Method Article

Оптимизация, дизайн и предотвращение ловушек в ручном мультиплексфлюсцентной иммуногистохимии

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии является новой технологией, которая позволяет визуализации нескольких типов клеток в нетронутой формалин фиксированной, парафин встроенных (FFPE) ткани. Представлены руководящие принципы для обеспечения успешного 7-цветного мультиплекса с инструкциями по оптимизации антител и реагентов, подготовке слайдов, дизайна и советов для избежания общих проблем.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка микроокружения нетронутой ткани для анализа инфильтрации клеток и пространственной организации имеет важное значение для понимания сложности процессов заболевания. Принцип методы, используемые в прошлом включают иммуногистохимии (IHC) и иммунофлуоресценции (ИФ), которые позволяют визуализации клеток в качестве снимка во времени, используя между 1 и 4 маркеров. Оба метода имеют недостатки, включая трудности с окрашиванием плохо антигенных целей и ограничения, связанные с реактивностью кросс-видов. IHC является надежным и воспроизводимым, но характер химии и опоры на спектр видимого света позволяет использовать лишь несколько маркеров и затрудняет локализацию. Использование IF расширяет потенциальные маркеры, но обычно полагается на замороженные ткани из-за обширной аутофлуоресценции тканей после фиксации формалина. Цитометрия потока, метод, который позволяет одновременное обозначение нескольких эпитопов, отменяет многие недостатки IF и IHC, однако, необходимость изучения клеток, как одна суспензия клеток теряет пространственный контекст клеток отбрасывая важные биологические Отношения. Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) мосты эти технологии, позволяющие мульти-эпитоп клеточного фенотипирования в форминале фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани при сохранении общей архитектуры микросреды и пространственной отношения клеток в нетронутой ненарушенной ткани. Высокофюмиорная интенсивность флюорофоров, которые ковалентно связи с эпитопом ткани позволяет несколько применений первичных антител, не беспокоясь видов конкретных кросс-реактивность вторичных антител. Хотя эта технология была доказана для получения надежных и точных изображений для изучения болезни, процесс создания полезной стратегии mfIHC окрашивания может быть трудоемким и требовательным из-за обширной оптимизации и дизайна. Для того, чтобы сделать надежные изображения, которые представляют точные клеточные взаимодействия на месте и смягчить период оптимизации для ручного анализа, представленные здесь методы подготовки слайда, оптимизация антител, мультиплекс дизайн, а также ошибки часто встречаются во время процесса окрашивания.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация нетронутой микросреды опухоли (TME) имеет важное значение в оценке не только клеточной инфильтрации в твердых злокачественных новообразований, но и клеточных взаимодействий. Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) стал эффективным инструментом для мультиантигена фенотипирования клеток в исследовании рака и связанных с ними заболеваний1,2,3,4, 5,6,7. Это, в сочетании с новым программным обеспечением и программами,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вся работа была одобрена внутренним наблюдательным советом Мичиганского университета.

1. Оптимизация первичных антител и скольжение

  1. Определите идеальную концентрацию антител для мультиплекса с помощью обычного IHC.
    1. Тест антитела для мультиплекса с помощью ручной обычной иммуногистохимии (IHC)13.
    2. Используйте специфические ткани которые имеют обильный тип клетки для каждого испытанного антитела such as использование ткани миндалин для испытания антител CD3.
    3. Используйте эталонную концентрацию для IHC, рекомендованную компанией, а затем заполните IHC с концентрацией антител в рекоменду....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий процесс получения 7-цветного мультиплексного анализа следует повторяющийся шаблон. Рисунок 1 описывает процесс в схематической форме. После того, как слайды вырезать и высушить или получают из лаборатории и запеченные в духовке гибридизации при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем приступить к депарафинизации и регидратации, исправить слайды в формалин снова следуют антигена поиска. Каждый раунд мультиплексирования начинается с поиска антигена и заканчивается удале.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нетронутые образцы тканей из твердой биопсии опухоли и хирургической резекции остаются важными диагностическими и прогностическими инструментами для анализа заболеваний, а также прогнозом пациента. Мультиплекс флуоресцентная иммуногистохимия (mfIHC) является новым методом, который сочетает в себе преимущества иммуногистохимии (IHC), иммунофлуоресценции (ИФ) и цитометрии потока. Предыдущие методы зондирования клеток на месте позволили для оценки клеток к клетке договоренностей в среде ткани8, однак.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Эда Стака, ранее от Перкина Элмера, за помощь в настройке и оптимизации оригинального мультиплексного окрашивания. Авторы также хотели бы поблагодарить Кристен Шмидт из Akoya Biosciences за советы с использованием программного обеспечения для анализа. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальными институтами здравоохранения по борьбе с раком под номером премии P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA224144501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает офици....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% этанолFisherHC8001GAL
70% этанолFisherHC10001GL
95% этанолПрограммноеFisher HC11001GL
Akoya BiosciencesCLS135783inForm version 2.3.0
Antifade mountantThermoFisherP36961ProLong
Diamond Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Бычья сыворотка с альбумином (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Чехол SlipsFisher12-548-5E
Деликатная салфетка для задачKimberly-Clark34120
Флуоресцентный разбавительAkoya BiosciencesARD1A01EAОпал TSA Разбавитель
Флуорофор 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
Флуорофор 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Флуорофор 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Флуорофор 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Флуорофор 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Флуорофор 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Флуорофор DAPIAkoya BiosciencesFP14903 капли в TBST или PBS
Термостойкая коробкаTissue-Tek25608-904Пластиковая слайд-зеленая
увлажненная камераIbi ScientificAT-12
Гибридизационная печьFisherBiotech
Гидрофобная барьерная ручкаВекторH-4000Микроскоп ImmEdge
Perkin ElmerCLS140089Mantra Рабочая станция количественной патологии
Микроволновая печьPanasonicNN-A661Sс инверторной технологией
Нейтральный буферизованный формалинFisher ScientificSF100-410% нейтральный буферный формалин
pH 6 антиген для извлечения антигенаAkoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 буфер для извлечения антигенаAkoya BiosciencesAR900AR9
Фосфат буферизованный физиологический растворFisherBP3994PBS
Пластиковый слайд-боксTissue-Tek25608-906
Пластиковая пленкаFisherNC9070936
Полисорбат 20FisherBP337-800Tween 20
Первичный антитело CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Первичное антитело CD3DakoA04521:400
Первичное антитело CD8Spring BioM53901:400
Первичное антитело FOXP3DakoM35151:400
Первичное антитело панцитокератинаCell Signaling126531:500
Первичное антитело PD-L1Cell Сигнализация136841:200
Вторичное антителоAkoya BiosciencesARH1001EAОпаловый полимер
Набор для окрашивания предметного стеклаЭлектронная микроскопияНауки 6254001
Трис буферизованный физиологический растворCorning46-012-CM
TBS Вертикальный штатив для слайдовЭлектронная микроскопияНауки 50-294-72
КсилолФишер
обеспечение для анализа X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles