Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Краткое содержание

Мы описываем подход к надежно генерировать химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеток и проверить их дифференциации и функции в пробирке и in vivo.

Аннотация

Приемная иммунотерапия обещает лечение рака и инфекционных заболеваний. Мы описываем простой подход к преобразовыванию первичных т-клеток человека с химерным рецептором антигена (CAR) и расширить их потомство ex vivo. Мы включаем анализы для измерения экспрессии ЦАР, а также дифференциации, пролиферативной способности и цитолитической активности. Мы описываем анализы для измерения производства цитокинов эффектора и воспалительной секреции цитокинов в т-клеток CAR. Наш подход обеспечивает надежный и комплексный метод культуры Т-клеток CAR для доклинических моделей приемной иммунотерапии.

Введение

Химерные рецепторы антигена (ЦАР) обеспечивают перспективный подход к перенаправлению Т-клеток против различных опухолевых антигенов. CARs синтетические рецепторы, которые связывают антиген цели. Хотя их точный состав является переменным, CARs обычно содержат 3 различных домена. Внеклеточный домен направляет привязку к целевому антигену и, как правило, состоит из одного фрагмента цепных антител, связанных с CAR через внеклеточный шарнир. Второй домен, обычно полученный из цепочки CD3 и комплекса Рецепторов Т-клеток (TCR), способствует активации Т-клеток после участия в CAR. Третий costimulatory домен включен для повышения функции Т-клеток, прививаемость, метаболизм, и....

Протокол

Все исследования на животных одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Пенсильвании.

1. Активация Т-клеток, трансдукция и расширение

1. Активируйте свежие или криоконсервированные первичные Т-клетки человека, смешивая с анти-CD3/CD28 магнитными бусинами (например, динабии) в соотношении 3 бусины на Т-клетку в 6-колодских блюдах культуры клеток. Культура Т-клеток в X-VIVO 15 средних дополнен5% нормальной человеческой AB сыворотки, 2 мМ L-глютамин, 20 мМ HEPES, и IL2 (100 единиц /мл). Поддержание Т-клеток в концентрации 10⁶ Т-клеток/мл во время расширения. Культура Т-клеток при 3....

Результаты

Используя описанные выше методы, мы стимулировали и расширяли Т-клетки в течение 3 или 9 дней(рисунок 1A,B). Мы также проанализировали их профиль дифференциации, о чем свидетельствует стратегия gating, изложенная на рисунке 1C,путем измерения изобилия различных гликопротеинов, выраженных на поверхности клетки. Мы показываем прогрессивный сдвиг в сторону дифференциации эффектора с течением времени во время культуры ex vivo

Обсуждение

Здесь мы описываем подходы к измерению функции и эффективности CAR Т-клеток, собранных с разными интервалами всей культуры ex vivo. Наши методы обеспечивают всестороннее понимание анализов, предназначенных для оценки пролиферативной способности, а также функции эффектора in vitro. Мы описываем, как измерить активность CAR T клеток после стимуляции через CAR и подробно ксенотрансплантата модели лейкемии с использованием CAR Т-клеток, собранных в день 3 против 9 их стадии логарифмического расширения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анти CD3/CD28 динабет	Thermo Fisher	40203D
APC Мышь против человека CD8	BD Biosciences	555369	RRID:AB_398595
APC-H7 Мышиное антитело к человеку CD8	BD Biosciences	560179	RRID:AB_1645481
BD FACS Лизирующий раствор 10X Концентрат	BD Biosciences	349202
BD Trucount Абсолютные счетные пробирки	BD Biosciences	340334
Brilliant Violet 510 античеловеческое антитело к CD4	BioLegend	317444	RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 античеловеческое антитело к CD3	BioLegend	317322	RRID:AB_2561911
Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSE	Life Technolohgies	C34554
CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen		C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Антитело	BD Pharmingen	561271	RRID:AB_10561679
FITC Мышиный античеловеческий CD4	BD Biosciences	555346	RRID:AB_395751
HEPES	Gibco	15630-080
Сыворотка AB человека	Valley Biomedical	HP1022
Human IL-2 IS, премиум класс	Miltenyi	130-097-744
L-глутамин	Gibco	28030-081
Счетчик жидкого сцинтилляции, MicroBeta trilux	Perkin Elmer
LIVE/DEAD Фиксируемые фиолетовые	молекулярные зонды	L34964
Multisizer Coulter	Counter Beckman Coulter
Na251CrO4	Perkin Elmer	NEZ030S001MC
Pacific Синее антитело против человеческого CD14	BioLegend	325616	RRID:AB_830689
Тихоокеанское голубое антитело против человеческого CD19	BioLegend	302223
PE против человеческого CD45RO Антитело	BD Biosciences	555493	RRID:AB_395884
PE/Cy5 против человеческого CD95 (Fas) Антитело	BioLegend	305610	RRID:AB_493652
PE/Cy7 против человеческого антитела CD27 Beckman	Coulter	A54823
Фенол свободный от красных сред	Gibco	10373-017
UltraPure SDS Solution, 10%	Invitrogen	15553027
Via-Probe	BD Biosciences	555815
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q
XenoLight D-Люциферин - K+ Соль	Perkin Elmer	122799