Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптическая очистка и визуализация иммуномаркированных тканей почек

10.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60002

⸱

22 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Сочетание маркировки антител, оптической очистки и передовой световой микроскопии позволяет трехмерный анализ полных структур или органов. Описанный здесь простой метод для объединения иммуномаркировки толстых ломтиков почек, оптическая очистка с этиловый циннамат, и конфокальная визуализация, которая позволяет визуализации и количественной оценки трехмерных структур почек.

Аннотация

Методы оптической очистки делают ткань прозрачной, уравновешись рефракционным индексом во всем образце для последующего трехмерного (3-D) изображения. Они получили большое внимание во всех областях исследований для потенциального анализа микроскопических многоклеточных структур, которые простираются на макроскопические расстояния. Учитывая, что почечные трубочки, сосуды, нервы и гломерули распространяются во многих направлениях, которые были лишь частично захвачены традиционными двумерными методами до сих пор, очистка тканей также открыла много новых областей исследований почек. Список методов оптической очистки быстро растет, но новичкам в этой области по-прежнему трудно выбрать наилучший метод для заданного исследовательского вопроса. При условии, здесь простой метод, который сочетает в себе антитела маркировки толстых ломтиков мыши почки; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином; и конфокальной визуализации. Этот протокол описывает, как пронзать почки и использовать антиген-поиск шаг для увеличения антитела-связывания, не требуя специализированного оборудования. Его применение представлено в визуализации различных многоклеточных структур в почках, и как устранить неполадки плохое проникновение антител в ткани рассматривается. Мы также обсуждаем потенциальные трудности визуализации эндогенных флюорофоров и приобретения очень больших образцов и как их преодолеть. Этот простой протокол обеспечивает простой в настройке и всеобъемлющий инструмент для изучения тканей в трех измерениях.

Введение

Растущий интерес к изучению целых органов или крупных многоклеточных структур привел к разработке методов оптической очистки, которые включают визуализацию прозрачной ткани в трех измерениях. До недавнего времени лучшими методами оценки количества клеток, длины или объема целых структур были стереология или исчерпывающее последовательное секционирование, которое основано на системной выборке ткани для последующего анализа в двух измерениях1, 2 , 3. Однако эти методы отнимают много времении нуждаются в высоком уровне подготовки и опыта 4. Методы оптической очистки преодолевают эти проблемы, уравновешивает рефракционный индекспо всему образцу, чтобы сделать ткани полупрозрачными для 3-D изображения 5,6,7.

Разработано несколько методов оптической очистки, которые подпадают под две основные категории: методы на основе растворителя и aqueous. Методы на основе aqueous можно далееразделить на простое погружение 8,9,гипергидратацию10,11и гидрогель встраивание12,13. Методы на основе растворов обезвоживают ткани, удаляют липиды и нормализуют рефракционный индекс до значения около 1,55. Ограничения большинства методов на основе растворителя являются уторение эндогенной флуоресценции широко используемых белков репортера, таких как GFP, токсичность растворителя, способность растворять клеи, используемые в некоторых камерах изображения или объективных линзах, и усадка тканей во время обезвоживание14,15,16,17,18,19,20,21. Тем не менее, методы на основе растворителя просты, экономичны по времени и могут работать в различных типах тканей.

Aqueous-основанные методы полагаются на погружении ткани в aqueous разрешения которые имеют рефракционные indicesв ряде 1.38-1.52 8,11,12,22,23,24 . Эти методы были разработаны для сохранения эндогенных флуоресцентных белков ырепортера и предотвращения усадки, вызванной обезвоживанием, но ограничения большинства вспомогательных методов очистки включают более длительную продолжительность протокола, расширение тканей и белковая модификация (т.е. частичная денатурация белков мочевиной в протоколах гипергидратации, таких как ScaleA2) 7,11,23,25. ScaleS обратился к расширению тканей путем объединения мочевины с сорбитол, который уравновешивает путем обезвоживания мочевины индуцированной ткани расширения, и сохранил ткани ультраструктуры, как оценивается электронной микроскопии10. Усадка или расширение тканей влияет на абсолютные размеры структур, расстояния между объектами или плотность клеток на объем; Таким образом, измерение изменений размера при очисткеткани может помочь интерпретировать полученные результаты 7,26.

В целом, протокол оптической очистки состоит из нескольких этапов, включая предварительную обработку, permeabilization, иммуномаркировку (при необходимости), соответствие рефракционного индекса и визуализацию с продвинутой световой микроскопией (например, двухфотон, confocal, или светлистой флуоресценции микроскопии). Большинство подходов к очистке были разработаны для визуализации нейронной ткани, и новые исследования подтвердили их применение в других органах5. Этот комплексный инструмент был ранее продемонстрирован, чтобы обеспечить надежный и эффективный анализ структур почек, в том числе glomeruli27,28, иммунные инфильтраты28, сосуды28, и тулупер сегментов 29, и это идеальный подход к лучшему пониманию гломерулярной функции и переделки трубок в области здоровья и болезней.

Обобщен здесь метод на основе растворителя, который сочетает в себе иммуностогирование почечных труб; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином (ECi); и конфокальная микроскопическая визуализация, которая позволяет полную визуализацию и количественную оценку труб. Этот метод прост, сочетает в себе антиген-извлечение ломтиков почек с окрашиванием коммерческих антител, и не требует специализированного оборудования, что делает его доступным для большинства лабораторий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Орегонского университета здравоохранения и науки, Портленд, Орегон, США, и соответствующими местными органами власти в Ахене, Германия.

