Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресценция live-Cell для изучения локализации субклеточного белка и изменения клеточной морфологии в бактериях

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59905

⸱

23 ноября 2019 г.

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, University of South Florida

В этой статье

Краткое содержание

Данная статья представляет пошаговое руководство по изучению динамики субклеточной локализации белка и мониторингу морфологических изменений с помощью флуоресценционной микроскопии высокого разрешения в Bacillus subtilis и staphylococcus aureus.

Аннотация

Исследования факторов, влияющих на деление клеток и форму клеток в бактериях, обычно выполняются в сочетании с флуоресценцией высокого разрешения, поскольку наблюдения, сделанные на уровне популяции, могут не отражать то, что происходит на уровне одной клетки. Видеоклеточная микроскопия таймлапса позволяет следователям отслеживать изменения в делении клеток или морфологии клеток, которые дают ценную информацию относительно субклеточной локализации белков и времени экспрессии генов, как это происходит, потенциально помогает в ответе на важные биологические вопросы. Здесь мы описываем наш протокол для мониторинга фенотипических изменений в Bacillus subtilis и staphylococcus aureus с помощью микроскопа деконволюции высокого разрешения. Цель юного доклада состоит в том, чтобы обеспечить простой и четкий протокол, который может быть принят другими следователями, заинтересованными в проведении экспериментов флуоресценции микроскопии для изучения различных биологических процессов в бактериях, а также других организмов.

Введение

Поле бактериальной биологии клеток была значительно расширена в последнее время достижения в микроскопии методы1,2. Среди других инструментов, микроскопы, которые способны проводить timelapse флуоресценции микроскопических экспериментов остаются ценным инструментом. Исследователи могут контролировать различные физиологические события в режиме реального времени с помощью флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) на основе транскрипционного и трансляционного репортера слияний, флуоресцентные D-аминокислоты (FDAA)3, или использовать другие пятна для обозначения клеточной стенки, мембраны и ДНК. Поэтому неудивительно, что флуоресцентная микроскопия остается популярной среди микробных клеток биологов. В дополнение к просто показывать конечные фенотипы, предоставляя информацию о том, как наблюдаемые фенотипы возникают с помощью timelapse микроскопии может добавить значительную ценность для выводов и потенциально предлагают подсказки относительно того, что клеточные процессы в настоящее время мишенью потенциальных кандидатов наркотиков4.

Протоколы для проведения изображений высокого разрешения с использованием полностью моторизованного, перевернутого широкоугольного флуоресценционного микроскопа (см. таблицу материалов)предусмотрены в этой статье. Эти протоколы могут быть адаптированы в соответствии с потребностями других флуоресцентных микроскопов, которые способны проводить таймлапс микроскопию. Хотя программное обеспечение обсуждается здесь соответствует конкретным производителем поставляется программное обеспечение, как указано в таблице материалов, программное обеспечение обычно поставляется другими производителями микроскопа или свободно доступны ImageJ5, имеют эквивалентные инструменты для анализа данных микроскопии. В условиях, когда промежуток времени не является благоприятным, эксперименты по временному курсу могут быть проведены, как описано в настоящей статье. Описанные здесь протоколы содержат подробное руководство по изучению фенотипических изменений в двух различных бактериальных видах: B. subtilis и S. aureus. См Таблица 1 для используемых штаммов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Общие условия роста

  1. Прививать 2 мл соответствующей среды роста дополнен антибиотиками (при необходимости) с одной колонией штамма (ы), чтобы быть изображены. Инкубировать эти культуры семян на ночь при 22 градусах Цельсия в дрожащего инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные условия роста бактерий, используемые в этой статье, предоставляются в разделе репрезентативных результатов.
  2. Разбавить ночные культуры 1:20 в свежих носителях в колбе 125 мл, дополнить антибиотиками (там, где это необходимо).
  3. Расти культуры (ы) при 37 градусов по Цельсию в трясущихся инкубатора до середины логарифмической фазы (OD600 и 0,5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индуктор или ингибитор могут быть добавлены непосредственно к растущей культуре (ы) на соответствующей фазе роста.
  4. Клетки урожая при желаемых культурных условиях для подготовки образца микроскопии, как описано в следующем разделе.

