Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение относительной секреции инсулина с помощью совместно секретной суррогатной Люциферазы

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59926

⸱

25 июня 2019 г.

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как выполнять быстрые недорогие анализы люциферазы на средней пропускной связи с использованием инсулина связанных Гауссия luciferase в качестве прокси для секреции инсулина из бета-клеток. Ассеи может быть выполнен с большинством люминесценции пластины читателей и многоканальных пипетки.

Аннотация

Выполнение антител на основе анализов для секретированных инсулина после образца сбора обычно требует нескольких часов в день анализ времени и может быть дорогим, в зависимости от конкретного анализа. Засекреченные luciferase анализы ускорить результаты и снизить стоимость анализов на образец существенно. Здесь мы представляем относительно недоиспользованный подход к оценке инсулина секреторной активности из поджелудочной железы и клеток с помощью Gaussia luciferase генетически вставлены в C-пептид. Во время протеолитической обработки проинсулина, C-пептид высечены выпуская люциферазу в инсулин секреторной везикулы, где он совместно секретируется с инсулином. Результаты могут быть получены в течение нескольких минут после сбора образцов из-за скорости анализов люциферазы. Ограничением проверки является то, что это относительное измерение секреции инсулина, а не абсолютная количественная оценка. Тем не менее, этот протокол является экономичным, масштабируемым, и может быть выполнен с помощью большинства стандартных считывателей люминесценции. Аналоговые и цифровые многоканальные пипетки облегчают несколько этапов ассеи. Множество различных экспериментальных вариаций могут быть протестированы одновременно. После того, как целенаправленный набор условий определяются, концентрации инсулина должны быть измерены непосредственно с помощью антител на основе анализов со стандартными кривыми, чтобы подтвердить результаты анализлю люциферазы.

Введение

Представленный здесь метод позволяет быстро и доступно из-за секреции инсулина из генетически модифицированной бета-клеточной линии быстро и доступно в формате 96-хорошо. Ключом к этому протоколу является модифицированная версия инсулина с естественно-секретной luciferase Gaussia (GLuc, No 18 kDa) вставлена (см. Рисунок 1) в C-пептид для генерации инсулина-Gaussia (InsGLuc)1,2. Другие более крупные белки, такие как GFP (No 25 kDa), были успешно вставлены в C-пептид инсулина и выставлены ожидаемые пост-трансляционной обработки от проинсулин-GFP инсулина и GFP-C-пептид3,4. Для проведения в этом протоколе, GLuc был кодон-оптимизирован для выражения млекопитающих и две мутации были введены для повышения свечения, как кинетика5,6. Несколько комбинаций и репликации лечебных заболеваний могут быть легко протестированы в формате 96-хорошо пластины и результаты секреции могут быть получены сразу же после эксперимента.

Основным преимуществом, как отмечалось ранее2, является низкая стоимость этого luciferase основе секреции измерения (злот; $ 0,01 /хорошо), который отличает его от относительно более высоких затрат и технических аспектов фермент-связанных иммуносорбентных анализов (ELISAs) ( В качестве антитела на основе антител на основе антител, основанных на 2 долларах, и однородной флуоресценции (HTRF) или других рецензировании, говорится о том, что они будут передаваться из-под другого спора о рецензировании (FRET). По сравнению с этими антителами на основе анализов, которые измеряют концентрацию инсулина, ссылаясь на стандартную кривую, Анализ InsGLuc измеряет секреторную деятельность как относительное сравнение с контролем скважин на пластине. По этой причине каждый эксперимент требует включения надлежащего контроля. Это различие является компромиссом, позволяющим проводить быстрые и недорогие измерения. Тем не менее, было доказано, что секреция InsGLuc сильно коррелирует с секрецией инсулина, измеренной ELISA1,2. Эта технология была масштабирована для высокой пропускной связи скрининга1,2,7 и привела к выявлению новых модуляторов секреции инсулина, включая ингибитор канала калия, приложенный к напряжению7 а также натуральный ингибитор продукта функции клеток, хромомицин A28. Использование InsGLuc является наиболее подходящим для исследователей, которые планируют постоянно тестировать множество различных условий лечения для их воздействия на секрецию инсулина. В последующих экспериментах необходимо повторить ключевые выводы в родительской линии клеток, а оптимально в мурин или человеческих островках, и измерить секрецию инсулина с помощью анализа на основе антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов, носителей и буферов (таблица 1)

