Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

13.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59949

⸱

17 декабря 2019 г.

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем подход к надежно генерировать химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеток и проверить их дифференциации и функции в пробирке и in vivo.

Аннотация

Приемная иммунотерапия обещает лечение рака и инфекционных заболеваний. Мы описываем простой подход к преобразовыванию первичных т-клеток человека с химерным рецептором антигена (CAR) и расширить их потомство ex vivo. Мы включаем анализы для измерения экспрессии ЦАР, а также дифференциации, пролиферативной способности и цитолитической активности. Мы описываем анализы для измерения производства цитокинов эффектора и воспалительной секреции цитокинов в т-клеток CAR. Наш подход обеспечивает надежный и комплексный метод культуры Т-клеток CAR для доклинических моделей приемной иммунотерапии.

Введение

Химерные рецепторы антигена (ЦАР) обеспечивают перспективный подход к перенаправлению Т-клеток против различных опухолевых антигенов. CARs синтетические рецепторы, которые связывают антиген цели. Хотя их точный состав является переменным, CARs обычно содержат 3 различных домена. Внеклеточный домен направляет привязку к целевому антигену и, как правило, состоит из одного фрагмента цепных антител, связанных с CAR через внеклеточный шарнир. Второй домен, обычно полученный из цепочки CD3 и комплекса Рецепторов Т-клеток (TCR), способствует активации Т-клеток после участия в CAR. Третий costimulatory домен включен для повышения функции Т-клеток, прививаемость, метаболизм, и настойчивость. Успех Т-клеточной терапии CAR в различных гематопоитических злокачественных новообразований, включая B-клеток острого лимфобластного лейкоза (ВСЕ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и множественной миеломы подчеркивает терапевтическое обещание этого подхода1,2,3,4,5,6. Недавнее Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами (FDA) утверждения для двух CD19 конкретных CAR T клеточной терапии, tisagenlecleucel для педиатрических и молодых взрослых ВСЕ и axicabtagene ciloleucel для диффузной большой B-клеточной лимфомы, усиливает перевод по заслугам CAR T клеточной терапии.

Подходы, основанные на Т, включают изоляцию Т-клеток от периферической крови, активацию, генетическую модификацию и расширение ex vivo. Дифференциация является важным параметром, регулирующим эффективность CAR Т-клеток. Соответственно, ограничение дифференциации Т-клеток во время культуры ex vivo повышает способность инфляции, расширения и упорства, обеспечивая долгосрочную иммунонадзор после приемной передачи2,7,9. Т-клетки состоят из нескольких различных подмножеств, включая: наивные Т-клетки (Tn), центральную память (Tcm), эм, эффектор дифференцированный (Tte) и память стволовых клеток (Tscm). Эффектор дифференцированных Т-клеток имеют мощные цитолитические способности; однако, они недолговечны и прививают плох10,11,12. В отличие от этого, Т-клетки с менее дифференцированным фенотипом, включая наивные Т-клетки и Ткм, обладают превосходными прививочными и пролиферативными способностями после передачи приемных клеток13,14,15,16,17,18. Состав собранных Т-клеток в предизготовленный продукт может варьироваться в разных пациентах и коррелирует с терапевтическим потенциалом Т-клеток CAR. Доля Т-клеток с наивным иммунофенотипом в стартовом аферезе сильно коррелирует как с прививкой, так и с клинической реакцией19.

Продолжительность культуры является важным параметром, влияющим на дифференциацию в Т-клетках CAR, подготовленных для приемной передачи. Недавно мы разработали подход к созданию высококачественных CAR T-клеток с использованием сокращенной парадигмы культуры20. Используя наш подход, мы показали, что ограниченная культура приводит к CAR Т-клеток с превосходной функцией эффектора и настойчивость после принятия передачи в ксенотрансплантата моделей лейкемии. Здесь мы представляем подходы к надежно генерировать CART19 клеток (автологические Т-клетки инженерии, чтобы выразить анти-CD19 scFv прилагается к CD3 и 4-1BB сигнализации доменов) и включают подробное описание анализов, которые обеспечивают понимание биоактивности CAR T и эффективность до принятия передачи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Пенсильвании.

