Методическая статья

Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции

DOI:

10.3791/59873

⸱

14 августа 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика циркулирующих опухолевых клеток (КТК) является популярной темой в трансляционных исследованиях. Этот протокол описывает полуавтоматический иммунофлуоресценции (IF) анализ для PD-L1 характеристики и перечисления CTCs в немелкоклеточного рака легких (NSCLC) образцов пациентов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующие опухолевые клетки (КТК), полученные из первичной опухоли, проливаются в кровоток или лимфатическую систему. Эти редкие клетки (1–10 клеток на мл крови) требуют плохого прогноза и коррелируют с более коротким общим выживаемостью при нескольких видах рака (например, груди, простаты и колоректальной). В настоящее время, анти-EpCAM покрытием магнитного биса основе CTC захвата системы является золотой стандарт тест, утвержденный США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для перечисления CTCs в крови. Этот тест основан на использовании магнитных бусин, покрытых анти-EpCAM маркеров, которые специально нацелены на эпителиальные раковые клетки. Многие исследования показали, что EpCAM не является оптимальным маркером для обнаружения КТК. Действительно, КТК являются неоднородной субпопуляцией раковых клеток и способны пройти эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ), связанный с метастатическим распространением и вторжением. Эти CTCs способны уменьшить выражение эпителиального маркера поверхности клетки EpCAM, в то время как увеличение мезенхимальных маркеров, таких как виментин. Для устранения этого технического препятствия были разработаны другие методы изоляции, основанные на физических свойствах КТК. Микрофлюидические технологии позволяют без маркировки подходить к обогащению КТК из цельных образцов крови. Спиральная микрофлюидная технология использует инерционные и динские силы сопротивления с непрерывным потоком в изогнутых каналах, генерируемых внутри спирального микрофлюидного чипа. Клетки разделены на основе различий в размерах и пластичности между нормальными клетками крови и опухолевыми клетками. Этот протокол детализирует различные шаги, чтобы охарактеризовать запрограммированное выражение КТК, запрограммированное смертельным лигандом 1 (PD-L1), сочетающее спиральное микрофлюидическое устройство с настраиваемым набором маркеров иммунофлюоресценции (ИФ).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опухолевые антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты (КТЛ) играют решающую роль в ответ на рак через процесс, известный как рак "иммунного эпиднадзора". Их противоопухолевые функции усиливаются антителами блокады иммунных контрольно-пропускных пунктов, такими как ингибиторы CTLA-4 и ингибиторы PD-1/PD-L1. При немелкоклеточном раке легких (NSCLC) анти-PD-1/PD-L1 терапии приводят к реакции ставки от 0%-17% у пациентов с PD-L1-отрицательных опухолей и 36%-100% в тех, кто выражает PD-L1. Надежные реакции на pd-1/PD-L1 блокады наблюдается в меланомы и NSCLC показаны доказательства улучшения общего уровня ответов (RR), прочные клинические преимущества, и прогрессии свободной выживания (PFS). В настоящее время, анти-PD1 лечения являются стандартом ухода в второй линии NSCLC лечение ниволумаб независимо от экспрессии PD-L1 и с pembrolizumab у пациентов, выражающих PD-L1 1%. В первой линии лечения, стандарт ухода pembrolizumab только у пациентов с NSCLC выражения PD-L1 50% и может быть потенциально повышена с помощью химиотерапии (платиновый и дублет препарат в зависимости от гистологического подтипа)1,2.

Тем не менее, такой подход к управлению пациентом является спорным3, так как PD-L1 выражение в опухолевых клетках иммуногистохимии (IHC), вероятно, не самый идеальный спутник биомаркера. Другие, такие как бремя мутации опухоли4 (TMB), микроспутниковой нестабильности (MSI), и / или микробиоты, возможно, интересны в этой обстановке либо в одиночку или в сочетании. NSCLC, как известно, неоднородные опухоли, либо пространственно (от опухоли к другому) или временно (от диагноза до рецидива). Пациенты с NSCLC, как правило, хрупкие, и итеративные инвазивные биопсии тканей может быть проблемой. Действительно, скорость повторной биопсии при первом прогрессии колеблется от 46%-84% в зависимости от серии, а успешная повторная биопсия (имеется в виду гистологический и полный молекулярный анализ) колеблется от 33%-75%. Это означает, что 25%-67% пациентов не могут получить комплексный анализ повторной биопсии во время первой прогрессии5,6,7,8.