  1. Подготовка MIN6 полный носитель в 500 мл высокоглюкози (4,5 г/л) Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) со следующими добавками: 15% плода бычьей сыворотки (FBS), 100 единиц /мл пенициллин, 100 мкг /мл streptomycin, 292 мкг/мl L-г-г-г-г-г-л-глю-л-L-L-L-L-L-L-L -меркаптоэтанол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильная клеточная линия в этом случае поддерживается в 250 мкг/мл антибиотика G418.
  2. Подготовка буфера бикарбоната Krebs-Ringer (KRBH) путем создания раствора, содержащего 5 мм ККЛ, 120 мМ NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 мМ ММ MgCl2, 2 мм CaCl2, и 1 мг/мл радиоиммунопастия-класса сывороточный альбом (BSA). Глюкоза должна быть добавлена, где указаны из 2 M акций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: KRBH используется для инкубации клеток с и без стимуляции для того, чтобы оценить инсулин и / или Гауссия люциферазы секреции.
  3. Подготовьте акционерное решение coelenterazine (CT' следующим образом. Приготовьте подкисленный метанол, добавив 106 л концентрированного HCl до 10 мл метанола. Далее, растворите лиофилизированный КТЗ в подкисленном метаноле при 1 мг/мл и храните при -80 градусов по Цельсию в трубках с винтовой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти запасы сохраняют достаточную активность в обычных анализов люциферазы, даже после 1 года надлежащего хранения.
  4. Подготовка Gaussia luciferase (GLuc) asay буфер на основе литературы 9, а также патентной информации10, чтобы помочь в период полураспада Gaussia luciferase асссее в 96 хорошо пластины формата. Используйте формулу: 25 мм Tris pH 8, 1 мМ EDTA, 5% глицерол, 1 мг/мл Na2PO4,300 мм натрия ascorbate, 200 мм Na2SO3 в воде. Заморозить запасы при -20 градусов по Цельсию. После оттаивания храните буфер при 4 градусах Цельсия.
  5. Для подготовки рабочего раствора Gaussia luciferase добавьте 4,2 л/мл 1 мг/мл (2,36 мМ) штучного раствора КТЗ в буфер GLuc assay. Это приводит к 2x рабочий раствор 10 ММ КТЗ, который будет иметь 5 мкм окончательную концентрацию в ассе.

2. Культура InsGLuc MIN6 клеток и посева для секреции анализов

  1. Для культуры MIN6 клеток, trypsinize и семян клеток один раз в неделю с использованием стандартных методов культуры клеток. Изменение носителя на клетках каждые два-три дня. Включите в сми соответствующий отбор антибиотиков, таких как 250 мкг/мл G418.
    1. Чтобы обеспечить достаточное количество клеток еженедельно для экспериментов, поддерживать клетки в T75 колбы. Посев 6 х 106 ячеек на T75 в 10 мл средств массовой информации, как правило, дают 30 х 10до 40 х 106 ячеек в общей сложности T75 после 7 дней культуры.
  2. Чтобы подготовить клетки для покрытия в 96-колодцы пластины, мыть конфлятор T75 InsGLuc MIN6 клетки дважды с PBS и добавить 2 мл трипсина. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не отмежеваются от колбы. Определите концентрацию клеток на миллилитр.
    1. Разбавить клетки в полном носителе до 1 х 106 клеток / мл, чтобы привести к 1 х 105 клеток в 100 Л на хорошо в 96-хорошо пластины. Клетки должны быть достаточно сливовыми для ассеидов через 3-4 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продлить период культуры, половина концентрации клеток может быть покрыта. Медиа-изменения не требуются до дня проведения ассеа, если клетки не должны подвергаться экспериментальному лечению.