2. Подготовка образцов

  1. Подготовка 1% агарозы путем объединения 0,25 г молекулярной биологии класса, низкий EEO, агарозс с либо 25 мл среды роста дополняется соответствующими антибиотиками (где это необходимо) для timelapse микроскопии или стерильной воды. Нагрейте смесь с помощью микроволновой печи примерно 30 с и вылейте ее в стерильные 100 мм х 15 мм Петри блюдо и дайте ему затвердеть.
  2. Возьмите 5-50 qL aliquot клеточной культуры в зависимости от необходимости и пятно клеток. Пятноклетки с соответствующими красителями на данном этапе (например, добавить флуоресцентный краситель FM4-64 (мембранное пятно) для эксперимента(рисунок 1)).
    1. Pipette a 5 qL aliquot образца культуры или окрашенных образец, который будет изображен на дне 35 мм стекла нижней культуры блюдо (с 14 мм диаметром микроколодца и непокрытой No 1.5 coverslip; см. таблицу материалов).
      ВНИМАНИЕ: Не используйте поли-L-лизин покрытием крышки особенно для timelapse микроскопии, поскольку они могут вызвать различные модели роста (мы наблюдали это с поли-D-лизин, а также; данные не показаны) и / или влияют на динамику белка6.
    2. Чтобы свести к минимуму использование красителей, пятно 3-4 л клеточной подвески (собранные на OD600 и 0,5; примерно 2,7 х 107 и 3,4 х 107 для B. subtilis и S. aureus соответственно на 1 мл культуры) непосредственно на стеклянное дно блюдо.
    3. Поместите предварительно вырезанную плиту агарозы (11 мм в диаметре или любого желаемого размера, чтобы перекрыть область покрытия; вырезать с помощью открытого конца стерильной трубки или лезвия бритвы) на верхней части образца и аккуратно нажмите, чтобы убедиться, что плита агарозы лежит плашной против крышки.
  3. После визуализации (см. следующий раздел), если количество клеток в поле зрения нежелательно, отрегулируйте плотность клеток образца с помощью разбавления или концентрации путем центрифугирования и измените соотношение клеток в образце, используя среднюю динамику роста/буфер по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму автофлюоресценцию, исходящая из культуры среды, клетки могут быть промыты в буфере (например, в стандартном 1x фосфатном буфере солине) и перекрывать в соответствующем количестве буфера до визуализации. Вполне возможно, что на этом шаге меньшие клетки или пузырьки не могут быть сохранены после центрифугации и, следовательно, будут потеряны.
  4. Добавьте воду с помощью пипетки (капель ы 5 л) в пространство внутри блюда культуры (вокруг покрывала), чтобы предотвратить высыхание агарозной площадки, а также помочь поддерживать влажность в ходе приобретения изображения, особенно для экспериментов по таймлапсу.
  5. Разрешить культуре блюда уравновесить температуру внутри инкубационного камеры, встроенный непрозрачный отсек, предоставляемый производителем, микроскопа в течение 15-20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите нагревательный элемент и установите инкубационную камеру до нужной температуры за несколько часов до визуализации. Это гарантирует, что аппаратное обеспечение стабилизируется до новой температуры. Для длительного таймлапс изображения, поместите стакан или колбу с водой внутри микроскопа камеры, вдали от рабочей области, для поддержания влажности.