Появление "жидкой биопсии", таким образом, вызвало значительный энтузиазм в этой конкретной обстановке, так как это позволяет решающую переоценку молекулярных изменений во время прогрессирования заболевания путем изучения циркулирующих свободной ДНК (cfDNA), полученных из циркулирующих опухолевых клеток (СтК). Эти живые клетки высвобождаются из опухоли в кровоток, где они свободно циркулируют. Хотя анализ кТК обычно не используется, он представляется весьма перспективным в случае молекулярной и фенотипической характеристики, прогноза и прогностического значения при раке легких (через DNAseq, RNAseq, miRNA и анализ белка). Действительно, КТК, вероятно, гавани фенотипические характеристики активного заболевания, а не первоначальные маркеры (обнаруженные на биопсии тканей при постановке диагноза). Кроме того, КТК обходят проблему пространственной неоднородности опухолевой ткани, которая может быть ключевой проблемой при мелкой биопсии. Следовательно, выражение PD-L1 на КТК потенциально может пролить свет на расхождения, полученные от его использования в качестве прогностического биомаркера с использованием опухолевой ткани.

Недавно выражение PD-L1 было протестировано в КТК NSCLC. Почти все пациенты, протестированные9 были PD-L1 положительными, усложняя интерпретацию результата и его клинического использования. В целом, PD-L1-положительные CtCs были обнаружены в 69,4% образцов из в среднем 4,5 клеток / мл10. После начала лучевой терапии, доля PD-L1-положительных КТК значительно увеличилась, что свидетельствует об усилении экспрессии PD-L1 в ответ на излучение11. Таким образом, анализ PD-L1 CTCs может быть использован для мониторинга динамических изменений опухоли и иммунного ответа, которые могут отражать реакцию на химиотерапию, облучение и, вероятно, иммунотерапии (ИТ) лечения.

На сегодняшний день изоляция CTCs и pd-L1 характеристики опираются на различные методы, такие как анти-EpCAM покрытием магнитного биса основе CTC захвата, обогащения основе анализ, и размер на основе12,13 CTC захвата анализов. Тем не менее, КТК были обнаружены только у 45%-65% пациентов с метастатическим NSCLC, тем самым ограничивая их способность предоставлять любую информацию для более чем половины метастатических пациентов NSCLC. Кроме того, количество КТК было низким в большинстве из этих исследований с использованием размера на основе подхода10. Кроме того, этот метод привел к расхождениям, таким как обнаружение клеток CD45(-)/DAPI с "цитоморфологическими моделями злокачественных новообразований" в крови здоровых доноров. Эти опасения подчеркивают необходимость высокочувствительного метода сбора КТК, связанного с иммунной фенотипированием нетипичных клеток CD45(-) из здоровой цельной крови с использованием дополнительных биомаркеров рака (т.е. TTF1, Vimentin, EpCAM и CD44) в NSCLC.

