Методическая статья

Одноклеточная durotaxis Анализ для оценки механического контроля клеточного движения и связанных с ними сигнальных событий

DOI:

10.3791/59995

⸱

27 августа 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Vermont Larner College of Medicine, 2University of Vermont Cancer Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Vermont Larner College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механические силы имеют важное значение для контроля миграции ячеек. Этот протокол демонстрирует использование эластичных гидрогелей, которые могут быть деформированы с помощью стеклянного микропипетика и микроманипулятора, чтобы стимулировать клетки с локальным градиентом жесткости, чтобы вызвать изменения в структуре клеток и миграции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дуротаксис – это процесс, с помощью которого клетки ощущают и реагируют на градиенты напряжения. Для того, чтобы изучить этот процесс in vitro, жесткость субстрата, лежащего в основе клетки, должна быть обработана. В то время как гидрогели с градуированной жесткостью и долгосрочными миграционными анализами оказались полезными в исследованиях durotaxis, немедленные, острые реакции на локальные изменения в напряжении субстрата позволяют целенаправленно изучать отдельные движения клеток и субклеточные сигнальные события. Для повторного тестирования способности клеток чувствовать и реагировать на тонус поддвижного субстрата используется модифицированный метод применения острых градиентов повышенного напряжения к отдельным клеткам, культивируемым на деформируемых гидрогелях, что позволяет в режиме реального времени манипуляции силы и направления жесткости градиентов, привитых на клетки в вопросе. Кроме того, путем тонкой настройки деталей и параметров исследования, таких как форма и размеры микропипетты или относительное положение, размещение и направление прикладного градиента, анализ может быть оптимизирован для изучения любого механически чувствительный тип клеток и система. Эти параметры могут быть изменены, чтобы надежно изменить прикладной стимул и расширить функциональность и универсальность асссе. Этот метод позволяет изучить как долгосрочные дуротаксические движения, а также более непосредственные изменения в клеточной сигнализации и морфологической динамики в ответ на изменение жесткости.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние несколько десятилетий, важность механических свойств среды клетки получила все большее признание в клеточной биологии. Различные ткани и внеклеточные матрицы имеют различные относительные скованности и, как клетки мигрируют по всему телу, они перемещаются эти изменения, используя эти механические свойства, чтобы направлять их1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Клетки используют жесткость данной ткани, чтобы сообщить их подвижное поведение во время процессов, таких как развитие, заживление ран, и метастазы рака. Тем не менее, молекулярные механизмы, которые позволяют ощущение и ответ на эти механические входы остаются в значительной степени неизвестны1,2,3,4,5, 6 , 7.

Для того, чтобы изучить механизмы, с помощью которых клетки реагируют на физические экологические сигналы, жесткость или жесткость подстилающих клеток адепта должны быть манипулированы. В 2000 году Чун-Мин Ло, Yu-Li Wang и его коллеги разработали асссс8, в соответствии с которым мотовый ответ отдельных клеток на изменение механических сигналов может быть непосредственно протестирован путем растяжения деформируемой внеклеточной матрицы (ECM) с покрытием полиакриламид гидрогели, на которых были покрыты клетки. Клетки демонстрируют значительное предпочтение для миграции в сторону более жестких субстратов, явление, которое они окрестили "durotaxis".

После первоначального доклада в 2000 году для изучения дуротаксиса были использованы многие другие методы. Крутые градиенты жесткости были изготовлены путем литья гелей над жесткими функциями, такими как полистирол бусы9 или жесткие полимерные столбы10 или путем полимеризации субстрата по краям стеклянных крышки11 для создания механических ' шаг-границы. Кроме того, гидрогели с более мелкими, но фиксированными градиентами жесткости были изготовлены различными методами, такими как градиенты кросслинкера, созданные микрофлюидными устройствами12,13 или бок о бок каплями гидрогеля различной жесткости8, или гидрогелей с фотореактивным кросслинкером, обработанным с градуированным воздействием УФ-излучения для создания линейного градиента жесткости14,15. Эти методы были использованы для большого эффекта для исследования durotactic клеточного движения в массовом порядке с течением времени. Однако, как правило, эти функции изготавливаются до клеточного покрытия и их свойства остаются последовательными в течение эксперимента, полагаясь на случайное движение клеток для выборки механических градиентов. Ни один из этих методов поддаются наблюдению быстрых изменений в клеточном поведении в ответ на острый механический стимул.

