Данная статья представляет пошаговое руководство по изучению динамики субклеточной локализации белка и мониторингу морфологических изменений с помощью флуоресценционной микроскопии высокого разрешения в Bacillus subtilis и staphylococcus aureus.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресценция live-Cell для изучения локализации субклеточного белка и изменения клеточной морфологии в бактериях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследования факторов, влияющих на деление клеток и форму клеток в бактериях, обычно выполняются в сочетании с флуоресценцией высокого разрешения, поскольку наблюдения, сделанные на уровне популяции, могут не отражать то, что происходит на уровне одной клетки. Видеоклеточная микроскопия таймлапса позволяет следователям отслеживать изменения в делении клеток или морфологии клеток, которые дают ценную информацию относительно субклеточной локализации белков и времени экспрессии генов, как это происходит, потенциально помогает в ответе на важные биологические вопросы. Здесь мы описываем наш протокол для мониторинга фенотипических изменений в Bacillus subtilis и staphylococcus aureus с помощью микроскопа деконволюции высокого разрешения. Цель юного доклада состоит в том, чтобы обеспечить простой и четкий протокол, который может быть принят другими следователями, заинтересованными в проведении экспериментов флуоресценции микроскопии для изучения различных биологических процессов в бактериях, а также других организмов.
Введение
Поле бактериальной биологии клеток была значительно расширена в последнее время достижения в микроскопии методы1,2. Среди других инструментов, микроскопы, которые способны проводить timelapse флуоресценции микроскопических экспериментов остаются ценным инструментом. Исследователи могут контролировать различные физиологические события в режиме реального времени с помощью флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) на основе транскрипционного и трансляционного репортера слияний, флуоресцентные D-аминокислоты (FDAA)3, или использовать другие пятна для обозначения кл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Общие условия роста
- Прививать 2 мл соответствующей среды роста дополнен антибиотиками (при необходимости) с одной колонией штамма (ы), чтобы быть изображены. Инкубировать эти культуры семян на ночь при 22 градусах Цельсия в дрожащего инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные условия роста бактерий, используемые в этой статье, предоставляются в разделе репрезентативных результатов. - Разбавить ночные культуры 1:20 в свежих носителях в колбе 125 мл, дополнить антибиотиками (там, где это необходимо).
- Расти культуры (ы) при 37 градусов по Цельсию в трясущихся инкубатора до середины логарифмической фазы (OD600 и 0,5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Фенотипы GPSB
Ранее мы показали, что Sa-GpsB является важным белком, как истощение GPSB с помощью антисмысловой РНК приводит к лизам клетки9. Здесь мы описываем, как появление различных фенотипов деления клеток и изменения в локализации белка могут быть захвачены с помощью протокола микроскопии таймлапса, описанного в этой статье. Для этого, S. aureus штаммов RB143 "SH1000 укрывательство pEPSA5 (пустой вектор) » и GGS8 »SH1000 укрывательство pGG59 (Px.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроскопия остается основой в исследованиях, относящихся к микробным организмам. Учитывая их размер клеток микрон, одноклеточные исследования традиционно опирались на электронную микроскопию (ЭМ). Хотя EM стал довольно мощным методом в последние годы, он имеет свои собственные внутренние ограничения в дополнение к ограниченному доступу пользователей16. Улучшения в методах флуоресценции микроскопии и развитие различных флуоресцентных зондов, таких как FDAA3, предоставили ми.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим наших сотрудников лаборатории за их комментарии к этой статье. Эта работа была профинансирована за счет стартового гранта от Университета южной Флориды (PE).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агароза | Фишер Биореактивы | BP160-100 | Молекулярная биология Класс - низкий EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Микроскопия |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Микроскопия |
| Стеклянная нижняя чашка | MatTek | P35G-1.5-14-C | Микроскопия |
| IPTG | Fisher Биореактивы | BP1755-10 | Без |
| Микроскоп | GE | DeltaVision Elite | Custom Olympus IX-71 Инвертированная подставка для микроскопа; Специальная осветительная башня и модуль осветителя проходящего света. Объективы: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 мм); МАСЛО OLY 100X (N.A. 1.4, WD 0.12 мм); DIC призма Nomarski для 100-кратного объектива; камера CoolSnap HQ2; SSI сборка 7-цветная; Камера контроля окружающей среды - непрозрачная. |
| PC190723 | Ингибитор MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ |
| SoftWorx | GE | Программное обеспечение для визуализации, поставляемое производителем |
Ссылки
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