Следовательно, мы оценили спиральный микрофлюидное устройство, которое использует инерционные и Дин перетащить силы для разделения клеток на основе размера и пластичности через микрофлюидный чип. Формирование вихря Дена, присутствующих в микрофлюидных чипов приводит к большей CTCs, расположенных вдоль внутренней стены и меньших иммунных клеток вдоль внешней стены чипа. Процесс обогащения завершается севодок больших клеток в коллекционную розетку в качестве обогащенной фракции CtC. Этот метод является особенно чувствительным и специфическим (обнаружение около 1 КТК/мл цельной крови)14 и может быть связан с индивидуальными иммунофлюоресценции (ИФ) анализами. Эти инструменты позволят установить положительный порог для клинического толкования. Таким образом, описывается рабочий процесс, который позволяет биологам изолировать и иммунофенотип CtCs с высоким уровнем восстановления и специфичности. Протокол описывает оптимальное использование спирального микрофлюидного устройства для сбора КТК, оптимизированные анализы IF, которые могут быть настроены в соответствии с типом рака, и использование свободного программного обеспечения с открытым исходным кодом для измерения и анализа клеточных изображений для выполнения полуавтоматического нумерация клеток в соответствии с флуоресцентным окрашиванием. Кроме того, мультиплексирование микроскопа может осуществляться в зависимости от количества доступных флуоресцентных фильтров/маркеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы были в перспективе собраны в рамках когорты CIRCAN ("CIRculating CANcer"), базирующейся в университетской больнице Лиона после письменного согласия пациента. Это исследование было интегрировано в когорту CIRCAN-ALL. Исследование CIRCAN-ALL было признано неинтервенционным CPP South-East IV от 04/11/2015 под справкой L15-188. Измененный вариант был признан неинтервенционным 20.09.2016 по ссылке L16-160. Исследование CIRCAN-ALL было объявлено корреспонденту по вопросам ИТ и свободы ВИО в Лионе 01/12/2015, под справкой 15-131. Сбор крови был выполнен, когда врачи наблюдали самые ранние признаки прогрессирования опухоли.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте все реагенты и материалы, изложенные в таблице материалов с соответствующими условиями хранения для предварительноаналитической подготовки образца и иммунофлуоресценции. Замена реагентов и/или изменение условий хранения могут привести к неоптимальной производительности ассеа.

1. Обеззараживание спирального микрожидкости устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Обеззараживание спирального микрофлюидного устройства является требованием для удаления всех иммунофлуоресценции фон, порожденных загрязнения бактерий, изучить цитоморфологию КТК, и быть в состоянии дифференцировать их от нормальных иммунных клеток. Протокол оптимизирован для образцов крови, собранных в трубках K2EDTA в течение 6 ч после взятия крови и обогащенный с помощью спирального микрофлюидного устройства в чистых условиях. Использование этого анализа для других типов образцов (других биологических жидкостей) может потребовать дополнительной оптимизации. Этот протокол обеззараживания должен проводиться один раз в неделю.

