюю центрифужную трубку с помощью стерильной пипетки и центрифуги в течение 3 мин при 130 х г.
   7. Определить плотность собранных клеток можно методом ручного подсчета с помощью гемоцитометра.
   8. Добавьте необходимый объем среды L15/FBS для достижения плотности ячейки 5 x 10⁴ ячеек/мл.
   9. Засеять клетки на пластины из 24 скважин путем пипетирования 1 мл клеточной суспензии на скважину для достижения конечной плотности клеток 5 х 10⁴ ячейки / скважина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать мультираздаточные пипетки, чтобы свести к минимуму вариации и сократить время.
   10. Поместите семенные пластины в инкубатор при нормальной атмосфере при 19 °C в течение 48 ч перед экспериментами.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин хранить при -20 °C; Раствор ЭДТА и среда L15/FBS при 4 °C. Отрегулируйте температуру всех рабочих растворов и сред до 19 °C непосредственно перед использованием.
3. Подготовка экспозиционной среды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен под вытяжным капотом в асептических и стерильных условиях.
   1. Готовят L15/ex путем смешивания 6,8 мл солевого раствора А (этап 2.3.1), 1,14 мл В (этап 2.3.2), 5 мл С (этап 2.3.3) и 1,14 мл пирувата (этап 2.3.6) и галактозы (этап 2.3.7). Внесите объем до 100 мл с помощью дистиллированной воды класса стерильной клеточной культуры.
   2. Готовят FW путем смешивания 6,8 мл солевого раствора A (2.3.1), 4,14 мл B (2.3.2), 5 мл C (2.3.3), 2,5 мл D (2.3.4), 1,5 мл E (2.3.5) и 1,14 мл пирувата (2.3.6) и галактозы (2.3.7). Внесите объем до 100 мл с помощью стерильной дистиллированной воды клеточной культуры.
   3. Количественная оценка концентраций ионов в средах воздействия с использованием МСП-МС, как описано в другом месте^12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируемые концентрации ионных веществ в препаратах сред представлены в таблице 2.
4. Анализы притока цинка⁽⁶⁵Zn)
   1. Высевают ячейки RTgutGC на пластины из 24 скважин (5 x 10⁴ ячейки/лунка) в полную среду L15/FBS.
   2. Инкубировать в течение 48 ч в инкубаторе с нормальной атмосферой при 19 °C.
   3. Довести все экспериментальные препараты среды до рН 7,4 с использованием 0,5 М NaOH в присутствии или отсутствии L-метионина (L-Met) или DL-метионина (DL-Met) при концентрации 2 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка рН буферов, описанная в разделе 3.4.3, должна быть выполнена заново перед обработкой клеток на этапе 3.4.5.
   4. После завершения инкубационного периода удалите среду из колодцев и тщательно промойте ПБС.
   5. Добавьте экспериментальную жиму FW с поправкой на pH и дайте акклиматизироваться в течение 20 мин.
   6. Подвергайте клетки RTgutGC воздействию номинальных концентраций 3,07, 6,14, 12,27 и 24,55 мкМ ⁶⁵Zn(II) (как ZnCl_2;~4 кБк/мл) в средах, описанных на этапе 3.4.3.
   7. Сразу после этого держите клетки в инкубаторе при 19 °C в течение 15 минут.
   8. После того, как 15-минутная инкубация закончится, аспирируют супернатант культуры и удаляют из лунки.
   9. Промыть клетки ледяной холодной средой FW (с 200 мкМ Zn, рН 7,4), а затем закалить, добавив 5 мМ этиленгликоля-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA) буфер (рН 7,4) в течение 5 мин, чтобы избавиться от любых адсорбированных ⁶⁵Zn(II).
   10. Подвергают клетки воздействию вышеуказанных сред препаратов в присутствии или отсутствии 10 мМ 2-Аминобицикло [2.2.1]гептан-2-карбоновой кислоты (БКГ), ингибитора транспорта аминокислот.
   11. После периода воздействия 15 мин повторите шаги 3.4.8 и 3.4.9.
   12. Ячейки RtgutGC будут прилипать к дну скважин в виде монослоя. Переваривайте клетки, используя 0,2% горячее моющее средство додецилсульфата натрия (SDS) (100 мкл / хорошо).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием раствор SDS необходимо поместить на 1 ч в водяную баню, установленную на 90 °C.
   13. Аспирировать и восстановить клеточный дигестат в пробирку объемом 1,5 мл.
   14. Измерьте радиоактивность клеточных перевариваемых с помощью гамма-счетчика.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Количество в минуту (cpm) должно быть скорректировано на радиоактивный распад, фоновую активность и подвергнуто расчетам конкретной активности в соответствии с формулами, описанными Гловером и Хогстрандом^13.
   15. Чтобы количественно оценить концентрацию белка в клетках, гомогенизируйте клетки с 500 мкл 0,5 M NaOH.
   16. Используйте набор для анализа Брэдфорда для измерения концентрации белка в образце клетки, с бытовым сывороточным альбумином (BSA) в качестве стандарта.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Как только концентрация белка количественно определена, скорость поглощения Zn клетками RTgutGC может быть выражена в виде пмоле Zn мин^-1 мг^-1 белка.