Для того, чтобы наблюдать клеточной реакции на острые изменения в механической среде, одиночные анализы durotaxis ячейки предлагают несколько преимуществ. В этих анализах, отдельные клетки даны острый, механический стимул, потянув основной субстрат от клетки со стеклянной микропипеткой, тем самым вводя направленный градиент клеточной матрицы напряженности. Изменения в поведении подвижного, такие как скорость или направление миграции, затем наблюдаются с помощью контрастной микроскопии фазы живых клеток. Такой подход облегчает прямое наблюдение причинно-следственной связи между механическими стимулами и миграцией клеток, поскольку позволяет быстро, итеративное манипулирование направлением и величиной градиента напряжения и оценку последующего сотовых реакций в режиме реального времени. Кроме того, этот метод может также использоваться для механически стимулирующих клетки, выражающие флуоресцентные белки синтеза или биосенсоры, чтобы визуализировать изменения в количестве, активности или субклеточной локализации белков, подозреваемых в участии в механосенсировании и дюротаксис.

Этот метод был использован группами, которые изучают durotaxis8,16 и описывается здесь, как он был адаптирован лабораторией Хоу для изучения дуротаксического поведения sKOV-3 раковых клеток яичников и молекулярных механизмов, которые под дуротаксис17. Кроме того, описан модифицированный метод изготовления гидрогелей с одним, ровным слоем флуоресцентных микросфер вблизи поверхности клеточной культуры; это облегчает визуализацию и оптимизацию микропайпетов генерируемых градиентов деформации и может позволить оценку сотруднности клеток с помощью микроскопии силы тяги.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление деформируемых гидрогелей полиакриламида со встроенными флуоресцентными микросферами

ПРИМЕЧАНИЕ: Направления описывают полимеризацию гидрогеля 25 кПа диаметром 22 мкм и толщиной около 66 мкм. Каждый или все эти параметры могут быть изменены и направления для этого можно найти в таблице 1 и в примечаниях17.