3. Глюкоза стимулировали Гауссия luciferase секреции секреции

  1. В день асссея подготовьте достаточно KRBH для эксперимента (шаг 1.2). Минимум 50 мл KRBH на 96-хорошую пластину требуется, поэтому подготовить по крайней мере 75 мл, чтобы обеспечить достаточный буфер для эксперимента. Подготовьте дополнительный буфер, если различные комбинации лекарственного лечения потребуют KRBH для разбавления.
  2. Приготовьте резервуар с глюкозой, свободной KRBH. Decant среды из 96-ну хорошо пластины (ы) быстро инвертирования пластины над лабораторной раковиной, а затем пятно твердо на стопку бумажных полотенец, чтобы удалить избыток среды.
  3. Используя либо электронную, либо ручную 8-канальный пипетку, пипетку 100 Л/ну KRBH из резервуара через 96-колодую пластину (ы). Повторите в общей сложности две стихи.
  4. (Необязательный шаг лечения острых соединений) Если не выполняется медикаментозное лечение, продолжайте шаги 3.5 и 3.6 без изменений. Чтобы проверить влияние малых молекул на секрецию инсулина, соединения могут быть добавлены к клеткам в период преинкубации, период стимуляции, или оба.
    1. Один из методов заключается в добавлении соединений в партии KRBH в 1,5 мл труб и использовать регулируемый 8-канальный цифровой пипетки для передачи наркотиков KRBH из труб в клетки в 96-колодцепластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если регулируемый пипетка недоступен, можно сделать копию 96-ну колодца пластины препарата KRBH и использовать стандартный 8-канальный пипетку для передачи буфера. Дальнейшие изменения в парадигме лечения могут быть сделаны для лечения клеток в течение 24 ч в средствах массовой информации до проведения асссе, как ранее описано1,8.
  5. Добавьте 100 кЛ KRBH, содержащую нужную концентрацию глюкозы или соединений, и поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной компоновки, это чрезвычайно полезно иметь электронный многоканальный пипетка, которая позволяет переход расстояния канала от колонны из восьми 1,5-мл труб в 8 рядов 96-хорошо пластины.
  6. После 1 ч преинкубации, decant буфера в раковину и пятно твердо на бумажное полотенце. Добавьте 100 л без глюкозы KRBH на колодец, чтобы смыть накопленный фон люциферазы Гауссии. Снова освящайте тарелку и добавляйте контрольные и стимулирующие условия к пластине при 100 кЛ на скважину. Поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
  7. Тщательно соберите 50 зл супернатантов с помощью многоканального пипетки, изменяя кончики между условиями лечения по мере необходимости, и перенесите супернатант в чистую непрозрачую белую 96-хорошую ассеи-пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белостенные прозрачные нижние пластины могут быть использованы в случае необходимости, хотя значительное количество сигнала люциферазы будет потеряно.
  8. После сбора 50 злитроду супернатанта KRBH, образец может быть немедленно проанализирован. При необходимости, печать и хранить образцы на 4 кВ в течение нескольких дней (GLuc деятельности период полураспада 6 дней) или -20 градусов по Цельсию на срок до одного месяца11,12.

