Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизация, дизайн и предотвращение ловушек в ручном мультиплексфлюсцентной иммуногистохимии

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59915

⸱

26 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии является новой технологией, которая позволяет визуализации нескольких типов клеток в нетронутой формалин фиксированной, парафин встроенных (FFPE) ткани. Представлены руководящие принципы для обеспечения успешного 7-цветного мультиплекса с инструкциями по оптимизации антител и реагентов, подготовке слайдов, дизайна и советов для избежания общих проблем.

Аннотация

Оценка микроокружения нетронутой ткани для анализа инфильтрации клеток и пространственной организации имеет важное значение для понимания сложности процессов заболевания. Принцип методы, используемые в прошлом включают иммуногистохимии (IHC) и иммунофлуоресценции (ИФ), которые позволяют визуализации клеток в качестве снимка во времени, используя между 1 и 4 маркеров. Оба метода имеют недостатки, включая трудности с окрашиванием плохо антигенных целей и ограничения, связанные с реактивностью кросс-видов. IHC является надежным и воспроизводимым, но характер химии и опоры на спектр видимого света позволяет использовать лишь несколько маркеров и затрудняет локализацию. Использование IF расширяет потенциальные маркеры, но обычно полагается на замороженные ткани из-за обширной аутофлуоресценции тканей после фиксации формалина. Цитометрия потока, метод, который позволяет одновременное обозначение нескольких эпитопов, отменяет многие недостатки IF и IHC, однако, необходимость изучения клеток, как одна суспензия клеток теряет пространственный контекст клеток отбрасывая важные биологические Отношения. Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) мосты эти технологии, позволяющие мульти-эпитоп клеточного фенотипирования в форминале фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани при сохранении общей архитектуры микросреды и пространственной отношения клеток в нетронутой ненарушенной ткани. Высокофюмиорная интенсивность флюорофоров, которые ковалентно связи с эпитопом ткани позволяет несколько применений первичных антител, не беспокоясь видов конкретных кросс-реактивность вторичных антител. Хотя эта технология была доказана для получения надежных и точных изображений для изучения болезни, процесс создания полезной стратегии mfIHC окрашивания может быть трудоемким и требовательным из-за обширной оптимизации и дизайна. Для того, чтобы сделать надежные изображения, которые представляют точные клеточные взаимодействия на месте и смягчить период оптимизации для ручного анализа, представленные здесь методы подготовки слайда, оптимизация антител, мультиплекс дизайн, а также ошибки часто встречаются во время процесса окрашивания.

Введение

Визуализация нетронутой микросреды опухоли (TME) имеет важное значение в оценке не только клеточной инфильтрации в твердых злокачественных новообразований, но и клеточных взаимодействий. Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) стал эффективным инструментом для мультиантигена фенотипирования клеток в исследовании рака и связанных с ними заболеваний1,2,3,4, 5,6,7. Это, в сочетании с новым программным обеспечением и программами,предназначенными для анализа больших наборов данных, позволяет наблюдать за сложными взаимодействиями между ячейками 1,2,4. Коэффициентом ограничения скорости при получении данных часто является качество окрашенных тканей до анализа.