  1. Подготовка реагентов
    1. Подготовка буфера разбавив
      1. Стерилизовать 20 мл разбавителя добавочных реагентов с помощью фильтра шприца 0,22 мкм и добавить непосредственно к 1 l 1x фосфат буфера солей (PBS) ультра-чистый сорт(Таблица материалов).
    2. Стерилизация реагентов и входиной соломы
      1. Стерилизовать буфер лизиса РБК и буфер повторного действия (RSB; Таблица материалов) с помощью фильтра шприца 0,22 мкм и запаса в новой полипропиленовой конической трубке мощностью 50 мл для каждого раствора.
      2. Стерилизовать входной соломы путем инкубации при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч в универсальный реагент очистки (Таблица материалов). Перенесите солому на основе отбеливателя моющего средства(Таблицаматериалов) и инкубировать на RT в течение 1 ч.
      3. Промыть входну солому дважды стерильным PBS на 1 ч каждый и хранить стерилизованную входну солому в хирургически стерильной сумке(Таблицаматериалов).
  2. Обеззараживание спирального микрофлюидного устройства
    1. Дезинфекция с использованием уницелярного реагента для очистки
      1. Отключите разбавительную крышку бутылки от разбавительного порта спирального микрофлюидного устройства, отвинчивая коричневый винт. Под шкафом микробиологической безопасности, передача до 250 мл универсальный реагент очистки(Таблица материалов) в новую пустую бутылку.
      2. Винт разбавитель крышка бутылки и соломы в бутылку 250 мл универсальный реагент очистки под микробиологической безопасности шкафа. Прикрепите эту бутылку к разбавительному порту спирального микрофлюидного устройства, завинчивая назад коричневый винт.
      3. Передача до 100 мл отбеливателя (1% конечной концентрации; Таблица материалов) в контейнер для отходов, поставляемый в комплекте для запуска(рисунок 1А).
      4. Загрузите новую стерильную вхожную солому на спиральное микрофлюидное устройство(Таблицаматериалов) в вхотливном порту. Загрузите новую центрифугу мощностью 50 мл в вхотливой порт. Загрузите новую центрифугу мощностью 50 мл в выходном порту.
      5. Приступить к премьер спираль микрофлюидного устройства, нажав на прайм на спираль микрофлюидного устройства (3 мин). Удалите вхожаемую трубку после завершения основного грунта.
      6. Передача до 15 мл универсальная моющее реагент на новую центрифужную трубку мощностью 50 мл с серологической пипеткой под шкаф микробиологической безопасности и прикрепите трубку к вхотворному порту спирального микрофлюидного устройства.
      7. Перед запуском убедитесь, что раствор свободен от чрезмерных пузырьков. Если пузырьки присутствуют, удалите их медленным устремлением с помощью пипетки.
      8. Загрузите микрофлюидный чип для обеззараживания в спиральное микрофлюидное устройство. Выполнить программу 3 на спиральный микрофлюидного устройства, нажав на Run и выбрав Программу 3 (31 мин).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Программа 3 спирального микрофлюидного устройства позволяет быстро обогащать КТК за 31 мин.
      9. Продолжить с спиральной микрофлюидной части устройства очистки шаг, используя оставшийся объем универсальный реагент очистки в входной трубки.
      10. Отбросьте входной трубку после завершения шага очистки, оставив после себя входной соломинку.
    2. Обеззараживание с использованием чистящего средства на основе отбеливателя
      1. Отключите универсальную крышку бутылки для очистки от разбавительного порта спирального микрофлюидного устройства, отвинчивая коричневый винт. Под шкафом микробиологической безопасности, передача до 250 мл отбеливателя основе моющего средства(Таблица материалов) в новой пустой бутылке (рисунок1A).
      2. Винт универсальный очистки реагента крышка бутылки и соломы в бутылку, содержащую Bleach основе моющего средства под микробиологический шкаф безопасности. Прикрепите эту бутылку к разбавительному порту спирального микрофлюидного устройства, завинчивая назад коричневый винт.
      3. Передача до 15 мл отбеливателя на основе моющего средства на новый 50 мл центрифуги трубки входну юнитная трубка с помощью серологического пипетки под микробиологической безопасности кабинета. Загрузите положение ввода центрифуги 50 мл. Загрузите пустую трубку в выходное положение.
      4. Перед обработкой запуска, убедитесь, что образец свободен от чрезмерных пузырьков, и если таковые имеются, удалить пузырьки, медленно успокоив их с пипеткой.
      5. Выполнить программу 3, нажав на Run и выбрав программу 3 (31 мин). После запуска, перейдите непосредственно к очистке шаг, используя оставшийся объем отбеливателя на основе чистящего средства в входной трубки.
      6. Отбросьте входные и выходные трубки.
    3. Промыть спиральный микрофлюидное устройство.
      1. Отключите крышку бутылки на основе отбеливателя из разбавительного порта спирального микрофлюидного устройства, отвинчивая коричневый винт. Под шкафом микробиологической безопасности, перенесите солому из бутылки, содержащей моющее средство на основе отбеливателя, в новую бутылку, содержащую разбавитель буфера. Винт бутылку спираль microfluidic устройства.
      2. Передача до 15 мл стерилизованной воды(Таблицаматериалов) в новую центрифугу 50 мл входной трубки с помощью серологического пипетки под шкафом микробиологической безопасности. Загрузите положение ввода центрифуги 50 мл. Загрузите пустую трубку в выходное положение.
      3. Перед обработкой запуска, убедитесь, что образец свободен от чрезмерных пузырьков, и если таковые имеются, удалить пузырьки, медленно успокоив их с пипеткой.
      4. Выполнить программу 3, нажав на Run и выбрав программу 3 (31 мин). После запуска, перейдите непосредственно к очистке шаг, используя оставшийся объем стерилизованной воды в входной трубке.
      5. Отбросьте входные и выходные трубки.

2. Обслуживание для того чтобы держать Спиральmicrofluidic бактерии-свободно

ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярное техническое обслуживание должно быть сделано в конце дня во время последнего шага очистки.