  1. Активация стеклянно-нижней посуды или чехлы
    1. Подготовьте связывающее силанное рабочее решение для активации стеклянного дна, в котором можно сделать визуализацию, или крышку, которая вписывается в живую камеру изображения. Смешайте 950 л 95% этанола, 50 л ледниковой уксусной кислоты и 5 л связующего силана (y-methacryloxypropyltrimthoxysilane).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование большего нижнего coverslip по сравнению с верхней coverslip даст дополнительную возможность для работы при подготовке геля и облегчит позиционирование стеклянного микропайпета в более поздних шагах. Кроме того, при использовании coverslip, а не стеклянное дно изображений блюдо, очистить крышку, как описано в следующем разделе.
    2. Активируйте поверхность стекла на 20 с коронарной палочкой и немедленно накладывай 50 зл на связующего силана рабочего раствора. Дайте раствору высохнуть в течение 10 мин.
    3. Промыть два раза с 95% этанола, затем два раза с изопропанол, а затем позволить coverslips к airdry в течение примерно 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активированное стекло может храниться до одной недели в desiccator.
  2. Очистка верхних крышки
    1. Очистите 22 мм верхние крышки, инкубируя в 2% HCl при 70 градусах по Цельсию в течение 30 минут, затем промойте в ddH2O в течение 10 минут два раза.
    2. Инкубировать крышки в растворе 2% кювет очистки концентрата в ddH2O при 50 градусах по Цельсию в течение 30 мин, затем мыть в ddH2O в течение 10 мин два раза.
    3. Инкубировать крышки в ddH2O при 90 градусах по Цельсию в течение 30 мин, затем в 70% этанола при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин, а затем высушите воздух при 60 градусах по Цельсию в течение как минимум 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные крышки могут храниться бесконечно в чистом обезвращенном.
  3. Флуоресцентная микросфера/осаждение биса на верхние крышки
    1. Сосновкация стокового раствора флуоресцентных микросфер на 1 ч в ультразвуковой водяной бане. Сделать рабочий раствор биса путем разбавления биса бульон 1:200 в 100% этанола и sonicate снова в течение 1 ч.
    2. 15 мин до раствора бисины закончил sonicating, тщательно очистить крышки, поместив их вертикально в керамический держатель крышки и лечения комнатно-воздушной плазмы в течение 3 минут в столешнице плазмы чище.
    3. Для облегчения обработки и предотвращения скольжения крышки во время последующих шагов, поместите кусок парафильма в 60 мм крышкой чашки Петри или аналогичный контейнер. Поместите крышку в стабилизатор и слегка нажмите вниз, обеспечивая хороший контакт между parafilm и coverslip.
    4. Для 22 мм coverslip, добавить 150 л рабочего раствора биса в верхней части coverslip. Немедленно аспирировать раствор этанола с борта coverslip, оставляя шарики на coverslip. Разрешить coverslip к airdry.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавленного раствора рабочего бисора должно быть 4 л/см2 и может быть уменьшено для размещения любого размера крышки.
  4. Гидрогели литья со встроенными флуоресцентными бусинами
    1. Приготовьте гидрогелевый раствор ариламида и бис-акриламид. Смешайте раствор в соответствии с таблицей 1, затем добавьте 2,5 л 10% APS и 0,5 л TEMED. Хорошо перемешать. Немедленно переходите к следующему шагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь раствора гидрогеля может быть изменена, чтобы изменить модули молодых, или жесткость, гидрогеля, изменив соотношение акриламид бис-акриламид, как показано в таблице 1. Эти значения были проверены для использования в лаборатории Хоу с использованием атомной микроскопии силы, но должны быть подтверждены в своем учреждении.
    2. Сразу же после приготовления раствора гидрогеля, добавить 25 л капли в активированную сторону стеклянно-нижней тарелки или нижней крышкой, а затем сразу же поместите бисером покрытием крышкой на раствор, бисером стороной вниз. Контакт капли с дальней стороны coverslip следуют медленного снижения помогает избежать захвата пузырьков воздуха в гидрогеле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высота гидрогеля должна быть в пределах рабочего расстояния объектива, который будет использоваться в более позднем эксперименте. Гидрогель высотой 66 мкм хорошо работает для большинства систем. Размер гидрогеля можно масштабировать, добавляя более или менее гидрогелевное решение в зависимости от размера крышки. Для расчета соответствующего объема раствора гидрогеля используйте уравнение для объема цилиндра, V q r2h, где r является радиусом крышки, а h - желаемой высотой гидрогеля. Как правило, этот расчет с достаточной точностью предсказывает фактическую высоту гидрогеля, измеряемой путем подготовки геля с покрытыми бисой крышками как сверху, так и снизу и с помощью конфокального микроскопа для измерения расстояния между двумя плоскостями биса. Однако было отмечено, что фактическая высота гидрогеля может отклоняться от этого расчета на 20 мкм (например, в зависимости от толщины и производителя верхнего стеклянного покрытия). Рекомендуется прямое измерение высоты геля с использованием описанного выше метода.
    3. Разрешить гель полимеризации в течение 30 мин, а затем удалить верхний coverslip мягко с щипками. Добавление 50 мМ HEPES pH 8.5 к блюду может облегчить удаление. Вымойте в течение 5 мин в 50 мМ HEPES pH 8,5 три раза.
  5. Активация гидрогеля и внеклеточное матричного покрытия
    1. Активировать поверхность гидрогеля путем инкубации в 0,4 мм Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноат в 50 мМ HEPES pH 8.5. Немедленно подвергаемую воздействию ультрафиолетовую дуговую лампу в закрытой зоне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите Sulfo-SANPAH от света до активации. Для лампы 400 Вт, положение гель 10 см от лампы в световой коробке и осветить в течение 100 с. Раствор Sulfo-SANPAH будет меняться от ярко-оранжевого до темно-коричневого.
    2. Вымойте в течение 5 мин в 50 мМ HEPES pH 8,5 три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидратированные гели могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение одной недели.
    3. Инкубировать активированный гидрогель в 20 мкг/мл фибронектина в 50 мм HEPES pH 8.5 на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    4. Аспирировать раствор фибронектина и мыть в течение 5 минут в фосфат-буферных солен (PBS) в три раза. Стерилизовать гидрогель и крышку блюда в течение 15 минут под ультрафиолетовым светом в капюшоне культуры тканей с низким объемом PBS. Вымойте один раз в стерильных PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы белка ECM могут быть использованы для покрытия гидрогеля, включая коллаген и ламинин.