Предыдущие методы, используемые для фенотипных клеток в TME включают иммуногистохимию (IHC), иммунофлуоресценцию (ИФ) и цитометрию потока, все из которых представляют значительные ограничения. IHC использует формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани разделы, которые депарафинизированы и регидратированных до того, окрашенные чаще всего одно антитела. Использование хрена пероксидазы (HRP) связаны вторичные антитела и химической реакции позволяет визуализации одного антигенного эпитопа8. В то время как IHC является надежным и выполняется на ткани FFPE, с которой легко работать, ограничения видимого спектра света означают, что только один или два маркера могут быть надежными различимыми и колокализации антигенов довольно трудно8. Способ расширить доступные маркеры и, следовательно, антигены, которые могут быть исследованы на одном разделе, чтобы изменить на флуоресценцию, которая позволяет использовать более широкий спектр визуального спектра. Для IF, замороженные или FFPE ткани переносится на слайды и антитела, используемые, которые спрягаются с различными флюорофорами. Хотя это увеличивает количество антигенов, которые могут быть проверены, Есть несколько важных ограничений. Во-первых, потому что каждое антитело обычно имеет только один флюорофор прилагается, яркость часто не достаточно сильны, чтобы преодолеть аутофлуоресценции тканей. Именно по этой причине, большинство IF выполняется на замороженных тканей, которые дорого хранить и трудно работать. Ограниченное количество флуоресцентных меток доступны для использования из-за спектрального перекрытия и перекрестной реактивности видов, особенно при использовании неконъюгированных антител. Поток цитометрии, которая состоит из обработки свежей ткани в одну клетку подвески и маркировки флуоресцентными антителами был золотым стандартом для иммунофенотипирования на протяжении десятилетий9,10. Преимуществоциетрии потока является способность маркировать несколько антител без заботы о поперечной реактивности видов, поскольку большинство из них спряженные. Потому что клетки "визуализированы" машиной, а не человеческие глаза, Есть гораздо больше фторофоров доступны, но это поставляется с затратами. Компенсация должна производиться вручную, что может существенно изменить результаты, приносящие ложноположительные и отрицательные результаты. Наиболее значительным ограничением цитометрии потока является то, что архитектура тканей и впоследствии вся пространственная информация теряется из-за необходимости подвески одиночных клеток.

Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) с использованием автоматизированного флуоресцентного микроскопа в сочетании с новым программным обеспечением сочетает в себе преимущества IHC, IF и цитометрии потока, позволяя мульти-антигенной ткани окрашивания с усиливанием сигнала и сохранение пространственных отношений без необходимости компенсации. Ткань FFPE помещается на заряженные слайды, которые после поиска антигена, проходят раунд первичного применения антител к целевому антигену интереса, а затем вторичное антитело с химическим тегом HRP, похожим на IHC. После размещения вторичного антитела, СПЕЦИФИЧЕСКая реакция HRP приводит к флюорофору ковалентно связывая с эпитопом интереса11. После того, как ткань помечена, еще один раунд нагрева слайдов завершается удаление ранее прикладного первичного и вторичного комплекса антител, оставляя только флуоресцентный тег, привязанный к эпитопу ткани11. Это позволяет использовать несколько антител любого вида без опасений за перекрестную реактивность11,12. Чтобы свести к минимуму необходимость ручной компенсации нескольких флуоресцентных красителей, коллекция флюорофоров с небольшим спектральным перекрытием, включая ядерное пятно счетчика используется для завершения mfIHC. Для учета автофлюоресценции, встречающейся с тканью FFPE, программное обеспечение вычитает автофлюоресценцию из конечного изображения, используя изображение с пустого слайда, что возможно из-за силы антигена специфической флуоресценции после флюорофора усиление сигнала. Используя новые программы, предназначенные для больших наборов данных,расположение ячеек можно определить и проанализировать для пространственного контекста 1,2,4. Наиболее значительным ограничением этого метода является время оптимизации. Здесь найдена подробная методология с инструкциями по экспериментальному проектированию и стратегии окрашивания и визуализации. mfIHC будет полезен для лабораторий, которые в настоящее время не имеют оптимизированной автоматизированной системы окрашивания, которая хотела бы лучше понять пространственный контекст взаимодействия между клетками и клетками в нетронутой ткани FFPE с помощью ручной техники.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Вся работа была одобрена внутренним наблюдательным советом Мичиганского университета.

