Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59950

⸱

19 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в клетках и тканях мозга, используя иммунофлуоресцентное окрашивание и методы точечной пятна ДНК.

Аннотация

В геноме млекопитающих были выявлены множественные модификации ДНК. Из них интенсивно изучены 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин-опосредованные эпигенетические механизмы. 5-гидроксиметилцитозин отображает динамические особенности во время эмбрионального и послеродового развития мозга, играет регулятивную функцию в экспрессии генов и участвует в множественных неврологических расстройствах. Здесь мы описываем подробные методы, включая иммунофлуоресцентное окрашивание и днк-пятна для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в культивированных клетках и тканях мозга мыши.

Введение

Эпигенетические модификации, включая модификацию ДНК, модификацию гистона и модификацию РНК, как было показано, играют важную роль в различных биологических процессах и заболеваниях1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Долгое время метилирование ДНК (т.е. 5-метилцитозина (5-мС)) рассматривалось как высокостабильный эпигенетический маркер и не может быть дополнительно изменено в геноме. Недавно было установлено, что 5-mC может быть окислен до 5-гидроксиметилцитозина (5-хмС) TET (Десять-одиннадцать транслокаций) семейных белков, включая TET1, TET2, и TET38,9. Дальнейшие исследования показывают, что 5-hmC может служить стабильным маркером и играть биологические роли путем регулирования экспрессии генов4,10,11,12.

Настоящие данные свидетельствуют о том, что 5-хмС высоко обогащен нейронными тканями/клетками по сравнению с другими типами тканей у млекопитающих, и обладает динамическими особенностями во время развития нейронов13,14. В нейрональной системе, 5-hmC опосредованные эпигенетические модификации играют важную роль в регулировании нервных стволовых клеток, нейронной активности, обучения и памяти, и участвует в нескольких неврологических расстройств, включая синдром Ретт, аутизм, болезнь Альцгеймера болезни, болезнь Гентингтона и др.2,13,15,16,17,18,19,20.

Существует несколько подходов к обнаружению 5-хмВ в клетках и тканях14,21,22,23,24. Здесь мы описываем два метода обнаружения существования 5-хмИ и количественной оценки глобального уровня 5-хмС: иммунофлуоресцентное окрашивание и точечная поместья ДНК. Эти два метода удобны и чувствительны, и были успешно использованы в предыдущих исследованиях25,26,27,28,29,30. Ключевыми шагами этих двух методов являются денатурация ДНК. Для окрашивания иммунофлюоресценции 5-хмС требуется предварительная обработка образцов с 1 М ЛК. Для 5-хмC точечной блохины, денатурация ДНК выполняется с раствором NaOH. Эти два метода вместе с секвенированием следующего поколения являются очень полезными инструментами для исследования функции 5-hmC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Чжэцзян.

1. Культура взрослых нейронных стволовых клеток и нейронов

  1. Изолировать взрослых нейронных стволовых клеток из передний мозг взрослого (8-10 недель) C57/BL6 мужской мыши, как описано ранее31,32.
  2. Культура взрослых нервных стволовых клеток в DMEM/F-12 среды, содержащей 20 нг/мЛ FGF-2, 20 нг/мЛ EGF, 2% B27 дополнения, 1% антибиотик-антимикотические, и 2 мМ L-глютамин в 5% CO2 инкубатор при 37 градусах Цельсия. Побудить дифференциацию взрослых нервных стволовых клеток с 1 ММ ретинойной кислоты и 5 мкм форсколин для 48 ч, как описано ранее31,32.
  3. Изолировать нейроны из эмбрионального дня 17 (E17) гиппокампов мыши и культуры с нейробазальной среды, содержащей 0,25% L-глютамин, 0,125% GlutaMax и 2% B27 дополнения в 5% CO2 инкубатора на 37 градусов по Цельсию, как ранее описано33.

2. Транскардиация Перфузия мыши

  1. Приготовьте 10% хлорного гидрата, 4% параформальдегида (PFA) и фосфата буферного солей (PBS) за день до эксперимента, и храните при 4 градусах Цельсия.
  2. Анестезия взрослого мужчины или женщины C57 BL/6J мыши с 10% хлорного гидрата (50 мг/кг, т.п.), и убедитесь, что животное глубоко обезболивается, проверяя реакцию организма. Исправьте каждую конечность липкой лентой на пластиковой доске (в положении лицом вверх).
  3. Вырезать кожу, а затем мышцы с хирургией ножницы. Откройте грудную полость хирургическим ножницами. Выставить сердце и отрезать небольшую часть правого предсердия тонкими хирургическими ножницами.
  4. Пронизыруйте мышь одноразовым стерилизованный шприц из левого желудочка с холодным PBS (около 30 мл на взрослую мышь).
  5. Perfuse мыши с 4% PFA (около 30 мл в 10 минут на взрослых мышей), пока она не является жесткой.
  6. Откройте череп мыши костными щипками. Удалить мозг и положить в 5 мл 4% PFA в 15 мл центрифуги трубки для пост-фиксации при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите хирургическую область после завершения операции.
  7. По крайней мере 24 ч позже, передать образцы мозга в 30% сахарозы решение для полного обезвоживания при 4 градусах Цельсия.

3. Секция мозга

  1. Встраивай образец ы головного мозга в оптимальное режущее температурное соединение (OCT) в небольшой контейнер и остыть при температуре -20 градусов по Цельсию, по крайней мере, 1 ч.
  2. Сечение образцов мозга толщиной 20-40 мкм с криостатом микротомом.
  3. Сбор разделов в PBS и хранить при 4 градусах Цельсия.

4. Иммунофлуоресценция окрашивание

  1. Возьмите разделы с целевыми областями мозга и положить их в 24-колодец пластины с PBS. Для культивированных клеток на крышке, перейдите непосредственно к шагу 4.2.
  2. Вымойте pbS на шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут. Повторите это еще дважды.
  3. Удалить PBS, и лечить с разогретым 1 M HCl в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1 m HCl, добавив 1 мл соляной кислоты (36-38%) в 10 мл воды в химическом капоте. Разогреть 1 M HCl в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию.
  4. Вымойте образцы с PBS в течение 5 мин. Повторите это в два раза больше.
  5. Блок образцы с PBS, содержащие 3% нормальной сыворотки козы и 0,1% Тритон X-100 на 1 ч на шейкер при комнатной температуре.
  6. Инкубировать секции с конкретными первичными антителами на ночь при 4 градусах по шейкеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие первичные антитела: поликлональные антитела кролика анти-5-гидроксиметилцитозин (1:5,000), мышь моноклонального антитела анти-NeuN (1:500).
  7. Выняйте образцы и далее инкубировать при комнатной температуре на 1 ч.
  8. Вымойте образцы с PBS в течение 10 мин. Повторите это в два раза больше.
  9. Инкубировать вторичными антителами, соответствующими первичным антителам при комнатной температуре в течение 1 ч на шейкере. Накройте тарелку алюминием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие вторичные антитела: Alexa Fluor 488 коза анти-кролик IgG (1:500), Alexa Fluor 568 коза анти-мышь IgG (1:500). Противостойные ядра с 4'-6-диамидино-2-фенилинол (DAPI).
  10. Вымойте образцы с PBS в течение 10 минут на шейкере. Повторите это еще дважды.
  11. Смонтировать участки мозга на слайды, добавить надлежащее количество антифадейн монтажа среды (около 100-150 л), и накрыть премиум крышкой стекла. Печать с лаком для ногтей.
  12. Возьмите изображения с помощью регулярного или конфокального флуоресцентного микроскопа.

5. Геномная изоляция ДНК

  1. Эвтаназия взрослых C57 BL/6J мыши (мужчины или женщины) путем вывиха шейки матки и удалить мозг.
  2. Рассекать гиппокамп, коры головного мозга и мозжечка ткани на ледяное охлаждение блюдо. Измельчить ткани с помощью тробиотли в 1 мл буфера лиза ДНК и перенести в чистую микроцентрифугную трубку. Добавьте 250 мкг протеиназа K на 600 л люсисбуфера. Для клеточных гранул, непосредственно добавить буфер лисиса, протеиназа K, и тщательно перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка днк-лисис буфера: 5 мМ EDTA, 0,2% SDS, 200 мМ NaCl в 100 мм Tris-HCl, рН 8,5. Вымойте и автоклавировать мясорубку ткани перед экспериментом.
  3. На второй день, добавить около 50 мкг RNase A в образец, по крайней мере 12 ч при 37 градусов по Цельсию.
  4. Добавьте равный объем фенола: хлороформ: изоамил овый спирт (25:24:1) и полностью перемешайте.
  5. Центрифуга на 20817 х г в течение 15 минут, и удалить супернатант в новую микроцентрифугую трубку.
  6. Добавьте 600 л хлороформа в супернатант, чтобы выровнять ДНК, и тщательно перемешать.
  7. Центрифуга на 20817 х г в течение 15 минут, и удалить супернатант в другую новую трубку.
  8. Добавьте 500 зл изопропанола в супернатант и тщательно перемешайте.
  9. Центрифуга на 20817 х г в течение 15 минут, и удалить супернатант полностью.
  10. Вымойте осадки с 1 мл 70% этанола, центрифуга на 20817 х г в течение 1 мин, и удалить супернатант полностью. Повторите один раз.
  11. Высушите гранулы ДНК полностью.
  12. Растворите гранулы ДНК с буфером Tris-HCl (pH 8.5) до надлежащей концентрации.