  1. Передача до 7 мл моющего средства на основе отбеливателя в новую центрифугу мощностью 50 мл с помощью серологического пипетки под шкафом микробиологической безопасности. Винт отбеливатель основе очистки трубки в входному порту спираль microfluidic устройства.
  2. Перед обработкой чистого запуска, убедитесь, что входный образец свободен от чрезмерных пузырьков, и если таковые имеются, удалить пузырьки, медленно успокоив их с пипеткой.
  3. Запустите чистую на спиральном микрофлюидном устройстве.

3. Предварительное аналитическое обогащение КТК из образцов крови пациента

  1. Соберите 7,5 мл крови в трубке K2EDTA и держите под нежным возбуждением, чтобы избежать отложений клеток и свертывания крови. Процесс в пределах 6 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь собирается в бесклеточной трубке сбора крови ДНК, содержащей консервант, хранить при 4 градусах Цельсия до обработки. Убедитесь, что образец крови, буфер лисиса РБК и буфер RBS находятся на RT, прежде чем приступить к этапу обогащения.
  2. Передача до 7,5 мл цельной крови в новую центрифугу 50 мл входиной трубки с помощью серологического пипетки под шкафом микробиологической безопасности.
  3. Центрифуга при 1600 х г в течение 10 мин на RT. Соберите плазменную фракцию с пипеткой, не нарушая буйный пальто. Замените плазменную фракцию, добавив непосредственно эквивалентный объем PBS до 7,5 мл.
  4. Аккуратно добавьте буфер лисиса РБК(Таблицаматериалов) к образцу крови до конечного объема 30 мл (для трубки K2EDTA) или 37,5 мл (для трубки для сбора крови без клеток ДНК). Аккуратно инвертировать трубку для сбора крови 10x и инкубировать в течение 10 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец крови становится более красным во время лиза РБК. Если никаких изменений (от темно-красного и непрозрачного) наблюдается после 10 мин, аккуратно инвертировать трубку 3x и оставить стоять еще 5 мин максимум. Не оставляйте образец в буфере лисиса РБК более 15 мин, поскольку он может поставить под угрозу качество образца и производительность анализов.
  5. Центрифуга лизинированный образец крови на 500 х г в течение 10 мин на RT, с центрифугами тормозов на (или высокая скорость замедления). Используйте пипетку Pasteur или серологическую пипетку, чтобы аккуратно удалить супернатант до тех пор, пока объем не достигнет отметки 4-5 мл. Затем используйте отфильтрованные советы микропайпет, чтобы удалить оставшийся супернатант.
  6. Используя микропайпет P1000 с отфильтрованным наконечником, добавьте 1,0 мл RSB к стене входиной трубки центрифуги 50 мл. Чтобы избежать введения пузырьков в смесь, resuspend клетки гранулы осторожно pipetting вверх и вниз, пока образец является однородным.
  7. Добавьте еще 3 мл РСБ к стене входной трубки центрифуги 50 мл (общий объем 4 мл). Избегайте введения пузырьков в смесь. Аккуратно перемешайте клеточную подвеску, аккуратно потянив вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В маловероятном случае, что регулярные pipetting не в состоянии сломать ячейки сгустки (определяется, будучи видимым или блокирование кончика пипетки), фильтр образец через 40 мкм ячейки ситечко, чтобы удалить любые сгустки. Добавьте в образец 150 Л Л RSB, чтобы компенсировать потерю объема от фильтрации. Обратите внимание, что этот метод должен использоваться экономно и только при наблюдении больших скоплений.
  8. Прежде чем перейти к этапу обогащения, убедитесь, что образец свободен от чрезмерных пузырьков и если таковые имеются, удалить пузырьки и заботиться, чтобы не отбросить любой образец. Если крошечные пузырьки присутствуют, их удаление не требуется.
  9. Обработайте образец на спиральном микрофлюидном устройстве.

