Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59871

⸱

19 июля 2019 г.

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oncology in South China, Collaborative Innovation Center for Cancer Medicine, Sun Yat-sen University Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Текущий протокол описывает методы для создания пациента полученных ксенотрансплантата (PDX) модели и первичных линий раковых клеток из хирургических образцов рака желудка. Методы являются полезным инструментом для разработки лекарственных средств и исследований биологии рака.

Аннотация

Использование доклинических моделей для продвижения нашего понимания биологии опухоли и исследования эффективности терапевтических агентов является ключом к исследованию рака. Хотя Есть много установленных линий клеток рака желудка и многие обычные трансгенные модели мыши для доклинических исследований, недостатки этих in vitro и in vivo модели ограничивают их применения. Поскольку характеристики этих моделей изменились в культуре, они больше не моделируют неоднородность опухоли, и их ответы не были в состоянии предсказать реакцию у людей. Таким образом, разрабатываются альтернативные модели, которые лучше отражают неоднородность опухолей. Модели ксенотрансплантата (PDX) пациента сохраняют гистологический вид раковых клеток, сохраняют внутриопухолевую неоднородность и лучше отражают соответствующие человеческие компоненты микроокружения опухоли. Тем не менее, это обычно занимает 4-8 месяцев, чтобы разработать модель PDX, которая больше, чем ожидалось выживание многих желудочных пациентов. По этой причине, создание первичных линий раковых клеток может быть эффективным дополнительным методом для исследования ответных препаратов. Текущий протокол описывает методы создания моделей PDX и первичных линий раковых клеток из хирургических образцов рака желудка. Эти методы являются полезным инструментом для разработки лекарственных средств и исследований биологии рака.

Введение

Рак желудка является пятым наиболее распространенным раком во всем мире и третьей по значимости причиной смерти от рака. В 2018 году в мире было диагностировано более 1 000 000 новых случаев рака желудка, и, по оценкам, 783 000 человек были убиты этим заболеванием1. Заболеваемость и смертность от рака желудка остаются очень высокими в северо-восточных азиатских странах2,3. Несмотря на значительный прогресс в области терапии рака, прогноз пациентов с прогрессирующим раком желудка остается плохим, с пятилетней выживаемости около 25%4,5,6, 7,. Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий для лечения рака желудка

Лечение рака желудка является сложной задачей из-за его высокой неоднородности8,9. Таким образом, вопрос о том, как решать проблемы неоднородности опухоли для реализации точной медицины имеет центральное значение для исследований рака. Модели In vitro и in vivo играют решающую роль в выяснении неоднородных механизмов и биологии рака желудка. Однако, хотя Есть многочисленные линии раковых клеток желудка и многие обычные трансгенные модели мыши для доклинических исследований, недостатки этих моделей ограничить их применения10. Поскольку характеристики этих моделей изменились в культуре, они больше не моделируют неоднородность опухоли, и их ответы не смогли предсказать реакции у людей11. Эти вопросы серьезно ограничивают возможность выявления подгрупп онкологических больных, которые будут реагировать на целевые препараты. Краткосрочная культура первичных опухолей обеспечивает относительно быстрый и персонализированный способ исследования противораковых фармакологических свойств, которые, вероятно, будут отличительной чертой персонализированного лечения рака.

Пациент производные ксенотрансплантаты (PDXs) являются предпочтительными в качестве альтернативной доклинической модели для наркотиков ответ профилирования12. Кроме того, модели PDX предлагают мощный инструмент для изучения инициации и прогрессирования рака13,14. Модели PDX сохраняют гистологический облик раковых клеток, сохраняют внутриопухолевую неоднородность и лучше отражают соответствующие человеческие компоненты микроокружения опухоли15,16. Тем не менее, ограничение широко используемых моделей PDX является низкий уровень успеха для создания и последовательного распространения человеческих твердых опухолей. В этом исследовании описаны прилично успешные методы создания моделей PDX и первичных клеточных линий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование человека было одобрено Институциональной этики Обзор совета Сунь Ятсен университета онкологический центр (SYSUCC, Гуанчжоу, Китай). Исследование на животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Сунь Ятсена. Примечание: все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими законами и институциональными руководящими принципами, включая Руководство по защите от воздействия на профессиональные произобина от патогенов, передающихся через кровь.

1. Подготовка образца

  1. Получить ткани рака желудка (P0 и проход 0) непосредственно от операции. Образец опухоли должен быть больше0,5 см 3.
  2. Приготовьте 3-4 мл запасного раствора: например, RPMI-1640 средний (1x) дополнен 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 U/mL пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина.
  3. Положите свежий образец опухоли в бульон-раствор при 4 градусах по Цельсию в течение не более 4 часов.

2. Создание модели PDX(Рисунок 1)

  1. Для обеспечения стерильной хирургической области, дезинфицировать все материалы с ультрафиолетовым светом в течение более 30 минут до передачи в лабораторию животных.
    Примечание: операционный зал необходимо дезинфицировать ультрафиолетовым светом в течение 30 минут, прежде чем мы очистим стол с dichloro изоцианурической кислоты натрия suppositoria дезинфицирующее средство. Затем для дезинфекции кожи используется повидон-йод.
  2. Используя щипцы и ножницы, тщательно вскрыть ткани опухоли и обрезать их на несколько небольших кусочков (примерно 1 мм3 куба) в стерильных условиях.
  3. Анестезия женщин от 5 до 7 недель NOD-SCID-IL2rg (NSG) мышей при контакте с 1-1,5% изофруран с анестезией машины.
    1. Анестезия мыши, пока он не перестает бороться, но поддерживает даже дыхание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка 50 мл является простым оборудованием, которое функционирует подобно анестезии машины. Использование ветеринарной глазной мази для предотвращения сухости не нужно из-за короткого времени операции.
  4. Сделайте разрез на 1 см на обоих боковых флангах с помощью стерильных ножниц и имплантируете по одной части опухоли в каждый фланг мыши.
    1. Чтобы убедиться, что опухоль кусок не выскользнуть, используйте стерильные щипчинки, чтобы нарушить подкожной ткани. Затем закрепите кусок опухолевой ткани и поместите его в глубокий участок.
  5. Закройте область имплантата подкожным швом хирургическими швами и отметьте уши мыши помеченными ушами для ушей
  6. Стерилизовать рану йодом.
  7. Аккуратно поместите мышей в пустую клетку после операции, сохраняя при этом строгое recumbency. Обратите пристальное внимание на состояние мышей; они просыпаются и начинают ходить примерно через 3-4 минуты. Поместите мышей, которые перенесли операцию в другой новой клетке, отделенной от тех, кто не подвергся операции.
  8. Оцените размер опухоли путем пальпации места имплантации. Измерьте опухоли с помощью калипера Вернье два раза в неделю.
  9. Как только опухоль достигает 10 мм в диаметре, состояние животных ухудшается, или опухоли язвы, эвтаназии мыши с IRB утвержденный метод. Реимплантированный собранный свежие фрагменты опухоли в 2 новых мышей для прохода, или временно хранить образцы в PBS на льду для изоляции первичных клеточных линий.

3. Криоконсервация тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть в первую очередь ссылки на методы для Live Tissue Kit Cryo Kit. Основные комплекты и оборудование перечислены в таблицематериалов.