4. Кажущаяся доступность диетического Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)

ПРИМЕЧАНИЕ: Корма для атлантического лосося были разработаны на основе коммерческих кормов, содержащих источники белка в основном из растительных ингредиентов (т.е. примерно 5% рыбьего белка, 10% рыбьего жира, 68% растительного белка и 12% растительного масла). Два корма были дополнены неорганическим источником (сульфат Zn) или органическим источником (хелат Zn глицина) для достижения концентрации Zn 150 мг/кг корма. Кроме того, оксид иттрия (кормовой сорт) добавляли в корм под 0,01% в качестве инертного маркера, чтобы можно было рассчитать коэффициент кажущейся доступности.

1. Акклиматизируйте атлантического лосося (штамм SalmoBreed, возраст 1+ лет, смешанные половые группы) в соответствующих аквариумах до тех пор, пока рыба не будет использована в экспериментальных условиях.
2. Оцените акклиматацию атлантического лосося, контролируя его ежедневное потребление корма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это испытание проводилось в тройных танках, таким образом, было использовано в общей сложности шесть танков. Во время испытания кормления температура воды составляла 11,9 ± 0,3 °C, а насыщение растворенным кислородом составляло 101 ± 5%.
3. Кормите рыб экспериментальными кормами в течение 11 дней.
4. Усыпить рыбу путем передозировки, используя 6 мл раствора трикаина метансульфоната на литр воды.
5. Соберите объединенный образец кала рыбы из того же аквариума в тарелку, перемещая от вентрального плавника к анусу.
6. Удалите кал из пластины шпателем в коническую трубку 50 мл и немедленно храните образцы при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы хранились при -20 °C до дальнейшего анализа.
7. Сублимационная сушка образцов кала в течение 72 ч при -80 °C.
8. Вручную гомогенизируйте образец кала в мелкий порошок с использованием пестиков и ступки.
9. Определить концентрацию Zn и иттрия в образцах кормов и фекалий с помощью ICP-MS (как описано в другом месте^9).
10. Определите коэффициент кажущейся доступности (AAC, %) по следующей формуле:
    

Results

Оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося с использованием метода SEC-ICP-MS
Метод SEC-ICP-MS предоставляет данные о химических видах Zn, обнаруженных в растворимой фракции корма атлантического лосося. На фиг.4 показан хроматографический профиль Zn, обнаруженный в растворимой фракции. Эта хроматограмма была получена с использованием метода SEC-ICP-MS. Пять Zn-содержащих пиков были обнаружены в растворимых фракциях корма атлантического лосося. Каждый пик имеет различную молекулярную массу; пик один (~ 600 кДа), пик два и пик третий (от 32 до 17 кДа), пик четыре (от 17 до 1,36 кДа) и пик пять (> 1,36 кДа). Пик четыре был самым обильным, за ним следовали пик два, три, пять и один соответственно. Химические вещества Zn, обнаруженные в растворимой фракции, могут иметь различные источники, поскольку используемый корм содержит как морские, так и растительные ингредиенты, а также дополненную форму (т.е. сульфат Zn). Диапазон молекулярной массы химических видов Zn предполагает, что эти соединения могут быть металлопротеинами.