1. Оптимизация первичных антител и скольжение

  1. Определите идеальную концентрацию антител для мультиплекса с помощью обычного IHC.
    1. Тест антитела для мультиплекса с помощью ручной обычной иммуногистохимии (IHC)13.
    2. Используйте специфические ткани которые имеют обильный тип клетки для каждого испытанного антитела such as использование ткани миндалин для испытания антител CD3.
    3. Используйте эталонную концентрацию для IHC, рекомендованную компанией, а затем заполните IHC с концентрацией антител в рекомендуемых концентрациях, а также концентрациями выше и ниже рекомендуемой концентрации.
  2. Подготовка формилина фиксированной парафин встроенной ткани на слайды.
    1. Используя микротом, вырезать блоки ткани FFPE толщиной между 4 и 6 мкм и применять к заряженным слайдам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование дистиллированной воды обеспечивает надлежащее монтаж ткани и присоединение во всем мультиплексе.
    2. Поместите слайды плоские, ткани вверх, и дайте высохнуть при 37 градусах Цельсия на ночь.
    3. Храните слайды в слайд-поле от экстремальной температуры до готовности к завершению мультиплекса.

2. Общий метод окрашивания

  1. Приготовление растворов для мытья и извлечения антигенов
    1. Подготовьте раствор для мытья 0,1% TBST путем смешивания 9 л деионизированной воды, 1 л буферизированного солей (TBS) и 10 мл полисорбата 20.
    2. Подготовьте оба решения для извлечения антигена (pH 6 и pH 9; Таблица материалов) путем разбавления до 1x с деионизированной водой.
  2. Депараффинизация и регидратация
    1. Выпекать слайды, лежа плашмя, ткань вверх при температуре 60 градусов по Цельсию на 1 ч в духовке гибридизации1. Удалите слайды из духовки и дайте остыть, по крайней мере, 5-10 минут, а затем поместите в вертикальную стойку слайда.
    2. Лечить слайды в следующих решениях последовательно: ксилен в тройник, а затем одно лечение 100% этанола, 95% этанола, и, наконец, 70% этанола в течение 10 минут каждый с помощью слайда окрашивающий набор1.
    3. Вымойте стойку слайдов в течение 2 минут с деионизированной водой путем погружения в пластиковой коробке слайд с последующим фиксацией путем погружения в пластиковую поле слайд заполнены нейтральным буферизированным формалином в течение 30 мин13. Вымойте горки в деионизированной воде в течение 2 минут, а затем перейти к антигена поиска.
  3. Извлечение антигена
    1. Поместите стойку слайдов в термостойкую коробку, заполненную внутренней линией (примерно 300 мл) с pH 6 или pH 9 буфером поиска антигена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антиген поиска буферможет быть либо рН 6 или рН 9, которые, возможно, потребуется оптимизировать на эпитоп. Однако, начните с использования рН 9 для антител, которые связываются с ядерными эпитопами и рН 6 для всех других антител.
    2. Обложка коробки с полиэтиленовой пленкой и использовать резинку для обеспечения. Поместите коробку в микроволновую печь на краю вращающейся пластины (микроволновка должна быть оснащена инверторной технологией даже для нагрева). Нагрейте горки для 45 s на 100% силе последовано за 15 min на 20% силе13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроволновая обработка может нуждаться в оптимизации в зависимости от используемой микроволновой печи.
    3. Пусть слайды остыть в течение примерно 15-20 минут.
  4. Подготовьте рабочие растворы антител и флюорофоров, в то время как горки охлаждают.
    1. Подготовка первичного антитела разбавлять путем растворения 0,5 г крупного рогатого скота сывороточный гранулы в 50 мл TBST. Кроме того, используйте 50 мл 1x фосфат буферного солей (PBS) для растворения гранул.
    2. Сделайте каждое первичное антитело рабочим раствором оптимизированной концентрации, определяемой в разделе 1, в первичном разбавителе антител. Оцените примерно 200 л л на слайд.