4. Обогащение КТК от пациента целой крови с помощью спирального микрожидкости

  1. Загрузите новый спиральный микрофлюидный чип. Загрузите две пустые центрифуги 50 мл в входные и выходные порты.
  2. Выполнить премьер, нажав на прайм на спираль микрофлюидного устройства (3 мин). Удалите входные и выходные трубки и загрузите образец для обработки в входином порту.
  3. Загрузите четкую коническую трубку 15 мл в выходном порту для сбора обогащенных CTCs. Выполнить программу 3, нажав на Run и выбрав Программу 3 (31 мин).
  4. Разгрузите выходную трубку и центрифугу при 500 х г на 10 мин (ускорение: 9; замедление: 5). С помощью серологического пипетки 5 мл, удалите супернатантную остановку на отметке 2 мл на конической трубке 15 мл. С помощью микропипетта удалите супернатант, останавливаясь на отметке 100 л на конической трубке 15 мл. Обработайте обогащенный образец непосредственно для окрашивания иммунофлюоресценции.

5. Иммунофлуоресценция окрашивание

  1. Перечислите на камерной горке с сеткой гемоситометра количество ячеек на мл. Разбавить обогащенный образец антисвязным раствором 0,2%(Таблицаматериалов) до концентрации, достигающей 100 000 клеток/100 л на цитоспин.
  2. Смочите контур камеры образца хлопком(Таблицаматериалов) с 50 зл 0,2% антисвязывающего раствора. Поместите полилизин стеклянной слайд в камере образца и закрыть.
  3. Пальто наконечник с 0,2% анти-связывающего решения пайпеттинг вверх и вниз 3x. Отреприжите обогащенный образец и перенесите клеточный раствор в камеру образца. Центрифуга со выделенной центрифугой(Таблица материалов) при 400 об/мин в течение 4 мин (ускорение низкое).
  4. Поместите кремниевый изолятор вокруг области осаждения. Дайте высушить стекло-слайд под шкафом микробиологической безопасности в течение 2 мин.
  5. Подготовьте раствор фиксации, разбавив 1 мл 16% параформальдегида (PFA) 3 мл стерильного PBS. Добавьте 100 кЛ раствора фиксации (4% PFA) на образец и инкубировать на РТ в течение 10 мин. Удалите раствор фиксации и выполните три стирок с 200 Зл PBS и инкубировать на RT каждый в течение 2 мин.
    ПРЕДЕКТО: Используйте PFA под шкафом химической безопасности для предотвращения вдыхания.
  6. Подготовка раствора насыщения путем разбавления сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) на 5%, Fc рецептор (FcR) блокирующий реагент на 5%, и бычьей сыворотки альбумина (BSA) на 1% в стерильной PBS (Таблица материалов). Добавьте 100 кл. раствора насыщения на образец и инкубировать в течение 30 мин на RT. Удалить раствор насыщения.
  7. Добавьте 100 л раствора антител на образец (антитела CD45 1/20; Антитела ПанкК 1/500; Антитела PD-L1 1/200; Сыпучий раствор насыщения 100 л)(Таблицаматериалов). Поместите полилизин стеклянной слайд в 100 мм х 15 мм Петри блюдо. Смочите абсорбцивательную бумагу 2 мл стерильной воды и закройте чашку Петри крышкой. Поместите при 4 градусах на ночь и защитите от света.
  8. Удалите смесь антител и выполнить 3 моет с 200 Зл ТБС инкубации каждой стирки в течение 2 минут. Дайте образцу высохнуть в течение 5 мин и защитите его от света. Поместите 10 зл монтажного раствора(Таблицаматериалов) в область осаждения и накройте микроскопом крышкой, не сделав пузырь. Печать крышки с лаком для ногтей.

6. Приобретение иммунофлуоресцентных изображений с помощью прямого флуоресцентного микроскопа и связанного с ним программного обеспечения