3. Визуализация

  1. В день эксперимента включите систему микроскопа. Начните программное обеспечение для визуализации (см. Таблица Материалов),нажав на соответствующую иконку на рабочем столе. Инициализовать микроскоп, нажав опцию Initialize Microscope (кнопка, изображенная с микроскопом на нем) на стартовом диалоговом поле программного обеспечения. Убедитесь, что цель полностью снижена с помощью микроскопа грубой корректировки до инициализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После инициализации в дополнение к меню «Пуск» должны появиться три дополнительных диалоговые поля: resolve3D, сбор данных и монитор фильтра.
  2. Поместите падение масла на 1,517 (рефракционный индекс) на цель погружения масла в 100 x, поставляемая производителем (Число в диафрагме 1,4, Рабочее расстояние 0,12 мм; см. Таблицу Материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выбрать подходящее масло погружения для температуры, при которой проводится визуализация.
  3. Загрузите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую образец, в металлический корпус (гроб) и аккуратно сдвиньте в сценический зажим.
  4. Используйте грубую ручку регулировки, чтобы поднять цель, пока масло не соприкоснутся со стеклянным дном тарелки. Используйте кусок глаза и тонкой ручкой регулировки, чтобы привести образец в фокусе. После того, как клетки в центре внимания свою очередь, ручка от части глаза в режим камеры, перемещая переключатель селектора, расположенный на передней части тела микроскопа влево.
  5. Начните эксперимент с использованием программного обеспечения для визуализации. На окне resolve3D выберите значок эксперимента Design/Run, изображенный колбой. Новый диалоговый ящик должен отображаться озаглавленным экспериментом проектирования/запуска.
    1. Установите количество стеков и толщины образца с помощью дизайна, а затем разделите вкладку на диалоговом поле для проектирования/запуска эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов в разделе репрезентативных результатов были использованы 17 стеков с интервалом 200 нм для неподвижных изображений и четыре стеки с интервалом 200 нм для микроскопии таймлапса.
    2. Чтобы измерить толщину клеток в образце, вручную отрегулируйте плоскость постепенно, используя стрелки вверх и вниз на диалоговом поле resolve3D. Отметьте, где ячейки выходят из фокуса в качестве верхнего и нижнего предела для приобретения изображения. Импортируйте эту информацию до запуска эксперимента.
    3. Чтобы свести к минимуму фототоксичность и фотоотрубь во время визуализации таймлапса, уменьшите количество стеков и выберите середину плоскости ячеек для приобретения изображения.
  6. Выберите подходящий набор фильтров для эксперимента, используя проектную, а затем вкладку каналов на диалоговом окне диалога для проектирования/запуска (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
    1. Кроме того, выберите ссылку для сбора информации POL/DIC. Отрегулируйте процентную передачу (интенсивность света) и продолжительность экспозиции для отдельных каналов, выбранных до визуализации, выбрав подходящие варианты на диалоговом поле resolve3D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В тестовом поле зрения, которое не рассматривается для эксперимента тест этих параметров, чтобы определить, если выбранные параметры получают значимые данные флуоресценции, не пропуская слабый сигнал или перенасыщения его. Затем импортируйте эти параметры для экспериментальной настройки.
  7. Откройте список точек, выбрав кнопку списка очков в диалоговом поле resolve3D. Новый диалоговые окна должны появиться озаглавленный список точек. Отметьте несколько полей зрения, которые будут использоваться в эксперименте, найдя соответствующие поля зрения с помощью элементов управления этапом микроскопа и выбрав параметр точки отметки в диалоговом поле списка точек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точка замены должна быть выбрана каждый раз, когда микроскоп переориентируется на точку в списке точек. Это можно сделать, сосредоточив микроскоп на соответствующей точке списка, а затем выбрав кнопку заменить точку. При переориентации важно не прикасаться к аналоговой грубой/тонкой регулировке ручки; использовать только программное обеспечение для настройки фокуса.
  8. Установите параметры таймлапса, сначала выбрав дизайн, а затем займем timelapse на поле диалога эксперимента проектирования/запуска. Выберите флажок timelapse. Введите соответствующие параметры таймлапса с точки зрения таймлапс изображения / общее время.
  9. Установите точки, которые будут изображены из списка точек, сначала выбрав дизайн, а затем назначайте вкладку на диалоговом поле для проектирования/запуска эксперимента. Выберите вариант списка пунктов посещения и введите точки для изображения в текстовом поле, разделенном запятыми или дефисами, если это полная последовательность.
  10. Перед началом эксперимента отодевать имена файлов и местоположения файлов с помощью вкладки "Запуск" в поле диалога проектирования/запуска. Местоположение файла можно изменить, выбрав кнопку настроек, выбрав папку данных и выбрав соответствующую папку или создав новую. Измените имена файлов, введя новое имя файла в текстовом поле с именами изображений.
  11. Начните эксперимент, выбрав кнопку воспроизведения в диалоговом поле начала эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для timelapse, постоянно проверяйте фокус в каждом поле зрения на протяжении всего эксперимента с использованием настройки DIC (чтобы избежать ненужного отбеливания) и переориентировать и обновить информацию в списке точек, как клетки, как правило, выходят из фокуса с течением времени.