    3. Подготовьте фторфор рабочего раствора, разбавляя каждый фторфор в разбавителе фторорора в концентрации 1:100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребоваться оптимизировать в зависимости от антитела. Оцените примерно 100 л л на слайд.
    4. В последний день окрашивания, подготовить 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) рабочее решение, добавив 3 капли DAPI в 1 мл TBST.
  5. Слайд окрашивания (мытье и блокирование)
    1. Снимите коробку из микроволновой печи после охлаждения и снимите полиэтиленовую пленку, промойте горки деионизированной водой в течение 2 минут, а затем 2 мин мыть в пластиковой коробке слайд заполнены TBST13.
    2. После сушки каждого слайда вокруг ткани с деликатной задачей протрите осторожны, чтобы не дать ткани высохнуть, след вокруг внешней ткани с помощью гидрофобной барьерной ручкой. Не прикасайтесь к ткани с деликатной задачей протрите или ручкой.
    3. Поместите каждый слайд в увлажненной камере и добавьте блокирующий раствор (примерно 4 капли) в ткань. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
  6. Слайд окрашивания (первичное применение антител)
    1. Возьмите каждый слайд и удалить блокирующее решение, нажав сторону слайда на стопку бумажных полотенец и с помощью деликатной задачи протрите, чтобы удалить избыток блокирующего агента со всей ткани.
    2. Положите слайд обратно в увлажненную камеру и добавить около 200 л рабочих первичных антител. Инкубировать в увлажненной камере за 1 ч на RT.
    3. Вымойте с TBST в течение 2 мин путем погружения в тройной13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого шага стирки изменение TBST поможет обеспечить более чистое изображение.
  7. Слайд окрашивания (вторичное применение антител)
    1. Dab от остальных TBST от каждого слайда и применять примерно от 3 до 4 капель вторичного антитела (смесь кролика и мыши вторичных HRP спряжение антител). Инкубировать в течение 10 минут в увлажненной камере на RT13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируетиспользовать первичное антитело, которое требует вторичного антитела, кроме мыши или кролика или выбирая использовать альтернативные вторичные антитела, примените соответствующие HRP конъюгированные вторичные горки и инкубировать на RT в течение 45 мин. Оптимизация инкубационного времени может потребоваться для альтернативных вторичных14.
    2. После инкубации, мыть с TBST в течение 2 мин в тройной13.
  8. Слайд окрашивания (фторофор ассору)
    1. Нанесите примерно 100 л из фторофора рабочего раствора и инкубировать в увлажненной камере на RT в течение 10 мин13.
    2. Вымойте с TBST в течение 2 минут в тройной13.
  9. Удаление антител
    1. Микроволновые слайды (45 с на 100%, а затем 15 мин на 20%) в термостойкой коробке (см. шаг 2.3.2) для удаления антител13,14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это завершает один раунд мультиплекса. Это единственный момент, в котором протокол может быть приостановлен. Чтобы приостановить протокол, оставьте слайды погруженными в буфер поиска антигена на ночь при комнатной температуре.
  10. Продолжить дополнительные раунды окрашивания. Повторите шаги 2.5.1-2.9.1 для остальных пар антител-фторфора. После того, как все антитела и фторофоры были использованы, перейти к разделу 2.11.
  11. Приложение DAPI и монтаж
    1. После последнего раунда окрашивания в мультиплексе, удалить последнее применение антител с антигеном поиска раствора рН 613. Вымойте с deionized водой последовано за TBST для 2 min каждые13.
    2. Нанесите примерно 150 л рабочего раствора DAPI на слайды и инкубировать в увлажненной камере в течение 10 минут на RT1.
    3. Вымойте tBST в течение примерно 30 с и монтировать крышки с антифадейс-монтажом. Применить прозрачный лак ногтя на четырех углах coverslip раз монтаж амсредствашки высохли, чтобы обеспечить coverslip (по желанию).