Растворимость in vitro дополненного Zn в кормах для атлантического лосося
Растворимость добавляемых ⁶⁵Zn повышается в присутствии аминокислот. Все испытуемые аминокислоты повышали растворимость добавляемых ⁶⁵Zn. Метионин, глицин, цистеин, гистидин и лизин улучшали ^{растворимость на 65}Zn; более высокая растворимость была обнаружена при гистидине и лизине(рисунок 5).

Оценка поглощения видов Zn с использованием кишечной модели in vitro (RTgutGC)
На апикальный захват цинка в клетках RTgutGC значительно влияло присутствие L-Met или DL-Met в концентрациях 2 мМ. Кроме того, влияние метионина на поглощение Zn в клетках RTgutGC отрицательно влияло присутствие BCH (блокатора транспортной системы аминокислот) по сравнению с клетками, необработанными BCH(рисунок 6).

Очевидная доступность диетического Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)
В практических кормах для атлантического лосося очевидная доступность Zn была одинаковой при приеме добавок с неорганическим источником (сульфат Zn) или органическим источником (хелат Zn глицина). Оценочные значения кажущейся доступности Zn (%, n = 3) у атлантического лосося составили 31% ± 12% при приеме добавок с неорганическим источником (сульфат Zn) и 31% ± 3% при дополнении органического источника (хелат Zn глицина).

Рисунок 1:Краткое изложение системного подхода к оценке минеральной доступности с использованием дополнительных методов. Этот подход был использован для изучения доступности цинка в атлантическом лососе, включая видообразование Zn, растворимость Zn в кишечной среде, поглощение Zn кишечными клетками и кажущуюся доступность Zn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Краткое изложение процедуры извлечения Zn из образца корма. Цинк извлекается из образца корма с использованием мягких условий экстракции. За извлечением следует анализ видообразования Zn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Пример клеток RTgutGC через 1 ч (слева) и 1 неделю (справа) после посева в колбы для культуры клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Хроматограмма, показывающая Zn-содержащие пики из растворимой фракции корма атлантического лосося и проанализированная SEC-ICP-MS. Три реплики характеризуются синей, красной и черной линиями. Калибровку молекулярной массы проводили с использованием тиреоглобулина (660 кДа, мониторинг ¹²⁷I), супероксиддисмутазы Zn/Cu (32 кДа, мониторинг ⁶⁶Zn), миоглобина (17 кДа, мониторинг ⁵⁷Fe), витамина B12 (1,36 кДа, мониторинг ⁵⁹Co); Пик 1 (P1): ~600 кДа, время удержания (RT) 8,2 мин; Пик 2+3 (P2+3): от 32 до 17 кДа, RT 14,2 + 15,3 мин; Пик 4 (P4): от 17 до 1,36 кДа, RT 16,3 мин; Пик 5 (P5): > 1,36 кДа, Rt 23,2 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Влияние аминокислот на растворимость in vitro добавляемого Zn в кормах атлантического лосося. Данные представлены в виде среднего ± УР (n = 3). Данные были проанализированы с помощью односторонней ANOVA, за которой последовал тест на множественное сравнение Даннета, сравнивающий среднее значение каждой группы АА с контрольной группой (без АА). Звездочками обозначен уровень значимости ANOVA (P-значения < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) и < 0,0001 (****)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:Влияние метионина и ингибитора транспорта аминокислот (2-Аминобицикло [2.2.1]гептан-2-карбоновой кислоты, BCH, 10 мМ). Данные представлены в виде среднего ± УР (n = 3). Данные были проанализированы с помощью двустороннего ANOVA, за которым последовал тест туки с множественным сравнением с уровнем значимости p < 0,05. Пост-специальные различия между группами представлены в виде надстрочного индекса над полосами; бары с разными надстрочными индексами статистически различны (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Настройки ВЭЖХ
Столбец	Колонка SEC (30 см x 7,8 мм, размер частиц 5 мкм) + защитная колонна (размер частиц 7 мкм)
Диапазон калибровки	1.0 × 104 - 5.0 × 105 да
Мобильная фаза	50 мМ Tris-HCl + 3% MeOH (рН 7,5)
Расход	0,7 мл мин−1
Объем впрыска	50 мкл
Параметры ICP–MS
Мощность вперед	1550 Вт
Поток плазменных газов	15.0 л мин−1
Расход газа-носителя	0,86 л мин−1
Поток подпитывного газа	0,34 л мин−1
Время пребывания	0,1 с на изотоп
Мониторинг изотопов	127 г. I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Таблица 1. Обзор настроек приборов для ВЭЖХ и МСП-МС.