4. Обработка изображений

  1. Откройте желаемые необработанные (R3D) файлы изображений для генерации фигур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно сохраненные файлы могут быть расположены с помощью кнопки папки данных в стартовом диалоговом окне программного обеспечения для визуализации.
  2. Выполнить программу деконволюации, чтобы удалить вне фокуса флуоресценции свет7,8, для того, чтобы произвести десятиволвированный d3D файл изображения. Выберите вкладку процесса на поле для запуска диалога, а затем выберите deconvolve. Появится новый диалоговый ящик под названием deconvolve.
    1. Установите параметры деконволюции, перетащив соответствующее число изображений (расположено в верхнем левом углу каждого файла изображения) к входному диалоговому окводуции. На поле диалога деонволюции выберите кнопку «Больше параметров» и отображайте сворачивание границы урожая после обработки флажка (в противном случае изображения не могут быть наложены на соответствующий файл DIC).
    2. Нажмите кнопку сделайте это на деконволюционном диалоговом поле, чтобы деконволвировать необработанный файл изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры деконволюции могут быть скорректированы в качестве указания производителя программного обеспечения для желаемых результатов.
  3. При необходимости выполняйте ручное фоновое шумовое вычитание и регулировку яркости/контрастности в любых или всех каналах длины волны (цветных). Сделайте это, выбрав кнопку регулировки контраста на файле изображения deconvolved.
  4. Сохраните изображение в виде файла TIFF, сначала выбрав опцию файла в верхней части диалогового окна D3D. Затем выберите сохранение в качестве TIFF, определите и выберите подходящие стеки (которые находятся в фокусе), выберите или не выберите желаемые наборы фильтров.
  5. Выполняйте количественную оценку данных с помощью любого программного обеспечения, поставляемого изготовителем, или свободно доступных программ, таких как ImageJ5.
    1. Для количественной оценки размера ячейки нажмите на вкладку инструмента на соответствующем файле изображения D3D, а затем выберите опцию измерения расстояний. Измерьте расстояния, выбрав точки начала и конца на желаемом файле изображения с помощью мыши через левые клики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего увеличить изображение во время количественной оценки размера ячейки.
    2. Для количественной оценки сигнала флуоресценции используйте опцию инспектора данных под вкладкой инструмента на соответствующем файле изображения D3D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего увеличить изображение и иметь только соответствующие фильтры, выбранные при выполнении количественной оценки сигнала флуоресценции.
    3. Чтобы количественно определить сигнал флуоресценции, нарисуйте поле с опцией столбца/строки, установленной для определенного измерения. Выберите область с сигналом, который будет количественно определен, и запишите значение. Измерьте фоновый сигнал, используя поле того же размера, чтобы выбрать область непосредственно за пределами ячеек. Вычесть фоновое значение из значения, записанного из сигнала флуоресценции, полученного в ячейке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Фенотипы GPSB
Ранее мы показали, что Sa-GpsB является важным белком, как истощение GPSB с помощью антисмысловой РНК приводит к лизам клетки9. Здесь мы описываем, как появление различных фенотипов деления клеток и изменения в локализации белка могут быть захвачены с помощью протокола микроскопии таймлапса, описанного в этой статье. Для этого, S. aureus штаммов RB143 "SH1000 укрывательство pEPSA5 (пустой вектор) » и GGS8 »SH1000 укрывательство pGG59 (Px...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроскопия остается основой в исследованиях, относящихся к микробным организмам. Учитывая их размер клеток микрон, одноклеточные исследования традиционно опирались на электронную микроскопию (ЭМ). Хотя EM стал довольно мощным методом в последние годы, он имеет свои собственные внутренние ограничения в дополнение к ограниченному доступу пользователей16. Улучшения в методах флуоресценции микроскопии и развитие различных флуоресцентных зондов, таких как FDAA3, предоставили ми...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим наших сотрудников лаборатории за их комментарии к этой статье. Эта работа была профинансирована за счет стартового гранта от Университета южной Флориды (PE).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозаФишер БиореактивыBP160-100Молекулярная биология Класс - низкий EEO
DAPIInvitrogenD3571Микроскопия
FM4-64InvitrogenT3166Микроскопия
Стеклянная нижняя чашкаMatTekP35G-1.5-14-CМикроскопия
IPTGFisher БиореактивыBP1755-10Без
МикроскопGEDeltaVision EliteCustom Olympus IX-71 Инвертированная подставка для микроскопа; Специальная осветительная башня и модуль осветителя проходящего света. Объективы: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 мм); МАСЛО OLY 100X (N.A. 1.4, WD 0.12 мм); DIC призма Nomarski для 100-кратного объектива; камера CoolSnap HQ2; SSI сборка 7-цветная; Камера контроля окружающей среды - непрозрачная.
PC190723Ингибитор MilliporeSigma3445805MGFtsZ
SoftWorxGEПрограммное обеспечение для визуализации, поставляемое производителем
диоксана

Ссылки

  1. Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
  2. Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
  3. Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
  4. Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
  5. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  6. Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
  8. Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
  9. Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
  10. Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
  11. Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
  12. Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
  13. Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).
  14. Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
  15. Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  16. Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
  17. Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
  18. Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
  19. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
  20. Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
  21. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  22. Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).
  23. Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Bacillus subtilisStaphylococcus aureus
Флуоресценция live-Cell для изучения локализации субклеточного белка и изменения клеточной морфологии в бактериях
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.