2. Покрытие ячеек

  1. Добавьте 3 мл носителей, содержащих 21 000 ячеек, чтобы заполнить 60-мм блюдо для конечной плотности клеток в 1000 ячеек/см2. Отрегулируйте плотность посева по мере необходимости, чтобы предотвратить скученность и обеспечить свободное передвижение отдельных клеток.
  2. Разрешить клеткам восстанавливаться при 37 градусах По Цельсия, по крайней мере 4 ч и до 18 ч до изображения. Приготовьтесь к визуализации, промывая с помощью средств обработки изображений два раза, прежде чем добавлять средства обработки изображений. Разрешить клеткам уравновесить, по крайней мере 30 минут до изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия среды экрана заранее определяют условия, которые оптимизируют миграцию в используемой линии ячейки. Для клеток SKOV-3, DMEM без фенола красного, содержащего 20 мМ HEPES и 12,5 нг/мл эпидермального фактора роста стимулирует наибольшую миграцию. Оптимальными условиями для клеток Ref52 являются буфер Рингерса с 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 25 ng/mL тромбоцитов, полученных фактором роста.

3. Приготовление стеклянного микропипетта: пипетка и ковка

  1. Потяните 100 мм длинные борозиликатные стеклянные микропипеты с 1,0 мм экстерьером и диаметром 0,58 мм в двухэтапном процессе, чтобы получить конус более 2 мм, который уменьшает до 50 мкм в первом миллиметре и распространяется на длинную, параллельную трубку диаметром 10 мкм в последнем миллиметре.
  2. Нагрузка вытащила трубу в микрокузе. Форма pipet иметь 15 мкм тупой кончик, который заключен в самом конце 250 мкм раздел согнуты под углом 35 "от остальной части трубы. Ориентировозавательный диаметр на изгибе должен быть около 30 мкм, чтобы придать прочность кончику.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тапэр и наконечник размеры могут быть скорректированы должным образом применять желаемую силу (см. шаг 5). Тяговая микропипетты при 65 градусах по Цельсию для первой ступени на 3 мм, а 60 градусов по Цельсию для второго шага производит размеры, описанные в шаге 3.1. Результаты с использованием различных трубчатых вытягивающих может варьироваться.
  3. Стерилизовать микропипетты в 70% этанола перед использованием.

4. Позиционирование микроманипулятора и микропипетика

  1. Снимите крышку тарелки и загрузите блюдо на сцену микроскопа и центр. Используйте цель 10X или аналогично низкого увеличения. Обложка средств массовой информации с минеральным маслом для предотвращения испарения средств массовой информации.
  2. Вставка вытащил труба
    1. Вставьте вытащил пипетку в оболочку micropipette, указывая крючок вниз к блюду. Кончик крючка будет самой низкой точкой при понижении в гель.
    2. Вставьте оболочку в микроманипулятор и отрегулируйте до тех пор, пока кончик трубы не будет сосредоточен над объективным объективом в обоих направлениях X и Y.
    3. Опустите трубку с помощью грубого манипулятора, пока он не коснется поверхности жидкости.
  3. Используя фазовый контраст или яркое поле, сфокусируйте микроскоп на бисовидном слое в верхней части геля. Это будет эталонный план.
  4. Обеспечение того, чтобы цель не находится в опасности попадания образца или стадии, привлечь внимание выше геля, чтобы найти кончик микропайпета, используя небольшие корректировки грубого манипулятора в X и Y направлениях, чтобы бросить тени на фокусной плоскости. Только опустите микропипетт, когда уверены, что сам кончик трубы находится в поле зрения.
  5. Убедитесь, что притупоротный кончик микропайпета указывает вниз, вращая трубу в оболочке или вращая оболочку в микроманипуляторе до тех пор, пока кончик не будет перпендикулярно фокусной плоскости. Повторите шаги 4.4 и 4.5 по мере необходимости. Сосредоточьтесь на кончике трубы.
  6. Фокус обратно вниз к верхней бисовой слой геля, чтобы оценить, как далеко pipet от поверхности геля. Сосредоточьтесь обратно к плоскости, которая является частью пути между гелем и кончиком трубы. Медленно опустите трубку, чтобы достичь промежуточной фокусной плоскости.
  7. Повторите шаг 4.6 до очень слабых теней от кончика микропипетты можно оценить при фокусировке на гидрогеле. Увеличьте к следующему самому высокому увеличению.
  8. Нижняя микроманипулятор до тех пор, пока тени и преломления самого кончика микропипетты могут быть оценены в фокусной плоскости бисомного слоя.
  9. Увеличьте увеличение до того, что будет использоваться в эксперименте. Опустите трубку, пока она не зависнет чуть выше поверхности гидрогеля.