  1. Эвтанизировать мышей с IRB утвержденный метод, когда опухоль больше, чем 10 мм в диаметре.
  2. Используя стерильные щипцы и ножницы, медленно изолировать опухоль от мышей.
  3. Вымойте опухолевые ткани DPBS в 10 см блюдо. Вскрыть и удалить некротические области, жировую ткань, сгустки крови и соединительной ткани с помощью щипцы и ножницы.
  4. Вырежьте опухолевые ткани до максимальной толщины 1 мм с помощью плесени.
  5. Вымойте ломтики с DPBS в 10 см блюдо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс витрификации включает в себя использование труб окнов с пометкой V1/V2/V3 в шагах 3.6-3.8. Основными ингредиентами являются DMSO и сахароза.
  6. Перенесите ломтики в трубку V1 с щипцами, и инкубировать трубку при 4 кв к в течение 4 мин. Roll и инвертировать трубку кратко, и поместите его на 4 КК еще на 4 мин.
  7. Налейте раствор V1 и ломтиками в 10 см блюдо. Перенесите ломтики в трубку V2 с щипцами, и инкубировать трубку V2 при 4 кв КС в течение 4 мин. Roll и инвертировать трубку кратко, и поместите его на 4 КК еще на 4 мин.
  8. Налейте раствор V2 и ломтиками в 10 см блюдо. Перенесите ломтики в трубку V3 с щипцами, и инкубировать трубку при 4 кв к в течение 5 мин. Roll и инвертировать трубку кратко, и поместите его на 4 кв КС, по крайней мере 5 мин. Убедитесь, что ломтики все раковина в нижней части трубки.
    1. Если несколько ломтиков остаются плавающими, свернуть и инвертировать трубку кратко, и поместите трубку на 4 градусов по Цельсию снова, пока все ломтики раковина полностью; при необходимости отбросьте плавающие ломтики.
  9. Налейте раствор V3 и ломтиками в 10 см блюдо.
  10. Разрежьте держатели ткани до нужной длины, и поместите их на стерильную марлю. Перенесите ломтики на держатели. Оберните держатели марлей, и поместите их в жидкий азот с помощью щипцы, а затем инкубации в течение 5 минут.
  11. Пометьте криогенные флаконы информацией о тканях.
  12. Переносите держатели с ломтиками ткани в криогенные флаконы, которые хранятся в жидком азоте.

4. Изоляция первичных клеток(рисунок 2)

  1. Стерилизовать щипцы и ножницы с пара высокого давления при 121 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
  2. Резконизм образцов рака желудка из резецированных образцов или собранных тканей PDX. Поместите ткани на лед, а затем, перенесите ткани в 10 см стерильной культуры блюдо.
  3. Вскрыть и удалить некротические области, жировую ткань, сгустки крови и соединительной ткани с помощью щипцы и ножницы.
  4. Вымойте опухолевые ткани один раз с DPBS, содержащим 100 U/mL пенициллина и 0,1 мг /мЛ стрептомицина в 10 см блюдо.
  5. Разрежьте опухолевую ткань на 1 мм3 кусочками на крышке тарелки; максимальная толщина каждого куска должна сосупрозаться 1 мм.
  6. Перенесите ткани в центрифугу мощностью 50 мл с коллагенеза типа 1 и раствором трипсина (1:14). Vortex смесь кратко.
  7. Инкубировать трубку на водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30-40 мин. Vortex смесь каждые 5 минут.
  8. Добавьте в трубку равный объем rpMI-1640 среднего (1x), дополненного 10% FBS. Vortex смесь тщательно.
  9. Перенесите смесь в новую центрифугу мощностью 50 мл путем медленной фильтрации через фильтр мощностью 40 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 40 мкм фильтры для обеспечения более высокого соотношения раковых клеток. При необходимости, 100 мкм фильтры могут быть использованы для сохранения более типов клеток, таких как иммунологические клетки.
  10. Центрифуга фильтратов на 113-163 х г в течение 5-7 мин на RT. Осторожно удалить супернатант.
  11. Вымойте гранулы с 5 мл PBS, и осторожно удалить супернатант.
  12. Если гранулы красные, он содержит много эритроцитов. Аккуратно приостановите гранулы с 500 зл и сыт ный буфер лиза крови. После 5 мин инкубации, добавить 5 мл PBS, и осторожно удалить супернатант.
  13. Принесите гранулы с помощью культуры среды и перенесите смесь в стерильную 10-сантиметровую тарелку.
  14. Замените среду сыворотки-содержащей средой каждые 2-3 дня.
  15. Проход первичных клеток с помощью трипсина / EDTA, когда они достигают 50% слияния.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь опухолевые ткани от операции сохранились в стоковом растворе до следующего шага. В течение 4 часов опухолевые ткани были разрезаны на мелкие кусочки и имплантированы в составных флангов мышей NSG, которые были обезожжены с помощью пропитанного изофровамих хлопка. Опухоли размером более 1 см3 могут быть резецированы для имплантации в новых мышей (рисунок1) или нарезанный тщательно и сохраняется в жидком азоте после протокола. В этом исследовании, первое поколение опухолей рос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Рак желудка является агрессивным заболеванием с ограниченными терапевтическими возможностями; Таким образом, модели рака желудка стали критическим ресурсом для обеспечения функциональных исследований с прямым переводом в клинику4,8,17. Здесь мы описали методы и протокол создания моделей рака желудка PDX и первичных клеточных линий. Важно отметить, что как морфологические, так и биологические характеристики образцов рака желудка ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81572392); Национальная программа исследований и разработок Китая (2016YFC1201704); Совет-топ научно-технических инновационных молодежных талантов Гуандун Специальная программа поддержки (2016T-03R614).

Мы специально благодарим Гуанчжоу Саген Биотех Ко, Ооо за помощь в подготовке цифр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40 μ m Клеточный фильтрBiologix, Шаньдун, Китай15-1040
Биологический микроскопOLYMPUS, Токио,Япония OLYMPUS CKX41
ЦентрифугаEppendorf, Миттельсаксония, Германия.5427R
CO2-инкубаторThermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, СШАHERACELL 150i
DPBSBasalmedia Technology, Шанхай, КитайL40601
Электротермостатический шкаф для водыYiheng, Шанхай, КитайDK-8AXX
Фетальная бычья сывороткаWisent Biotechnology, Ванкувер, Канада86150040
ИзофлуранBaxter, КитайCN2L9100
Набор для живых тканей Cryo KitCelliver Biotechnology, Шанхай, КитайLT2601
Набор для размораживания живых тканейCelliver Biotechnology, Шанхай, КитайLT2602
NSGBiocytogen, Пекин, КитайB-CM-002-4-5W
Penicilin& стрептомицинThermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, США15140122
буфер для лизиса эритроцитовSolarbio, Пекин, КитайR1010
RPMI-1640 среднийThermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, США 8118367
хирургических шовных игл с нитьюLingQiao, Нинбо, Китай3/8 дуги 4&раз; 10
пресс-форм и вспомогательных лопастей для обработки тканейCelliver Biotechnology, Шанхай, КитайLT2603
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, США 2003779
коллагеназой типа 1 ThermoFisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, США17100017

Ссылки

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Sugano, K. Screening of gastric cancer in Asia. Best Practive & Research in Clinical Gastroenterology. 29 (6), 895-905 (2015).
  3. Nikfarjam, Z., et al. Demographic survey of four thousand patients with 10 common cancers in North Eastern Iran over the past three decades. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (23), 10193-10198 (2014).
  4. Coccolini, F., et al. Advanced gastric cancer: What we know and what we still have to learn. World Journal of Gastroenterology. 22 (3), 1139-1159 (2016).
  5. Goetze, O. T., et al. Multimodal treatment in locally advanced gastric cancer. Updates in Surgery. 70 (2), 173-179 (2018).
  6. Graziosi, L., Marino, E., Donini, A. Multimodal Treatment of Locally Advanced Gastric Cancer: Will the West Meet the East? Annals of Surgical Oncology. 26 (3), 918(2019).
  7. Choi, Y. Y., Noh, S. H., Cheong, J. H. Evolution of Gastric Cancer Treatment: From the Golden Age of Surgery to an Era of Precision Medicine. Yonsei Medical Journal. 56 (5), 1177-1185 (2015).
  8. Zhang, W. TCGA divides gastric cancer into four molecular subtypes: implications for individualized therapeutics. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (10), 469-470 (2014).
  9. Tirino, G., et al. What's New in Gastric Cancer: The Therapeutic Implications of Molecular Classifications and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  10. Roschke, A. V., et al. Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel. Cancer Research. 63 (24), 8634-8647 (2003).
  11. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Xu, C., et al. Patient-derived xenograft mouse models: A high fidelity tool for individualized medicine. Oncology Letters. 17 (1), 3-10 (2019).
  14. Lai, Y., et al. Current status and perspectives of patient-derived xenograft models in cancer research. Journal OF Hematology & Oncology. 10 (1), 106(2017).
  15. Kawaguchi, T., et al. Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).
  16. Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Research. 75 (15), 2963-2968 (2015).
  17. Liu, X., Meltzer, S. J. Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).
  18. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. (7), Cold Spring Harbor. 694-708 (2014).
  19. McDermott, S. P., et al. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  20. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  21. Wege, A. K., et al. Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies. MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мыши NSGимплантация опухолевой тканиподкожное введениеколлагеназное и трипсиновое перевариваниепротокол криоконсервацииокрашивание гематоксилином и эозиномисследования ответа на лекарственные препараты
Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.