1. Активация Т-клеток, трансдукция и расширение

  1. Активируйте свежие или криоконсервированные первичные Т-клетки человека, смешивая с анти-CD3/CD28 магнитными бусинами (например, динабии) в соотношении 3 бусины на Т-клетку в 6-колодских блюдах культуры клеток. Культура Т-клеток в X-VIVO 15 средних дополнен5% нормальной человеческой AB сыворотки, 2 мМ L-глютамин, 20 мМ HEPES, и IL2 (100 единиц /мл). Поддержание Т-клеток в концентрации 106 Т-клеток/мл во время расширения. Культура Т-клеток при 37 градусах Цельсия, 20% O2и 95% влажности с 5% CO2.
  2. После ночной стимуляции добавьте ленцивирусный супернатант в активированные Т-клетки. Рассчитайте объем супернатанта, необходимый для достижения многообразия инфекции (МВД) в 3-5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CD19-BB-CAR лентивирусная плазмида состоит из cd8 шарнир, 4-1BB costimulatory домена, и CD3 "сигнализации домена21. CD19-BB - лентивирусный супернатант был создан, как ранее описано21.
  3. На 3-й день соберите представительный аликот клеток для криоконсервации. Перед криоконсервацией, удалить магнитные бусы путем нежного пипеттинг и магнитного разделения. Подготовка замораживания среды, содержащей фосфат-буферный солевой раствор (PBS) с 0,5% диметил сульфодоксид (DMSO) и хранить в 4 кв КС до использования.
    1. Центрифуга Т-клеток на 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и добавить 5 мл PBS. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин и отказаться от PBS.
    2. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл холодной криоконсервации среды. Заморозить Т-клетки в охлажденный замораживающий контейнер и хранить при -80 градусах по Цельсию в течение 48 ч. Перенесите замороженные клетки в жидкий азот.
  4. Вымойте остальные Т-клетки один раз в 5 мл PBS для устранения остаточного вектора. Центрифуга на 300 х г в течение 5 мин. Декант PBS и resuspend клеточных гранул в Т-клеточной среде культуры в концентрации 0,5 х 106 клеток / мл.
  5. Разделите Т-клетки на две культуры, предназначенные для 5-го дня и 9-го дня. Подсчитайте Т-клетки по цитометрии потока с помощью подсчета шариков(Таблица материалов)и моноклональных антител к человеческому CD4 и CD8, а также красителя жизнеспособности (Таблица материалов).
    1. Для измерения концентрации Т-клеток подготовьте мастер-микс, содержащий 500 л PbS, 5 qL отсчета шариков, 10 зл 7-амино-актиномицин D раствор жизнеспособности клетки, 4 Зл CD4-FITC и 4 Зл CD8-APC. Добавьте 40 КЛ Т-клеток в мастер-микс и измерьте концентрацию клеток цитометрией потока на основе количества живых Т-клеток/бисовых отсчетов. Перекормите для поддержания культур в концентрации 0,5 х 106 клеток/ мл через день.
  6. На 5-й день, отсчет и криоконсервный день 5 культур, как описано в шагах 1.3 и 1.5.
  7. На 7-й день промыть 0,5 х 106 Т-клеток в PBS и повторно приостановить в 100 зл флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) буфера. Обнаружить экспрессию поверхностного белка CAR путем иммуноспотирования с флуоресцентно-конъюгированным анти-CAR19 идиотипом цитометрии потока цитометрии.
  8. На 9-й день, отсчет день 9 культур и криоконсерваваемов, как описано в шаге 1.3.