Химический состав (мМ)	L15/ex	Экспериментальная среда (L15/FW)
Нитрат натрия	155	155
Нитрат калия	6.2	6.2
Магния сульфат	3.8	19.5
Нитрат кальция	1.5	5.4
ХЕПЕС	5	5
Магния хлорид	-	15
Пируват натрия	5.7	5.7
Галактоза	5.7	5.7
рН	7.1	7.4
Ионная сила	178	258
Ионный состав (мММ)
Кальций, Ca2+ *	1.6 ± 0.1	5.3 ± 0.2
Магний, Мг2+ *	3.9 ± 0.3	32.5 ± 0.7
Калий, К+ *	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
Натрий, Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
Нитрат, NO3- **	164	172.4
Сульфат, SO4- **	3.8	18.7
Хлорид, Cl- **	1.5	31.5

Таблица 2. Химический и ионный состав экспериментальной среды проверен.

Discussion

На кишечное всасывание Zn, по-видимому, влияет химическая форма вида Zn^13. В связи с этим использование протоколов, описанных в данной статье, позволило последовательно изучать химические и биологические аспекты, лежащие в основе «доступности» Zn в атлантическом лососе.

В этом исследовании сообщалось об использовании метода анализа видообразования Zn. Метод SEC-ICP-MS предоставил качественные данные о молекулярной массе химических веществ Zn, присутствующих в растворимой фракции корма атлантического лосося. Это было достигнуто путем сравнения времени удержания калибровочных эталонов молекулярной массы (т.е. тиреоглобулина (660 кДа), супероксиддисмутазы Zn/Cu (32 кДа), миоглобина (17 кДа) и витамина B12 (1,36 кДа)) со временем удержания Zn, содержащего пики. Проблемой, обнаруженной в анализе видообразования Zn, была идентификация неизвестных химических видов Zn из-за отсутствия аналитических стандартов. В SEC разделение молекул основано на их размерах относительно пор в стационарной фазе. В принципе, более крупные молекулы будут путешествовать быстрее, элюируя первыми, а меньшие молекулы будут путешествовать медленнее, элюируя позже^14. Следовательно, каждый Zn, содержащий пик, может содержать несколько соединений с аналогичной молекулярной массой^15. Это также способствует проблеме идентификации неизвестных химических видов Zn. Кроме того, для извлечения Zn было протестировано несколько мягких условий экстракции. Извлеченный Zn был низким (~10%). Мягкие условия экстракции были применены для сохранения химических веществ Zn нетронутыми, но это, возможно, поставило под угрозу эффективность экстракции^7.

В анализе растворимости in vitro растворимость дополненного Zn (в виде радиоизотопа ⁶⁵ZnCl₂₎показала, что аминокислоты, особенно гистидин и лизин, увеличивают растворимость Zn(рисунок 5). Использование образцов корма непосредственно для анализа растворимости in vitro в смоделированных желудочно-кишечных условиях основано на знании того, что изменение видообразования Zn зависит от рН^16. Однако кислые условия в начале желудочно-кишечного тракта могут привести к некоторому изменению видообразования, которое может быть необратимым (например, ZnO-> ZnCl_2,в присутствии HCl в кислых условиях в желудке). Тем не менее, источником Zn, используемым здесь, является_{ZnSO 4,} растворимость которого была улучшена аминокислотами в среде. Следующий вопрос, на который необходимо ответить, заключался в том, можно ли перевести повышенную растворимость в доступность? Для изучения этого вопроса была использована клеточная линия кишечника RTgutGC. В контексте минерального питания у животных термин «доступность» трудно определить и может регулироваться дифференцированно в клетках (in vitro) по сравнению с животным (in vivo). Следовательно, термин «поглощение» использовался, когда дело доходило до оценки in vitro с использованием кишечной клеточной линии. Клеточная линия предоставила полезную информацию о механизмах поглощения Zn в кишечном эпителии, который является частью сложного регуляторного процесса, регулирующего доступность минералов у животных. Клетки RTgutGC вызывали лучшую способность к апикального поглощению Zn в присутствии аминокислоты (т.е. метионина; Рисунок 6). Однако кажущаяся доступность in vivo существенно не различаться между неорганическими и органическими источниками Zn в атлантическом лососе. В исследовании доступности in vivo сравнение источников Zn проводилось при диетических уровнях Zn, значительно превышающих известные потребности в Zn атлантического лосося^17,общую концентрацию Zn 150 мг / кг корма. Различия в доступности лучше визуализируются, когда тестируемые диетические уровни падают в линейном динамическом диапазоне до того, как животное достигнет насыщения. В настоящем исследовании in vivo возможно, что атлантический лосось был хорошо насыщен для наблюдаемой разницы в поглощении Zn между используемыми источниками.