3. Подробная информация для библиотеки, моноплексов и мультиплексов

  1. Выберите слайды для создания библиотеки флюорофоров.
    1. Для 7-цветного мультиплекса собрать 7 иммунных клеток богатых тканей слайдов (т.е., миндалины, селезенки и т.д.) для библиотеки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите слайды управления, которые будут использоваться для библиотеки фторфора с каждым слайдом, представляющим каждый уникальный флюорофор, который будет использоваться в мультиплексе. Контроль ные горки должны иметь обильный эпитоп выбора и может быть тот же тип ткани для каждого фторофора.
  2. Пятно и изображения библиотеки слайды для использования с моноплексами и мультиплексами.
    1. Выполните шаги 2.1'2.9.1, используя контрольные слайды и слайды управления тканью по выбору. Поместите различные флюорофоры на каждом слайде в концентрации 1:100; один слайд должен содержать только DAPI.
    2. Приступить к разделу 2.11, за исключением опустить DAPI окрашивания и вместо этого использовать TBST и горе, как описано.
    3. После сдачи слайдов сухой ночь, изображение со всеми каналами DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, полупроводниковые квантовые точки, и флуоресцент изотиоциана (FITC) установка воздействия 250 мс с функцией защиты насыщения1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции может быть установлено на уровне 50–250 мс13.
    4. Загрузите библиотечные изображения на программное обеспечение и используйте при анализе моноплексов и мультиплексов.
  3. Выберите слайды для монопрексов.
    1. Выберите слайды управления, которые имеют обильный эпитоп выбора на основе оптимизированных антител (раздел 1). Для каждого раунда окрашивания, чтобы быть сделано в мультиплексе, выберите это количество слайдов управления для создания моноплексов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель моноплекса состоит в том, чтобы определить наилучшее положение (заказ) для каждого антитела, которые будут использоваться в мультиплексе.
  4. Пятно монопрекс.
    1. Следуйте разделам 2.1–2.11 с использованием первичного антитела в разном порядке (позиции) для каждого из слайдов. Каждый слайд должен иметь только одно первичное антитело, примененное в порядке (позиции), отличаящемся от других слайдов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого слайда, где круглые требует не первичного антитела или фторфора, вместо этого использовать первичные антитела разбавителя и флюорофора разбавителя13.
  5. Изображение слайды и анализ монопрекс.
    1. Использование микроскопа и установка времени экспозиции до 250 мс для всех каналов захвата каждого изображения с использованием DAPI для фокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции может быть установлено на уровне 50–250 мс14.
    2. С помощью анализа программное обеспечение оценить каждый монопрекс слайд, глядя на флуоресцентные интенсивности окрашенных маркера.
    3. Сравните эту интенсивность с фоном. Если он по крайней мере в 5–10 раз выше фона, положение этого слайда является оптимальным положением для использования в конечном мультиплексе.
  6. Выберите слайды для мультиплекса.
    1. Выберите слайды, представляющие интерес и добавьте дополнительный слайд, который будет использоваться в качестве пустого слайда для вычитания автофлюоресценции после окрашивания и визуализации.
  7. Пятно мультиплекс.
    1. На основе результатов монопрекса выберите соответствующий порядок (позиции) для каждого антитела на основе шага 3.5.3. Присвоите каждому фторофору антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребовать оптимизации; однако, план использовать яркие антителадля менее обильных маркеров 1, совместнолололоцирующих антител следует сочетать с флюорофорами на дальних спектрах друг от друга13,и фторофоры со спектром 540 и 570 не должны быть совместно локализованы из-за к спектральным вопросам перекрытия1.
    2. Продолжить с разделами 2.1'2.11 обеспечения пустой слайд не получает первичных антител, фторофора, или DAPI, вместо этого использовать антитела разбавитель, фторофор разбавитель, и TBST соответственно на своем месте.
  8. Мультиплекс изображения и анализ для целостности окрашивания
    1. Используя микроскоп и установив время экспозиции до 250 мс для всех каналов, захваткаждого изображения, использующего DAPI для фокусировки.
    2. Используя программное обеспечение для анализа(Таблицаматериалов), оценить каждый мультиплекс флуоресцентным ложным цветом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Четкое изображение должно четко продемонстрировать каждый маркер. Если маркер выглядит диффузным и зернистым или не существует, вполне вероятно, что маркер не работает и нуждается в повторной оптимизации.