5. Калибровка микроманипулятора и генерации силы

  1. В фазе или ярком поле опустите парящий микропипет, чтобы коснуться поверхности гидрогеля. Наблюдайте, как пипетка смотрит на контакт с гидрогелем. Продолжайте снижать микропипетты в Кдо до тех пор, пока корректировки в X и Y не вызывают потянув и отклонение гидрогеля в этих направлениях. Используйте микросферы или близлежащие клетки в качестве фидуциарных знаков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроманипулятор прикреплен к руке конденсатора фазы или скамейке, а не самой стадии образца, всегда отключите гель перед перемещением стадии, чтобы избежать нарушения трубы или тревожных клеток. Если труба ломается, вернитесь к шагу 3 и шагу 4.
  2. Найти область, лишенную клеток, чтобы заниматься гель. Потяните его во всех направлениях и получить комфортно с тем, как микроманипуляция переводится как деформация геля.
  3. Возьмите флуоресцентные изображения бисочного поля без манипуляций, с пайпета привлечения гель, и с участием трубки потянув гель. Повторите это несколько раз принимая хорошие заметки в отношении тиковых знаков на микроманипуляторе, как наконечник трубы выглядит в фазе или яркое поле на каждом этапе потянув, и расстояние кончик движется, используя эту манипуляцию.
  4. Используйте ImageJ, как ранее описано16,17 для расчета относительных смещений бисера и силы, применяемой к бисеру, сравнивая поле из шарика с полем из бисера без участия в пипете, бисерное поле с гелем, и вытащил гель.
  5. Чтобы настроить натяжной стимул, сравните применение силы, используя различные размеры наконечника микропайпета, расстояния от клетки или расстояние, вытягиванное микроманипулятором с начальной точки приземления. Влияние размера наконечника микропайпета на силовое применение дает большую гибкость пользователю, но также демонстрирует необходимость создания силовых карт для новых микропайпетов, даже если размеры и форма очень напоминают ранее откалиброванные советы.

6. Проведение проверки durotaxis

  1. Перед проведением эксперимента нарисуйте втягивание геля возле клетки и наблюдайте деформацию клетки при перемещении микроманипулятора.
  2. Мониторинг группы клеток, которые имеют явную полярность и, как представляется, движущихся в течение 30 минут, чтобы определить клетки, которые движутся в направленной манере.
  3. Выберите ячейку, которая движется в одном, ясном направлении и следите за ней с желаемой частотой кадров в течение дополнительных 30 минут.
  4. Если определение сил, оказываемых на ячейку или напряжение, оказываемое ячейкой желательно, захват бисполевидной изображения при каждом приобретении. Если клетка изменяет свое направление во время мониторинга, выберите другую ячейку для мониторинга, так как это затруднит определение эффекта стимуляции.
  5. Завьяйте гидрогель примерно в 50 мкм от клетки. Расположите трубу перед ближней стороной переднего края и переместите микроманипулятор таким образом, чтобы гель деформировался ортопедически в направлении движения клетки. Наблюдайте клетку над временем по мере того как она реагирует к акутовому, местному градиенту жесткости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки, предусмотренные здесь, эффективны при мониторинге SKOV3 или Fibroblasts Ref52, однако интервал и общий курс времени должны быть скорректированы в соответствии с типом клеток и наблюдаемым биологическим событием. При спаривании с флуоресценцией микроскопии, приостановить флуоресцентное приобретение непосредственно перед шагом 6.5., использовать фазовый контраст или яркое поле для расположения микропайпетта и тянуть, и перезапустить флуоресцентные приобретения сразу после.
  6. Если труба скользит или если градиент иным образом расслаблен или освобожден, найдите новую ячейку, повторяя шаги 6.2 и 6.3.