Таким образом, первый метод предоставил качественную информацию о различных химических видах Zn, обнаруженных в растворимой фракции корма атлантического лосося; второй способ, in vitro растворимость дополненного Zn улучшалась в присутствии аминокислотных лигандов; третий метод подтвердил, что улучшенная растворимость аминокислот может улучшить поглощение эпителия кишечника; и наоборот, четвертый метод не смог найти различий в доступности Zn от неорганического или органического источника до атлантического лосося. В заключение, хотя и не в соответствии с выводами in vivo, протоколы in vitro предоставили интересное понимание различных компонентов доступности Zn.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,45 & микро; м шприц фильтр	Sartorius
0,45 μ m мембранный фильтр	Pall
10 % фетальная бычья сыворотка	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 лунки планшеты (Falcon, TPP микропланшеты)	Thermo Fisher Scientific
2-аминобицикло(2.2.1)гептан-2-карбоновая кислота	Sigma Aldrich	A7902
75 см<суп>2 колбы для клеточных культур (Falcon, TPP tissue culture flask)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-аргинин	сигма Олдрич	A5006
Bradford набор для анализа	Bio-Rad	5000001
центрифуга	Eppendorf Centrifuge 5702
L-цистеин	Sigma Aldrich	30089
DL-метионин	Альфа Аэсар	59-51-8
D-метионин	Сигма Олдрич	M9375
Экспериментальные корма для рыб	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich
Гвардейская колонна, TSKgel SWxl типа (7 μ m размер частиц)	Tosoh
L-гистидин	Sigma Aldrich	53319
ВЭЖХ в сочетании с 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Соляная кислота	Emsure ACS, ISO, 37% в/в., Merck	1.00317
Ножевая мельница	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 средний	Invitrogen/Gibco
L-метионин	Сигма Олдрич	M9625
L-лизин	сигма Олдрич	23128
Метанол	LiChrosolv, марка ВЭЖХ, Merck	1.06035
Milli-Q воды (18.2  М&Омега;   cm)	EMD Millipore Corporation
Миоглобин	Сигма Олдрич	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur пипетка	VWR
pH-метр	inoLab
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Sigma Aldrich
Клетки RTgutGC			Получено в натуральной форме от профессора д-ра Кристин Ширмер, кафедра экологической токсикологии, Eawag, Швейцарский федеральный институт водных наук и технологий, Швейцария
колонка SEC, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve из нержавеющей стали (850?μ m - 1,12?мм)	Retsch
Додецилсульфат натрия (SDS)	Sigma Aldrich
Супероксиддисмутаза	Сигма Олдрич	S7571
Тиреоглобулин	Сигма Олдрич	T1001
Трикаин метансульфонат	PharmaQ
Tris(гидроксиметил)аминометан	Сигма Олдрич
Трипсин в 0,25% в фосфатно-буферном физрастворе	Biowest	L0910
Versene EDTA раствор	Invitrogen/Gibco	15040-033
Витамин B12	Sigma Aldrich	V2876
Хелат цинка глицина	Фитобиотики
Сульфат цинка	Vilomix