2. Фенотипическая оценка дифференциации Т-клеток

  1. Подготовка мастер-микс, содержащий предварительно титрованные антитела для анти-CD3-BV605 (клон OKT3), анти-CD14-Pacific Blue (PB) (клон HCD14), анти-CD19-PB (cl ONE HIB19), анти-CD4-BV510 (клон OKT4), анти-CD8-H7APC (клон SK1), анти-CCR7-FITC (клон 150503), анти-CD45RO-PE (клон UCHL1), анти-CD27-PE-Cy7 (клон 1A4CD27), анти-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) и анти-CAR19-APC.
  2. Подготовьте индивидуальный флуоресценции минус один (FMO) управления для анти-CD45RO-PE, анти-CCR7-FITC, анти-CD27-PE-Cy7 и анти-CD95-PerCP-Cy5.5, чтобы отличить положительно окрашенных клеток от фона.
  3. Подготовка мертвых клеток окрашивая решение путем разбавления живой / мертвый стоковый реагент (Таблица материалов) 1:10,000 в PBS.
  4. Оттепель день 3, день 5, и день 9 Т-клетки, которые ранее были криоконсервированы. Центрифуга 1 х 106 Т-клеток от каждой группы при 300 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант. Вымойте клетки один раз с PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин и отбрасывайте PBS.
  5. Смешайте Т-клетки с мертвым окрашивающим раствором в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), защищенным от света.
  6. Добавьте 1 мл буфера FACS, чтобы утолить окрашивание окрашивания омертвевательных элементов. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин, отбросить супернатант и resuspend клеточной гранулы в 100 злитела хл буфера FACS, содержащий коктейль антитела описаны в шаге 2.1 и 2.2. Инкубировать 1 ч при 4 градусах Цельсия.
  7. Добавьте 1 мл буфера FACS и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин, чтобы смыть несвязанные антитела. Повторите три раза с буфером FACS.
  8. Приостанавливать клетки в 1% параформальдегида (PFA) и хранить при 4 градусах Цельсия.
  9. Как CD45RO выражение уменьшается после фиксации, анализировать образцы по течению цитометрии после иммуностоинга. Для оценки дифференциации, ворота в следующем порядке: синглеты (FSC-H против FSC-A), живые CD3и Т-клетки (Dump (Сброс »живой-мертвый фиолетовый, CD14-PB и CD19-PB против CD3-BV605», CD4-BV510 против CD8-APC-H7). ВCD4 иCD8 подмножествах, ворота на CD45RO-PE против CCR7-FITC для определения наивных Т-клеток (CD45RO-CCR7, Tcm (CD45RO-CCR7),Тем (CD45RO-CCR7-и Tte (CD45RO-CCR7-). Для идентификации Tscm, ворота на CD27и Т-клетки в наивных, как Т-клетки населения. В этом отсеке, Tscm являются CD95и Tn являются CD95-.