7. Определение дуротаксической миграционной реакции

  1. Используя ImageJ19 или другую программу анализа изображений, вычислить угол поворота, нарисовав линию между серединой переднего края ячейки на 0 мин и 30 мин пост-монитор (отражающий первоначальную траекторию ячейки) и другой линией между серединой передний край незадолго до и 80 минут после стимуляции и измерения угла между этими двумя линиями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При подготовке микропипетты(Рисунок 1) и нормализации генерации силы тянет (Рисунок 2 и Рисунок3 ), как описано выше, оптимальные durotactic условия были определены для нескольких клеточных линий. Используя этот метод, как указано на рисунке 4, как SKOV-3 раковых клеток яичников17 и Ref52 крысы эмбриональных фибробластов (Рисунок5) двигаться в направ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь демонстрируется повторяемый одноклеточный durotaxis тест, который позволяет оценить способность клетки изменять свое миграционное поведение в ответ на острые механические сигналы. Этот метод также может быть использован в сочетании с флуоресценционной микроскопией и соответствующими белками синтеза или биосенсорами для изучения субклеточной сигнализации и цитоскелетных событий в течение нескольких секунд механической стимуляции или в течение более длительного срока в течение дюротаксическому движению. Понимание отн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акриламид 40 % Национальная диагностикаЕС-810
Персульфат аммония FisherBP179-25
BD20A Высокочастотный генераторElectro Technic Products12011A115 В -  Портативная коронная палочка
для связывания силана (y-метакрилоксипропилтриметоксисилана) (Sigma AldrichM6514
бис-акриламид 2% Национальная диагностикаEC-820
Капилляры из боросиликатного стеклаWorld Precision Instruments1B100-4
Branson 2510 Ультразвуковой очистительBransonicчастота 40 кГц
Грубый манипуляторNarshigeMC35A
DMEMCorning10-013-CV
DMEM без фенола красныйSigma AldrichD5030
Двухступенчатый стеклянный пуллер для микропипетокNarshigePC-10
Эпидермальный фактор ростаPeprotechAF-100-15
ЭтанолPharmco-aaper111000200
фетальной сывороткой крупного рогатого скота (квалифицированный один укол)GibcoA31606-02
Фибронектин EMD MilliporeFC010
Флуосферы карбоксилат 0,2 мкм ИнвитрогенF8810, F8807, F8811
Fugene 6Roche18150911,5 μ г ДНК / 6 & мкм; L fugene 6 на 35 мм тарелка
Ледяная уксусная кислотаFisher ChemicalA38SI-212
Тарелка со стеклянным дномCellVisD60-60-1.5-N
Стеклянный покровный слипЭлектронная микроскопия Sciences72224-0122 мм, #1.5
HClJT Baker9535-03
Hellmanex III  Специальный чистящий концентратSigma AldrichZ805939Используется в концентрации 2% в ddH2O для очистки покровных стекол
Порошок HEPESSigma AldrichH3375Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-ray 400 Закрытый УФ-прожекторUviton InternationalUV0338
ИзопропанолFisher ChemicalA417-4
MicroforgeМикроманипулятор NarshigeMF900
Минеральное масло NarshigeMHW3
Минеральное маслоSigma AldrichM5904
Nanopure Life Science UV/UF системаBarnsteadD11931ddH2O
Nikon Eclipse TiNikon
OptiMEMInvitrogen31985062
Parafilm MBemis Company, IncPM-992
PBS139 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 28,6 мМ Na2HPO4, 1,6 мМ KH2PO4, pH 7,4
Тромбоцитарный фактор роста-BB (PDGF-BB)sigma AldrichP4056
Ref52Линия эмбриональных фибробластов крысы; Культура в DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer134 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 2,4 мМ CaCl2, 20 мМ HEPES, 5 мМ D-глюкоза, pH 7,4
SKOV-3Американская культурасбора культур типа в DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH Covachem  12414-1
Настольный плазменный очистительHarrick PlasmaPDC-32G
TEMED Сигма ОлдричТ9281-50

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
  2. Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  4. Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
  5. Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
  6. Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
  7. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  8. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  9. Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
  10. Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
  11. Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949(2015).
  12. Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
  13. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  14. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107(2012).
  15. Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
  16. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  17. McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228(2018).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  20. McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552(2011).
  21. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  22. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  23. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи