Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изоляция слюнных эпителиальных клеток от слюнных желез человека для роста провитроки как салисферы или монослои

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59868

⸱

15 июля 2019 г.

 , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем метод изоляции и культивирования первичных клеток эпителии, полученных из слюнных желез человека. Эти клетки демонстрируют модели экспрессии генов, согласующиеся с их слюнным эпителиальным происхождением, и могут быть выращены в виде салисферов на мембранных матрицах подвала, полученных из опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой или в качестве монослойных на обработанных культурных блюдах.

Аннотация

Слюнные железы являются местом значительный интерес для исследователей, заинтересованных в различных аспектах болезни человека. Одной из целей исследователей является восстановление функции желез, поврежденных лучевой терапией или из-за патологий, связанных с синдромом Шегрена. Вторая цель исследователей заключается в определении механизмов, с помощью которых вирусы размножаются в железистой ткани, где они могут затем получить доступ к слюнных жидкостей, важных для горизонтальной передачи. Эти цели подчеркивают необходимость надежной и доступной модели слюнных желез in vitro, которая может быть использована исследователями, заинтересованными в вышеупомянутых, а также смежных областях исследований. Здесь мы обсуждаем простой протокол для изоляции эпителиальных клеток из человеческих слюнных желез и распространять их в пробирке. Наш протокол может быть дополнительно оптимизирован для удовлетворения потребностей отдельных исследований. Вкратце, слюнная ткань механически и enzymatically отделена к изолировать одиночные клетки или малые кластеры клеток. Выбор эпителиальных клеток происходит путем покрытия на подвальной мембранной матрицы в присутствии средств оптимизированы для содействия росту эпителиальных клеток. Эти образовываемые культуры можно поддерживать как трехмерные кластеры, называемые «салисферами», или выращенные в качестве монослойного на обработанных блюдах культуры пластиковой ткани. Этот протокол приводит к росту неоднородной популяции в основном эпителиальных клеток, которые могут распространяться в течение 5-8 проходов (15-20 удвоений населения) до прохождения клеточного сенесценции.

Введение

У млекопитающих слюнные железы организованы в 3 пары основных слюнных желез: околоушные, подчелюстные и сублингвальные железы. Существует также ряд мелких желез, расположенных на языке и разбросанных по всей полости рта1. Основные железы несут ответственность за объем слюны производится2. В дополнение к обеспечению защиты противомикробных препаратов с помощью секретных факторов, слюна имеет важное значение в процессе жевания и смазки пищи, как она проходит через пищевод2. Таким образом, дисфункция слюнных желез представляет собой медицинский вопрос, где больные, которые не в состоянии производить достаточно слюны более склонны к развитию заболеваний, таких как полости зубов или устного кандидоза3. Кроме того, снижение слюны приводит к большей сложности еды и переваривания пищи, что оказывает значительное влияние на качество жизни.

Дисфункция слюнных желез в первую очередь встречается у пациентов, страдающих синдромом Шегрена, аутоиммунным расстройством, или у пациентов с раком головы и шеи, которые подверглись лучевой терапии3,4,5, 6. Поврежденные секреторные ацини в железах в результате аутоиммунных или лучевой терапии непроходят самообновления, что приводит к тому, что пациент живет с необратимым повреждением 6. Изучение слюнных желез также привлекло внимание или исследователей, заинтересованных в механизмах вирусного патогенеза. Некоторые патогенные микроорганизмы, такие как цитомегаловирус человека (HCMV), постоянно размножаются в слюнных железах, что позволяет передавать зарождающийся вирус новому хозяину через слюну7,8. Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в разработке надежных и воспроизводимых моделей in vitro ткани слюнных желез для решения и понимания широкого спектра медицинских проблем.

Несколько моделей системы слюнных желез мины были использованы в качестве отправной точки для понимания и характеристики различных эпителиальных клеток, которые образуют слюнные железы9,10. Существуют очевидные и основные различия между человеческими и муриновыми слюнными железами11. Наиболее примечательно человеческого околоушной железы больше по отношению к submandibular железы в то время как мышь submandibular и околоушной очень похожи по размеру1,2,11. Хотя увековеченные человеческие подмандибулярные клеточные линии существуют, есть серьезные опасения, что увековеченные клетки не точно поддерживают фенотип первичной ткани и вторичные опасения, что увековеченные клетки на самом деле не являются производными от слюнный эпителий сам12. По этим причинам существует интерес и необходимость изучения первичной слюнной ткани у человека.

Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных эпителиальных клеток из слюнных желез человека для культуры тканей. Наш протокол основан на работах Pringle et al. и Tran et al. с изменениями, внесенными, чтобы в целом упростить их процедуры13,14. Во-первых, в то время как протокол Tran et al. требует длительной пятичасовой инкубации для ферментативного переваривания слюнной ткани, наш измененный протокол был успешным с всего лишь один час инкубации, аналогичной той, что в Pringle и др. Во-вторых, мы используем различные ферменты для пищеварения тканей, прежде всего мы не используем трипсин, как это используется в оригинальном протоколе Tran et al., но вместо этого используем смесь диспазы и коллагеназы. Мы предпочитаем, чтобы избежать трипсина в начальных шагов пищеварения, как недавнее исследование показало, что первоначальное пищеварение слюнной ткани трипсин приводит к снижению жизнеспособности клеток, возможно, в результате потери редкой популяции стволовых клеток15. Наконец, мы культуры салисферы на поверхности подвальной мембранной матрицы (БММ) с использованием коммерчески доступных средств массовой информации, первоначально разработанных для распространения бронхиальных эпителиальных клеток. Наш протокол может быть использован для изолировать слюнные клетки от околоушных, подчелюстных и сублингвальных желез. Эти клетки выражают слюнную амилазу и другие специфические гены слюны, указывающие на то, что ониподдерживают фенотип, похожий на слюнные асинарные эпителиальные клетки 7. Мы успешно создали слюнные культуры из основных образцов тканей человека с помощью этой методологии. Кроме того, первичные слюнные клетки могут быть легко криоконсервированы для использования на более поздний срок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эти протоколы и исследования были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом при Университете Цинциннати (Federal-wide Assurance #00003152, протокол IRB 2016-4183). Слюнная ткань обычно резекционируется во многих хирургических процедурах головы и шеи и, как правило, не связана с злокачественным процессом. Как правило, свежеректированная ткань слюнной железы используется в течение 2-4 ч после удаления от пациента(рисунок 1A).

1. Подготовка реагента

  1. Бронхиальная эпителиальная среда роста клеток (BEGM)
    1. Добавьте компоненты из комплекта, предоставленного производителем (см. таблицу материалов).
    2. Вымойте каждую трубку один раз с базовым носителем, чтобы обеспечить полную передачу компонентов. Затем добавьте древесный уголь раздели плода сыворотки крупного рогатого скота, чтобы сделать окончательную концентрацию 4% сыворотки.
  2. Резерв лизации красных кровяных телец (РБК)
    1. Чтобы сделать 10x бульон, добавить 40,15 г NH4Cl, 5,0 г NaHCO3, и 0,186 г этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) и довести до окончательного объема 200 мл с помощью dH2O. Затем фильтр стерилизовать и хранить при 4 градусах Цельсия.
    2. Разбавить до рабочей концентрации 1x в стерильных dH2O до использования.
  3. Решение для диссоциации
    1. К 100 мл бутылки раствора диспазы (см. таблицуматериалов) добавьте 0,15 г коллагеназе III типа. После полного растворения коллагеназа, фильтр стерилизовать новое решение и aliquot. Хранить при -20 градусах по Цельсию.

2. Пищеварение тканей

  1. Используя 100-мм пластину культуры ткани, механический отрезок ткани на мелкие куски 1-2 мм в размерах с помощью автоклава стерилизованных рассекающих ножницы и хирургические щипцы(рисунок 1B,C). Соединительная ткань между частями должна быть разрезана, чтобы обеспечить правильное разделение и легкость в дальнейших шагах.
  2. Добавьте 6 мл раствора диспазы/коллагеназа в фарш. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение примерно 30 мин до 1 ч.
  3. Нарушить ткани путем pipetting с 5 мл серологического пипетки 15-20 раз.
  4. Инкубировать при 37 градусах По цельсию еще 30 мин до 1 ч.
  5. Повторите шаги 2,3 и 2,4 два-три раза или до тех пор, пока ткань не подогревает суспензию и может легко пройти через отверстие пипетки(рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стартовый размер образца ткани и то, как тонкость измельчения тканей будет определять, сколько раз нужно повторить шаги 2.3 и 2.4. Как правило, мы получаем ткани примерно 1 см х 1 см в размерах. Кроме того, можно контролировать диссоциацию тканей с помощью стандартного перевернутого микроскопа культуры тканей для отслеживания прогресса клеточной диссоциации из ткани. Небольшие скопления клеток идеально подходят для первоначального роста слюнных клеток в виде салицфер.