6. ДНК Точка пятно

  1. Подготовьте решения: 2 M NaOH, буфер Tris-HCl (pH 8.5), 6x соленовый цитрат натрия (SSC).
  2. Сделать образец смеси в виде таблицы 1.
  3. Денатурная днк образцов при 100 градусах по Цельсию в течение 10 минут, и остыть на льду.
  4. Вырезать надлежащий размер нейлоновой мембраны (например, Hybond-N) и промыть 6x SSC.
  5. Положите мембрану на точечный аппарат и подключитесь к вакуумным насосом. Намперся на мембране 6 л смеси на одну точку.
  6. Гибридизируйте в течение 30 мин при 80 градусах Цельсия и заблокируйте образец мембраны обезжиренным молоком в солине Tris-буферизированном (TBS) в течение 1 ч.
  7. Инкубировать с первичными антителами при 4 градусах Цельсия на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: следующие первичные антитела: поликлональный кролик анти-5-гидроксиметилцитозин (1:5,000).
  8. На второй день инкубировать образец мембран при комнатной температуре 1 ч. Промойте TBS в течение 10 мин. Повторите эту стирку еще дважды.
  9. Инкубировать мембрану с анти-кроличьи вторичные антитела (1:5,000) в течение 30 минут при комнатной температуре.
  10. Вымойте TBS в течение 10 мин. Повторите эту стирку в два раза больше.
  11. Визуализируйте сигналы хемилюминесценции и количественно очислите интенсивность сигнала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы выявить распределение 5-хмВ в гиппокампе взрослых мышей, мы выполнили иммунофлуоресценцию с антителами против нейрональных клеток (NeuN) и 5-hmC. В гиппокампе, 5-hmC совместно локализованы хорошо с нейрональной клеточной маркерной нейН(Рисунок 1A-H), предлагая обогащение 5-hmC в нейронах.

Для определения динамики 5-хмВ во время развития нейронов была впервые выполнена точечная поместье с помощью образцов ДНК, изолированных от размножающихся ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эпигенетические модификации играют важную роль при развитии мозга, созревании и функции. Как стабильный маркер для модификации ДНК, динамический 5-hmC реагирует на поведенческую адаптацию, нейронную активность, и положительно коррелирует с экспрессией генов; Таким образом, он участвует в нормальной функции мозга и неврологическое расстройство4. Чтобы исследовать его функцию в клетках и тканях, необходимо обнаружить существование 5-хмС и сравнить уровень до и после лечения. Здесь мы продемонстриров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конкурирующих финансовых интересов не существует.

Благодарности

XL была частично поддержана Национальной программой исследований и разбивки ключей Китая (2017YFE0196600) и Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No s. 31771395, 31571518). З.С. была поддержана Национальной программой исследований и развития ключевых стран Китая (2017YFC1001703) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2017C03009). W.X. была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY18H020002) и Отделом науки провинции Чжэцзян (2017C37057).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4'-6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)Sigma-AldrichD8417
Программное обеспечение Adobe PhotoshopAdobe Inc./
Alexa Fluor 488 козий анти-кроличий IgGThermo FisherA11008
Alexa Fluor 568 козий анти-мышиный IgGThermo FisherA11001
анти-5-гидроксиметилцитозинактивный мотив39769
анти-NeuNMilliporeMAB377
B27 добавкаGibco12587-010
Добавка B27Gibco12580-010
Добавка B27Gibco17504-044
микротом криостатаLeicaCM1950
DMEM/F-12 среднийOmegaScientificDM25
Эпидермальный фактор ростаPeproTech100-15
Фактор роста фибробластов-базовыйPeproTech100-18B
ForskolinSigma-AldrichF6886
GlutaMaxThermo35050061
L-глутаминGibco25030-149
Нейробазальная средаGibco21103-049
Нормальная козья сывороткаVector LaboratoriesZ0325
Нейлоновая мембрана (Hybond&-N+ )Amersham Biosciences
OCTLeica14020108926
Pen StrepGibco15140-122
Фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24:1 )Sigma-Aldrich516726
поли-D-лизинSigmaP0899-10
Протеиназа KVVR39450-01-6
Ретиноевая кислотаSigma-AldrichR2625
Triton X-100SolarbioT8210
RPN303B

Ссылки

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905(2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903(2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Детекция 5-гидроксиметилцитозинаиммунофлуоресцентное окрашиваниедот-блот ДНКткань мозга мышисекционирование тканейкриостат-микротомпервичные антителавторичные антителаконфокальная микроскопия
Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.