3. В vitro функциональный анализ

  1. ПРОлиферация т-клеток CAR и секреция цитокинов
    1. Проверить экспрессию CAR, а также жизнеспособность клеток, как описано в шагах 1.5 и 1.7, цитометрией потока.
    2. Вымойте 5 х 106 Т-клеток от каждой группы (день 3, день 5 и день 9) с PBS и resuspend в 1 мкм раствор карбоксифлюоресцеи диацетат succinimidyl эфир (CFSE) в PBS в течение 3,5 мин на RT.
    3. Немедленно добавьте 10 мл PBS, содержащий 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), чтобы утолить реакцию.
    4. Centrifuge раствор на 300 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и повторите этот шаг стирки три раза. Подсчитайте клетки в конце CFSE окрашивания с помощью счетчика Coulter (Таблица материалов).
    5. Урожай CFSE окрашенных клеток (нестимулированных), resuspend в 1% PFA и хранить при 4 кВ для анализа по потоку цитометрии.
    6. Инкубировать желаемое количество CFSE окрашенных CAR T-клеток с облученной K562-CD19 (цель), а также K562-дикий тип (контроль) клетки в соотношении 1:1 на 120 ч в цитокинов свободной культуры среды и культурных условий, как описано в шаге 1.1.
    7. После 24 ч центрифуги культуры судна на 300 х г в течение 5 мин. Соберите 120 л клеточного супернатанта. Оцените производство IL2, IFN, TNF, GM-CSF и других воспалительных цитокинов (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 и IL10) по анализу Luminex в соответствии с рекомендациями производителя.
    8. Замените объем супернатанта, который был собран в шаге 3.1.7 с эквивалентным объемом (120 л) свежей среды.
    9. На 3-й день (т.е. после 96 ч) количество и повторное кормление при концентрации 0,5 х 106 клеток/мл с использованием цитометрии потока на основе биса, как ранее в шаге 1.5.
    10. На день 5, подсчитайте живые клетки CD3и вычислите изменение створки в реальном маштабе времени Т-клеток по отношению к реальному отсчету клетки T на день е 0.
    11. Выполните комплексный анализ разбавления CFSE при делении Т-клеток CAR с использованием программного обеспечения FlowJo для выделения последовательных раундов деления клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы распространения хорошо описаны в руководстве FlowJo.
  2. Цитотоксичность асссы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Способность клеток CART19 убивать клетки-мишени, выражающие CD19, оценивается с помощью 51Cr-асссе.
    1. Этикетка целевых клеток путем смешивания 5 х 105 K562-CD19, K562-дикий тип контрольных клеток, или NALM6 лейкозных клеток с 50 Л Na251CrO4 и 0,5 мл RPMI дополнил 10% FBS для 90 мин в инкубаторе при 37 градусах Цельсия.
    2. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 2,5 мин. Отбросить радиоактивный супернатант в соответствующих бункеров удаления и мыть целевые клетки в 5 мл PBS. Повторите шаги стирки дважды.
    3. Resuspend целевых клеток в фенол красно-свободной среде, содержащей 5% FBS. Используйте эту среду для остальной части процедуры, чтобы уменьшить фон.
    4. После оценки экспрессии ЦАР и жизнеспособности клеток по цитометрии потока (как описано в разделе 5.1), смешайте клетки CAR T с помеченными клетками-мишенями в эффекторе:целевые (E:T) соотношения 10:1, 3:1 и 1:1, в тройном. Передача на 96-пузыжную нижнюю пластину U.
    5. Параллельно, включают целевые клетки в одиночку, и целевые клетки с 1% сульфат атрия dodecyl (SDS), чтобы определить спонтанное (S) и максимальный (M) 51Cr релиз, соответственно.
    6. Клетки центрифуги при 300 х г в течение 5 мин и инкубируют 4 ч или 20 ч в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
    7. После назначенного времени центрифугия сосуда культуры на 300 х г в течение 5 мин. Соберите 35 зл клеточного супернатанта и перенесите на читательную тарелку. Избегайте пузырьков. Дайте пластине высохнуть на ночь.
    8. Запечатайте тарелку стандартной пластиной и посчитайте жидким счетчиком сцинтилляции. Избыток хрома в супернатанте обеспечивает прокси-убийство клеток-мишеней. Рассчитайте процент конкретного лисиса следующим образом: 100 x (счет в минуту (cpm) экспериментальный релиз - cpm S релиз) / (cpm M релиз - cpm S релиз).