3. Покрытие скважин с подвальной мембранной матрицей

ПРИМЕЧАНИЕ: Подвальная мембранная матрица (BMM) должна быть разморожена на ночь при 4 градусах Цельсия за день до того, как она будет использоваться. После оттаять, BMM следует постоянно поддерживать на льду или при температуре 4 градусов по Цельсию, так как он будет быстро затвердеть (т.е. образовывать гель) при более теплых температурах. Кроме того, следует позаботиться о том, если образцы были охлаждены на льду до покрытия на БММ, так как холодные образцы «расплавить» БММ и подвергнуть клетки пластиковой тарелке.

  1. Медленно пипетка BMM (см. Таблицаматериалов) в каждый колодец, чтобы быть покрыты. Равномерно и медленно распределите БММ по скважине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мы используем 500 л на каждую скважину из шестискважинной пластины, но этот объем может быть скорректирован для использования на других вариантах пластин, таких как 12-ну или 24-ну, или по желанию для более толстых или тонких гидрогелей.
  2. Инкубировать покрытые пластины при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 минут до использования, чтобы время BMM затвердеть.

4. Фильтрация непереваренной ткани, лиза РБК и клеточное покрытие

  1. Передача ткани гомената от шага 2,5 до конической трубки 15 мл. Вымойте пластину один раз с 6 мл фосфатного буферного сольника Дульбекко (DPBS) для передачи оставшихся клеток.
  2. Фильтр гомената в 50 мл конической трубки через 70 мкм нейлоновой сетки сетки ситечко для удаления непереваренной ткани. Центрифуга процедила клетки в течение 5 мин при 500 х г.
  3. Разбавить 10x РБК лизис буфера в стерильных dH2O, чтобы сделать 1x рабочее решение.
  4. Аспирируй супернатанта. Затем resuspend ячеек гранулы в 10 мл 1x РБК лиза буфера. Инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах По Цельсию.
  5. Добавьте 20-25 мл DPBS, чтобы нейтрализовать буфер ЛИЗИС РБК и свести к минимуму лизис слюнных клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения буфером лиза РБК, клеточная гранулы должны быть белыми. Красный цвет в грануле указывает на то, что не все РБК были полностью лисицированы. Повторите шаги 4,4 до 4,5, если это необходимо для полного лиза всего РБК.
  6. Аспирируй супернатанта. Приостановите гранулы в 1-2 мл BEGM на скважину, затем поместите повторно ежело клетки на скважины с покрытием БММ. Инкубировать при 37 градусах Цельсия.
  7. После того, как покрытие на BMM, клетки образуются в сферические структуры или "салисферы" в течение 2-3-дневного периода. Клетки могут быть сохранены в качестве салисферов в течение 5-7 дней, прежде чем БММ начинает деградировать позволяет клеткам получить доступ и придерживаться пластика и расти как монослой.

5. Субкультирование салицферов и техническое обслуживание на БММ

  1. Аспирные носители из скважин, затем добавьте 1 мл раствора диспазы/коллагеназы к каждой скважине и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 15 мин или до тех пор, пока БММ в основном не растворится.
  2. Перенесите клетки в коническую трубку 15 мл и промойте колодцы один раз с Помощью DPBS для получения оставшихся клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
  3. Аспирируй супернатанта. Приостановите гранулы в 2 мл трипсина, затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
  4. Нейтрализуйте трипсин с помощью любых полных носителей, содержащих 10% сыворотки. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
  5. Аспирируй супернатанта. Повторное удаление клеток в DPBS для удаления остаточного носителя, трипсина и сыворотки. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
  6. Аспирируй супернатанта. Resuspend в BEGM и пластины resuspended клетки на затвердевные BMM покрытием культуры блюда. Перекрывшиеся клетки также могут быть покрыты непосредственно на клеточной культуры обработанных блюд для распространения в качестве монослой. Для получения дополнительной информации о росте слюнных клеток в качестве монослой, см. Клетки, выращенные на БММ или на пластике, следует кормить свежим и мизернательом каждые 2-3 дня.
  7. Культура клеток в увлажненный инкубатор поддерживается при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.

6. Субкультирование салисфер на обработанных пластиковых тканях культуры блюд

ПРИМЕЧАНИЕ: Если поддержание клеток в качестве монослойна на пластике, начните с этого шага. Следующий протокол распространяется на клетки, растущие в 100-мм блюде.

  1. Аспирируй средства массовой информации. Вымойте один раз с DPBS для удаления остаточного носителя.
  2. Добавить 2 мл трипсина затем инкубировать при 37 кв кв 15 мин, или до тех пор, пока клетки полностью отделены.
  3. Нейтрализуйте трипсин с помощью 4 мл любых полных носителей, содержащих 10% сыворотки. Передача ячеек в коническую трубку 15 мл.
  4. Вымойте пластину один раз примерно с 5 мл DPBS для сбора оставшихся клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
  5. Аспирируй супернатанта. Отсеивать ячейки в 6-10 мл DPBS для удаления остаточных носителей.
  6. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
  7. Аспирируй супернатант и resuspend в BEGM. Клетки плиты на обработанные пластичных тарелках культуры ткани. Кормите свежим BEGM каждые 2-3 дня.
  8. Культура клеток в увлажненный инкубатор поддерживается при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.

7. Криоконсервация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервация клеток может быть достигнуто из одной клеточной суспензии, происходящих из либо салицоры или монослой выращенных клеток.

  1. Подсчитайте клетки на гематоцитометре, чтобы вычислить общее количество присутствующих клеток.
  2. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
  3. Аспирируй супернатанта. Приостановите гранулы в BEGM с 10% диметилсульфоксидом (DMSO). Концентрация клеток должна быть 2 х 106 клеток/мл до 10 х 106 клеток/мл.
  4. Клетки Aliquot в стерильные криогенные трубки для хранения. Поместите трубки в изолированную пенную стойку и инкубировать при -80 градусов на ночь, чтобы медленно заморозить клетки.
  5. На следующий день поместите трубки в жидкий азот для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть быстро разморожены при 37 градусах Цельсия. При оттаивании клетки должны быть гранулированы при 500 х г, а dMSO-содержащие носители удаляются до покрытия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Через два-три дня после покрытия клеток из переваренной ткани на БММ, клетки будут легко образовывать небольшие кластеры, которые будут продолжать расширяться в размерах до 15-20 клеток на кластер(рисунок 2A). Сотовый мусор и отдельные мертвые клетки, как правило, видели и должны быть удалены путем аспирации и пополнения с помощью свежих средств массовой информации. Клетки будут продолжать размножаться в качестве салиферов в течение 3-10 дней, или до тех пор,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Слюнная дисфункция представляет собой заботу о качестве жизни для тех, кто страдает от синдрома Шегрена, а также тех, кто проходит лучевую терапию для рака, прилегающих к слюнных желез3,4,5, 16. Один из предлагаемых терапии для лечения этих пациентов заключается в том, чтобы расти функциональные слюнные стволовые клетки или органоиды в пробирке, которые затем могут быть введены в поврежденную ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы сообщают, что ничего не раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Джеймса. Бриджеса за предоставление значительных рекомендаций по методологиям, участвующим в культивирование первичных ячеек. Мэтью Дж.Биклер был поддержан Национальными институтами здравоохранения Обучение Грант T32-ES007250. Эта работа была также поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов R01-AI121028 и R21-DE026267 присуждается Уильям У. Миллер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки для культур 100 ммThermo Scientific172931
15 мл конические пробиркиThermo Scientific339651
50 мл конические пробиркиThermo Scientific339653
Среда для роста бронхиальных эпителиальных клетокLonzaCC-3171Добавьте набор пуль в соответствии с инструкциями производителя. Дополните 20 мл сыворотки, очищенной древесным углем.
Сетчатый фильтр 70 & микро; m нейлоновая сеткаFisher22-363-548
Древесный уголь очищенная фетальная бычья сывороткаGibco12676-029
Коллагеназа типа IIIWorthingtonLS004182Хранить при 4 °C.
Криогенная трубкаFisher5000-0020
DispaseКлеточные приложения07923Растворите коллагеназу до 0,15% (по объему). Фильтр стерилизовать, затем хранить при температуре -20 °C.
Ножницы для препарированияFisher08-940
Дульбекко фосфат буферный физиологический растворCorning55-031-PC
General ChemicalsSigma
PathClear Экстракт базальной мембраныCultrex3432-005-01Разморозить при 4 ° C не менее чем за 24 часа до использования. Всегда обрабатывайте на льду.
Шестилуночные чашки для культивированияFalcon353046
Хирургические щипцыFisher22-079-742
Раствор Trypsin-EDTACorning25-052-CI

Ссылки

  1. Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47(2018).
  2. Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
  3. Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
  4. Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21(2018).
  5. Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
  6. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
  7. Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
  8. Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
  9. Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
  10. Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
  11. Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
  12. Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
  13. Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
  14. Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  15. Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
  16. Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
  17. Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
  18. Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
  19. Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
  20. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
  21. Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Формирование салисферпереваривание тканейизоляция клетокматрикс базальной мембранысреда BEGMнейтрализация трипсинапротокол центрифугированиячашки для культивирования клетокпервичная культура клеток
Изоляция слюнных эпителиальных клеток от слюнных желез человека для роста провитроки как салисферы или монослои
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.