    3. Используя программное обеспечение для анализа, оцените каждый мультиплекс по патологии зрения. Взгляд патологии подтвердит специфику каждого маркера. Сравните с ранее оптимизированным IHC (раздел 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий процесс получения 7-цветного мультиплексного анализа следует повторяющийся шаблон. Рисунок 1 описывает процесс в схематической форме. После того, как слайды вырезать и высушить или получают из лаборатории и запеченные в духовке гибридизации при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем приступить к депарафинизации и регидратации, исправить слайды в формалин снова следуют антигена поиска. Каждый раунд мультиплексирования начинается с поиска антигена и заканчивается удале...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Нетронутые образцы тканей из твердой биопсии опухоли и хирургической резекции остаются важными диагностическими и прогностическими инструментами для анализа заболеваний, а также прогнозом пациента. Мультиплекс флуоресцентная иммуногистохимия (mfIHC) является новым методом, который сочетает в себе преимущества иммуногистохимии (IHC), иммунофлуоресценции (ИФ) и цитометрии потока. Предыдущие методы зондирования клеток на месте позволили для оценки клеток к клетке договоренностей в среде ткани8, однак...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эда Стака, ранее от Перкина Элмера, за помощь в настройке и оптимизации оригинального мультиплексного окрашивания. Авторы также хотели бы поблагодарить Кристен Шмидт из Akoya Biosciences за советы с использованием программного обеспечения для анализа. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальными институтами здравоохранения по борьбе с раком под номером премии P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA224144501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Дополнительную поддержку оказали Джеффри Колби Колби Колона рака и Том А. Лю Мемориал научно-исследовательских фондов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100% этанолFisherHC8001GAL
70% этанолFisherHC10001GL
95% этанолПрограммноеFisher HC11001GL
Akoya BiosciencesCLS135783inForm version 2.3.0
Antifade mountantThermoFisherP36961ProLong
Diamond Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Бычья сыворотка с альбумином (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Чехол SlipsFisher12-548-5E
Деликатная салфетка для задачKimberly-Clark34120
Флуоресцентный разбавительAkoya BiosciencesARD1A01EAОпал TSA Разбавитель
Флуорофор 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
Флуорофор 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Флуорофор 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Флуорофор 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Флуорофор 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Флуорофор 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Флуорофор DAPIAkoya BiosciencesFP14903 капли в TBST или PBS
Термостойкая коробкаTissue-Tek25608-904Пластиковая слайд-зеленая
увлажненная камераIbi ScientificAT-12
Гибридизационная печьFisherBiotech
Гидрофобная барьерная ручкаВекторH-4000Микроскоп ImmEdge
Perkin ElmerCLS140089Mantra Рабочая станция количественной патологии
Микроволновая печьPanasonicNN-A661Sс инверторной технологией
Нейтральный буферизованный формалинFisher ScientificSF100-410% нейтральный буферный формалин
pH 6 антиген для извлечения антигенаAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 буфер для извлечения антигенаAkoya BiosciencesAR900AR9
Фосфат буферизованный физиологический растворFisherBP3994PBS
Пластиковый слайд-боксTissue-Tek25608-906
Пластиковая пленкаFisherNC9070936
Полисорбат 20FisherBP337-800Tween 20
Первичный антитело CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Первичное антитело CD3DakoA04521:400
Первичное антитело CD8Spring BioM53901:400
Первичное антитело FOXP3DakoM35151:400
Первичное антитело панцитокератинаCell Signaling126531:500
Первичное антитело PD-L1Cell Сигнализация136841:200
Вторичное антителоAkoya BiosciencesARH1001EAОпаловый полимер
Набор для окрашивания предметного стеклаЭлектронная микроскопияНауки 6254001
Трис буферизованный физиологический растворCorning46-012-CM
TBS Вертикальный штатив для слайдовЭлектронная микроскопияНауки 50-294-72
КсилолФишер
обеспечение для анализа X3P1GAL

Ссылки

  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880(2018).
  3. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  4. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  5. Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
  6. Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  7. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
  9. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  10. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  11. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  12. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  13. Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32(2016).
  14. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
  15. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Тканификсированные формалином и залитые парафиномоптимизация антителмультиплексный дизайнподготовка предметных стеколвосстановление антигеновприменение флуорофоровмоноплексный анализпространственный анализопухолевое микроокружение
Оптимизация, дизайн и предотвращение ловушек в ручном мультиплексфлюсцентной иммуногистохимии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.