Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

Cheryl A. Hobbs; Leslie Recio; John Winters; Kristine  L. Witt

doi:10.3791/59955

Методическая статья

Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59955

⸱

24 марта 2020 г.

Cheryl A. Hobbs^*¹ , Leslie Recio¹ , John Winters¹ , Kristine L. Witt²

¹Toxicology Program, ILS, Inc., ²Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает несколько процедур для подготовки высококачественных образцов замороженных тканей во время некропсии для использования в анализе кометы для оценки повреждения ДНК: 1) рубленая ткань, 2) Царапины эпителиальных клеток из желудочно-кишечного тракта, и 3) кубических тканей образцы, требующие гомогенизации с помощью устройства для измельчения тканей.

Аннотация

Анализ кометы набирает популярность как средство оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, особенно после воздействия химических веществ или других экологических стрессоров. Использование анализа кометы в регулятивном тестировании генотоксического потенциала у грызунов было обусловлено принятием в 2014 году директивы Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Комета асссея слайды, как правило, готовятся из свежей ткани во время некропсии; однако, замораживание образцов тканей может избежать логистических проблем, связанных с одновременной подготовкой слайдов из нескольких органов на животное и от многих животных в исследовании. Замораживание также позволяет отгружать образцы из объекта воздействия в другую лабораторию для анализа, а хранение замороженных тканей облегчает отсрочку принятия решения о генерации данных о повреждении ДНК для данного органа. Анализ щелочной кометы полезен для обнаружения двух- и однострочных разрывов ДНК, щелочных лабильных поражений и разрывов нитей, связанных с неполным восстановлением иссечения ДНК. Тем не менее, повреждение ДНК может также в результате механических стрижки или неправильной обработки образцов процедур, смешивая результаты анализа. Воспроизводимость в сборе и обработке образцов тканей во время некропсии может быть трудно контролировать из-за колебания лабораторного персонала с различным уровнем опыта в сборе тканей для проверки кометы. Повышение согласованности путем повышения квалификации или развертывания мобильных подразделений, укомплектованных опытным лабораторным персоналом, сопряжено с большими расходами и не всегда может быть осуществимо. Для оптимизации последовательного поколения высококачественных образцов для анализа анализа анализа комет был оценен метод гомогенизации флэш-замороженных кубов ткани с помощью настраиваемого устройства для рубки тканей. Образцы, подготовленные для анализа кометы этим методом, по сравнению по качеству с образцами свежих и замороженных тканей, подготовленными путем измельчения во время некропсии. Кроме того, низкий базовый ущерб ДНК измерялся в клетках из замороженных кубов ткани после длительного хранения.

Введение

Анализ кометы все чаще используется в качестве средства оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, подвергающихся воздействию химических веществ или других экологических стрессоров^1. Анализ может обнаружить ДНК двух- и однострочных разрывов, щелочных лабильных поражений, и однострочные перерывы, связанные с неполным ремонтом ДНК. Международный совет по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человека (ICH) руководство для фармацевтического тестирования рекомендует ДНК нити асссе, такие как анализ кометы в качестве второго теста в дополнение к грызунов эритроцита микронуклета анализа д....