4. Засекреченная гауссия люциферазы

  1. Чтобы подготовить рабочее решение GLuc assay, пипетка необходимое количество штучного раствора КТЗ (4,2 л/мл) в буфер асссеа GLuc. Чтобы предотвратить потепление КТЗ, пипетка КТЗ быстро на -80 градусов морозильник или держать трубку на сухом льду.
  2. Используя электронную многоканальная пипетка, быстро добавьте 50 зл и слой работы GLuc рабочего решения в скважине через 96-ну хорошо блюдо, содержащее собранные KRBH супернатанты. Если есть какие-либо капли по бокам любых скважин, кратко спина пластины в столе швейных ведра центрифуги.
  3. Прочитайте люминесценцию в подходящем считывателе пластин в течение нескольких минут и прочитайте каждый хорошо с 0,1 с интеграции времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для оценки производительности анализ в условиях контроля, простая кривая доза глюкозы-ответ или стимуляции с использованием парадигмы диазоксида может быть завершена. В случае первого, предварительноинноинизм клетки в течение 1 ч в условиях, свободных от глюкозы следуют лечения в течение 1 ч с увеличением концентрации глюкозы должно привести к очень мало секреторной активности на и ниже 5 мм, в то время как увеличение секреции наблюдается выше 8 мМ глюкозы(рисунок 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом мы представляем метод для быстрой оценки глюкозостимулированных реакций на секрецию инсулина от клеток MIN6. Для лучших ответов в асссе важно сеять клетки MIN6 при надлежащей плотности и позволить им стать 85-95% слив. Это улучшает реакцию клеток на глюкозу из-за улучшения контактов клеток и синхронизации, которая происходит как в первичных островках17,18,19,20,21,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят всех нынешних и бывших сотрудников лаборатории Кобб за ценную работу и дискуссии, и Дионн Уэйр за административную помощь. Майкл Калват поддерживается Фондом исследований диабета для несовершеннолетних SRA-2019-702-З-Р. Эта работа стала возможной через NIH R37 DK34128 и Уэлч Фонд Грант I1243 Мелани Кобб. Ранние части этой работы были также поддержаны NIH F32 DK100113 Майклу Калвату.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Материалы клеточных культур
rIns-GLuc стабильные клеткиРодительская клеточная линия MIN6 стабильно экспрессирует pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc и поддерживается в концентрации 250 мкг/мл G418
DMEMSigmaD64294,5 г/л глюкозная среда
фетальная бычья сыворотка, тепло инактивированнаяSigmaF4135
Пенициллин/ СтрептомицинThermo-Fisher ScientificSV30010
бета-меркаптоэтанолThermo-Fisher ScientificBP 176-100
глютаминThermo-Fisher ScientificBP379-100
Трипсин-ЭДТАSigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10Стоковый раствор 250 мг/мл в воде. Заморозьте аликвоты при -20С.
Колбы для культуры тканей T75Fisher Scientific07-202-000
96 луночных планшетов для культуры тканейCelltreat229196
резервуары для реагентов (50 мл)Corning4870
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
<реагенты для анализа сильной>секреции
BSA (класс RIA)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-глюкозаSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7,4Thermo-FisherScientific 50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NameCompanyКаталожный номерКомментарии
>Дополнительные препараты для экспериментов по стимуляции
DiazoxideSigmaD9035Стоковый раствор: 50 мМ в 0,1N NaOH. Добавьте равное количество 0,1N HCl в любой буфер, куда добавлен диазоксид.
адреналин (соль битартрата)SigmaE4375Стоковый раствор: 5 мМ в воде
PMA (форбол 12-миристат)SigmaP1585Стоковый раствор: 100 &; M в DMSO
strong>NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
Guassia материалы анализа
Disodium phosphate (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
ГлицеринThermo-Fisher ScientificG334
Бромид натрияThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000Исходный раствор: 0,5 м pH 8
трисовое основаниеRPIT60040-1000,0Исходный раствор: 1 м pH 8
Аскорбиновая кислотаFisher ScientificAAA1775922Патент США US7718389 предположил, что аскорбат может повышать стабильность коэлентеразина.
Na2SO3SigmaS0505-250GПатент США US8367357 предположил, что сульфит может снижать фон из-за BSA
Коэлентеразина (нативный)Nanolight / Prolume3035MGСтоковый раствор: 1 мг/мл в подкисленном MeOH (2,36 мМ)
OptiPlate-96, White Opaque 96-well MicroplatePerkin Elmer6005290Любой непрозрачный белый 96-луночный планшет должен быть достаточным. Прозрачные донные пластины также подойдут, однако некоторый сигнал будет потерян.
NameCompanyНомер в каталогеComments
>Equipment
Synergy H1 Hybrid plate reader или эквивалентныйBioTek8041000Требуется планшетный считыватель с детектированием люминесценции и возможностями 96-луночных планшетов.
8-канальный пипетка VOYAGER (50-1250 и микро; L)Integra4724Автоматизированная многоканальная пипетка чрезвычайно полезна для быстрого добавления люциферазных реагентов и гальванических ячеек в формате 96 лунок
8-канальных 200 и микро; L пипеткаTransferpette S 20-200 µ Л2703710
MIN6 <,

Ссылки

  1. Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
  2. Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
  3. Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
  4. Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
  5. Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
  6. Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
  7. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).
  8. Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
  9. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).
  10. Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
  11. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
  12. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  13. Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
  14. Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
  15. Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
  16. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  17. Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
  18. Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
  19. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
  20. Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
  21. Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
  22. Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
  23. Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  24. Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).
  25. Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
  26. Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
  27. Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GaussiaELISA
Измерение относительной секреции инсулина с помощью совместно секретной суррогатной Люциферазы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.