  1. Используйте прямой флуоресцентный микроскоп с моторизованной платформой X/Y. Используйте 20-кратную цель, чтобы взять 8-битные RGB tiff изображения в четырех каналах, соответствующих красителя ДНК (4',6-диамидино-2-фанилиндоль »DAPI), PanCK краситель (флуоресцен изотиоцианат (FITC), PD-L1 краситель (CY3), и CD45 краситель (CY5). Включите ртутную лампу за 15 минут до использования и адаптируйте микроскоп и связанное с ним программное обеспечение к полуавтоматизированной съемке.
  2. Поместите стеклянную горку на платформу.
  3. В меню приобретения определите четыре канала и навяжете время экспозиции (DAPI: 15 мс, FITC (PanCK) : 500 мс; CY3 (PD-L1): 800 мс; CY5 (CD45): 1000 мс). Определите плитки для сканирования. Нажмите плитки. В Эксперименте Advancedопределите область для сканирования.
  4. Отрегулируйте фокус на экране. Нажмите Запуск эксперимента.
  5. Экспортировать файлы TIF каждого канала и конкретно называть файл изображения с помощью этой информации: Sample-NumberofTilesRegion-dye-NumberOfSubtiles.tif (например, Sample1'TR1'c1m01). Название красителя следующим образом: канал DAPI является c1, канал FITC c2, cy3 канал c3, и CY5 канал c4.

7. Анализ иммунофлуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений

  1. Скачать и установить бесплатное программное обеспечение для анализа изображений с веб-сайта Института Широкой. Примите все по умолчанию во время установки. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и нажмите файл (ru) Трубопровод из файла Анализ: 4каналы-CTC.cppipe.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер преобразует цветные изображения RGB в серую шкалу, удаляет артефакты, сглаживая изображения средним фильтром, идентифицирует ядра и цитоплазму, количественно увеличивает интенсивность флуоресценции каждого канала и экспортирует их в файл Excel.
  2. Удаление файлов в списке файлов. Обновление метаданных для группы файлов по плиточок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструкции по групповому изображению указаны в программном обеспечении. Файлы имен, появившиеся в модуле NamesAndTypes, и файлы группируются в зависимости от количества плитки и канала на образцы.
  3. Нажмите параметры вывода просмотра и укажите правильный выход по умолчанию. Нажмите Анализ изображений. Откройте файл электронной таблицы, соответствующий параметрам измерения интенсивности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первым предпосылкой было получение незагрязненных (безинфекционных) коллекций КТК для культуры тканей и предотвращение фона IF. Протокол обеззараживания позволил очистить все трубы и насосы, и это привело к сбору КТК с хорошей скоростью восстановления без бактериального загрязнения. Обогащенные образцы сравнивались без и с рабочим процессом протокола обеззараживания спирального микрофлюидного устройства. Для проверки протокола обеззараживания линия клеток A549 использовалась при отсутствии цельной крови и обогащалась неп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем исследовании были подняты два основных вопроса: первый в отношении эффективности рабочего процесса для его передачи в клинические приложения, а второй - снижение субъективности анализа полученных изображений флуоресценции.

Перформатора и оптимизированный рабочий процесс для перечисления CTC был первоначально определен с помощью настраиваемых анализов IF после обогащения клеток с помощью микрофлюидной системы CTC (спиральное микрофлюидное устройство). Используя этот рабочий процесс,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jean-Philippe Aurel и Kathryn Weiqi Li являются сотрудниками компании Biolidics, которая производит инструменты, используемые в этой статье. Другим авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами от Компании АстраЗенека (Лондон, Соединенное Королевство), Biolidics (Сингапур) и Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Франция). Авторы благодарят компании «АстраЗенека» и «Биолидика» за финансовую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4',6-диамидино-2-phé nylindole (DAPI)OzymeBLE 422801Условия хранения: +4 ° C
BD Facs Clean – 5 лBD Biosciences340345Чистящее средство на основе отбеливателя. Условия хранения: Отбеливатель комнатной температуры
1% Чистящий раствор 100 млBiolidicsCBB-F016012Отбеливатель. Условия хранения: Бычья
сыворотка альбумин (BSA) 7,5%SigmaA8412Условия хранения: +4 °°; C
CD45 моноклональное антитело (клон HI30) Alexa Fluor 647BioLegendBLE304020Условия хранения: +4 ° C
CellProfiler SoftwareBroad InstituteПрограммное обеспечение для анализа изображений
ЦентрифугаHettich4706Условия хранения: Комнатная температура
Центрифужная пробирка 50 млCorning430-829Условия хранения: Комнатная температура
Центрифужная пробирка 15 млBiolidicsCBB-F001004-25Условия хранения: Комнатная температура
ClearCell FX-1 SystemBiolidicsCBB-F011002Спиральный микрофлюидный аппарат. Условия хранения: Комнатная температура
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 лBeckman Coulter8448222универсальное чистящее средство. Условия хранения:
CTChip FR1SBiolidicsCBB-FR001002комнатной температуры. Условия хранения: Комнатная температура
Cytospin 4ThermoFisherA78300003Условия хранения: Комнатная температура
Разбавляющая добавка Реагент – 20 млBiolidicsCBB-F016009Условия хранения: +4 °°; C
EZ ЦитоворонкиThermoFisherA78710003Камера для образцов с ватой. Условия хранения: Комнатная температура
FcR Блокирующий агентMiltenyi Biotec130-059-901Условия хранения: +4 °°С; C
Фетальная сыворотка для телят (FCS)Gibco10270-106Условия хранения: +4 °°; C
ФлюоромонтSigmaF4680Монтажное решение. Условия хранения: Фунгизон комнатной температуры
- 50 мгBristol-Myers-Squibb90129TB29Противогрибковый реактив. Условия хранения: +4 °°С; C
FX1 Входная соломинка с замковым колпачкомBiolidicsCBB-F013005Соломинка. Условия хранения: Комнатная температура
KovaSlideDutscher50126Chambered slide. Условия хранения:
Моноклональное антитело PanCK комнатной температуры (клон AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisher53-9003-80Условия хранения: +4 °°Град; C
Параформальдегид 16%ThermoFisher11490570Раствор для фиксации. Условия хранения: +4 °°С; C
PD-L1 моноклональное антитело (клон 29E2A3) - PhycoerythrinBioLegendBLE329706Условия хранения: +4 °deg; C
Чашка ПетриDutscher632180Условия хранения: Комнатная температура
Фосфатно-солевой буфер (PBS)OzymeBE17-512FУсловия хранения: +4 °°; C
Фосфат Буферный Солевой Ультрачистый Класс 1x – 1 л1-я базовая лабораторияBUF-2040-1X1LУсловия хранения: Комнатная температура
Pluronic F-68 10%Gibco24040-032Противосвязывающий раствор. Условия хранения:
Полилизиновые слайдыThermoFisherJ2800AMNZУсловия хранения:
Полипропиленовая коническая трубка комнатной температуры 50 млFalcon352098Условия хранения: Буфер для лизиса RBC при комнатной температуре
– 100 млG Biosciences786-649Условия хранения: +4 °°; C
RBC Lysis Buffer – 250 млG Biosciences786-650Условия хранения: +4 ° C
Ресуспензионный буфер (RSB)BiolidicsCBB-F016003Условия хранения: +4 °°; C
Shandon Cytopsin4 центрифугаThermoFisherA78300003Специализированная центрифуга. Условия хранения: Комнатная температура
Силиконовый изоляторGrace bio-Labs664270Условия хранения: Комнатная температура
Стерильная деионизированная вода – 100 мл1-я базовая лабораторияCUS-4100-100млУсловия хранения: Комнатная температура
Прямой флуоресцентный микроскоп Axio Imager D1ZeissУсловия хранения: Комнатная температура
Хирургическая Стерильная СумкаSPS Laboratoires98ULT01240Условия хранения: Комнатная температура
Шприц BD Discardit II 20 мл стерильныйBD Biosciences300296Условия хранения: Комнатная температура
Шприц Фильтр 0,22 &; м 33 мм стерильныйClearLine51732Условия хранения: Комнатная температура
Zen lite 2.3 Lite Программное обеспечениеZeissMicroscope соответствующее программное обеспечение
Микрофлюидный чип комнатной температуры

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175(2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726(2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566(2019).
  12. Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23(2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597(2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409(2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Circulating Tumor CellsPD L1 CharacterizationSpiral Microfluidic DeviceImmunofluorescence StainingCTC EnrichmentCytospin PreparationImage Analysis SoftwareFluorescent MicroscopyBlood Sample ProcessingEpithelial to Mesenchymal Transition

Похожие статьи