4. В Vivo функциональный анализ

  1. Получить от 6-10-недельных NOD-SCIDc-/- (NSG) мышей, которые не имеют адаптивной иммунной системы, и назначить их для лечения / контроль группы случайным образом.
  2. Впрыскивать животных внутривенно через хвостовую вену с 1 х 106 NALM6 клеток в 0,1 мл стерильных PBS.
  3. После 5–7 дней, подтвердите прививку опухоли с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI). Вводят 150 мг/кг D-люциферина мышам, которые были обезболированы изофлураном (объем зависит от массы тела).
  4. Измерьте значения биолюминесценции с помощью системы визуализации. Количественная суммарная часть с помощью соответствующего программного обеспечения путем рисования прямоугольников одинаковой области вокруг мышей, достигая от головы до 50% от длины хвоста. Вычесть фон для каждого изображения в отдельности.
  5. После установления лейкемии, вводить 3 х 106 день 9 CART19 клеток, 0,5 х 106 день 3 CAR Т-клеток, или соответствующие нетрансиндуцированных (NTD) человека Т-клеток через хвост вены в объеме 100 л стерильных PBS / Ca2 "
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку биоактивность клеток, собранных через различные промежутки времени во время процесса культуры, отличается, выбранная концентрация 3-го дня клеток ниже, чем 9-й день.
  6. Чтобы определить прогрессирование заболевания, измерьте значения биолюминесценции два раза в неделю, как описано выше в шаге 4.3.
  7. Чтобы определить прививку CAR T, соберите 75 л крови с помощью ретро-орбитального кровотечения в трубке с покрытием ЭДТА. Перенесите 50 зл крови в абсолютные трубки подсчета.
  8. Пятно крови с антителами против CD45, CD4, CD8 и CAR в течение 30 мин на RT. Добавить 400 зл и 1x FACS лизинируя раствор труб и вихря тщательно. После окрашивания, анализировать выражение поверхностного маркера по течению цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие поверхностные маркеры могут быть использованы для оценки дифференциации и истощения статус Т-клеток в крови.
  9. Для измерения уровня цитокинов в крови, центрифуга крови на 1200 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы отделить сыворотку от верхнего слоя крови.
  10. Соберите сыворотку и измерьте цитокины с помощью назначенной читательской тарелки в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя описанные выше методы, мы стимулировали и расширяли Т-клетки в течение 3 или 9 дней(рисунок 1A,B). Мы также проанализировали их профиль дифференциации, о чем свидетельствует стратегия gating, изложенная на рисунке 1C,путем измерения изобилия различных гликопротеинов, выраженных на поверхности клетки. Мы показываем прогрессивный сдвиг в сторону дифференциации эффектора с течением времени во время культуры ex vivo

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем подходы к измерению функции и эффективности CAR Т-клеток, собранных с разными интервалами всей культуры ex vivo. Наши методы обеспечивают всестороннее понимание анализов, предназначенных для оценки пролиферативной способности, а также функции эффектора in vitro. Мы описываем, как измерить активность CAR T клеток после стимуляции через CAR и подробно ксенотрансплантата модели лейкемии с использованием CAR Т-клеток, собранных в день 3 против 9 их стадии логарифмического расширения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана частично за счет финансирования, предоставляемого Novartis Pharmaceuticals через исследовательский альянс с Университетом Пенсильвании (Майкл К. Милоне), а также Санкт-Болдрик Фонд Стипендиат премии (Саба Ghassemi).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти CD3/CD28 динабетThermo Fisher40203D
APC Мышь против человека CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 Мышиное антитело к человеку CD8BD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Лизирующий раствор 10X КонцентратBD Biosciences349202
BD Trucount Абсолютные счетные пробиркиBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 античеловеческое антитело к CD4BioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 античеловеческое антитело к CD3BioLegend317322RRID:AB_2561911
Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSELife TechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) АнтителоBD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Мышиный античеловеческий CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Сыворотка AB человекаValley BiomedicalHP1022
Human IL-2 IS, премиум классMiltenyi130-097-744
L-глутаминGibco28030-081
Счетчик жидкого сцинтилляции, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD Фиксируемые фиолетовыемолекулярные зондыL34964
Multisizer CoulterCounter Beckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific Синее антитело против человеческого CD14BioLegend325616RRID:AB_830689
Тихоокеанское голубое антитело против человеческого CD19BioLegend302223
PE против человеческого CD45RO АнтителоBD Biosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 против человеческого CD95 (Fas) АнтителоBioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 против человеческого антитела CD27 Beckman CoulterA54823
Фенол свободный от красных средGibco10373-017
UltraPure SDS Solution, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Люциферин - K+ СольPerkin Elmer122799

Ссылки

  1. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).
  4. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  6. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).
  8. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  9. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  10. Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
  11. Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  12. Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
  13. Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
  14. Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
  15. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  16. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  17. Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
  18. Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).
  19. Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  20. Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
  21. Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
  24. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  25. Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

X Vivo 15CD3 CD28
Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.