1. Ретроградная брюшная аортальная перфузия и фиксация почек мыши

  1. Подготовьте решения в тот же день или вечер перед и хранить в холодильнике на ночь. Теплые растворы для комнатной температуры (RT) перед использованием.
  2. Сделать свежую партию 3% параформальдегида (PFA) в 1x фосфат-буферный солен (PBS). Около 50-100 мл PFA необходимо на мышь.
    1. Чтобы сделать 1 l 3% PFA: Взвесить 30 г PFA и добавить 800 мл дистиллированной воды в дым капот. Перемешать и нагреть до 50-60 градусов по Цельсию. Не нагревайте выше 70 градусов по Цельсию.
      ВНИМАНИЕ: ПФА является токсичным. Подготовка PFA в дым капот.
    2. Медленно добавьте несколько капель 2N NaOH. Подождите несколько минут, пока PFA идет в решение или добавить еще несколько капель. Некоторые мелкие куски не растворяются.
    3. Снимите раствор с огня. Добавьте 50 мл 20x PBS. Холод на льду для RT.
    4. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с HCl. Добавить дистиллированную воду до 1 л.
    5. Удалите любые нерастворенные частицы, фильтруя 1x PBS и 3% PFA с 0,22 мкм фильтра.
  3. Добавьте 1000 единиц гепарина в 1 l 1x PBS. Передача 1x PBS, содержащий гепарин и 3% PFA в 1x PBS в отдельные 50 мл пластиковых шприцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии насоса, управляемого давлением, установленного на уровне 80-100 мм рт. ст. или гидростатического давления (метод капельного пром., высота перфузийных растворов: 160-200 см над животным) можно использовать при перфузии почек.
  4. Подключите PBS, PFA и притупленный 21 G бабочка иглы на трехсторонний стоп-стоп. Убедитесь, что во всей системе нет пузырьков воздуха.
  5. Пометьте коническую трубку 15 мл и разделите в нее 10 мл PFA.
  6. Глубоко обезвищивает самца или самку c57BL/6 мыши 12-24 недель, используя 120 мг/кг кетамина для тела и 16 мг/кг ксилазина. Перед операцией необходимо проверить животное на полное отсутствие отзывчивости, защипыв аяк и рефлексы( например, ущипнуть.
  7. Как только животное достигло хирургической плоскости анестезии, поместите его на спину под рассекающимся микроскопом. Хирургически открыть брюшной полости с разрезом живота средней линии с помощью операционных ножниц и разоблачить брюшной аорты.
  8. Зажим брюшной аорты прямо над ветвящейся к подвздошной артерии с изогнутым гемостатом. Затем зажим брюшной аорты прямо под почечными артериями с микро серрефин. Сделайте небольшой разрез (1 мм) на брюшной аорте между двумя зажимами ножницами vannas. Вставьте иглу бабочки в разрез медленно и будьте осторожны, чтобы не рип брюшной аорты открытым.
  9. Свагите правую почечную артерию с 5-0 шелковым швом и удалите правую почку для другого анализа, если для перфузии и фиксации необходима только одна почка.
  10. Удалить микро серрефин, трансквировать вену портала с vannas ножницы, и сразу же пронзить с 50 мл PBS, содержащий гепарин, затем переключитьиск и пронзить с 50 мл 3% PFA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое давление перфузии через брюшную аорту требуется, чтобы открыть почечные трубки для лучшего диффузии антител через ткани. Перфузия через сердце не может открыть почечные трубки.
  11. Соберите пронизанные почки тщательно и избежать прокола или сжатия ткани.
  12. Удалить капсулу и разрезать почки на 1 мм толщиной корональных ломтиков. Используйте матрицу слайсера(Таблицаматериалов) для стандартизации толщины срезов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, рассмотреть возможность использования вибратом.
  13. Погрузите ломтики почек с подготовленным PFA в коническую трубку с маркировкой 15 мл.
  14. Распределите 10 мл PFA к другой помечены 15 мл конической трубки. Промыть трехсторонний стопкок и бабочка иглы с PBS перед переходом к следующей мыши.
  15. Провести пост-фиксации на ночь на RT защищены от света.

2. Подготовка тканей и иммуностоирование

  1. После пост-фиксации, мыть ломтик почки дважды с 1x мыть буфера (Таблица материалов) на 1 ч на горизонтальной рокер на RT.
  2. Выполните поиск антигена. Нагрейте 300 мл 1x антигена разоблачения раствора (T в состоянииматериалов) в 500 мл стакан атакжем до 92-98 градусов по Цельсию. Приложить ломтик в встраивая кассету проницаемой для нагретого буфера с перемешиванием в течение 1 ч при 92-98 градусах По Цельсию. Снимите стакан с огня и оставьте его для охлаждения RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые поставщики проверяют свои антитела для применения иммуногистохимии и включают в таблицу данных предлагаемый метод поиска антигена. Таким образом, некоторые эпитопы могут потребовать более базового буфера (например, pH 9).
  3. Передача ломтик в 10 мл 1x мыть буфер с 0,1% Тритон X-100 и рок на ночь на RT. Вымойте ломтики 2x с 10 мл свежего 1x мыть буфер адля 1 ч на следующий день.
  4. Разбавить первичные антитела в 500 л нормального разбавитель антитела(Таблица материалов). Начните с концентрации 1:50-1:100. Аккуратно покачать ломтик почки в разбавленных первичных антител в течение 4 d при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку каждое антитело обладает уникальными свойствами, температура при инкубации антител и разбавления холовства антитела должна быть оптимизирована для отдельных зондов. Для вторичного контроля только антитела, инкубировать ткани почек в разбавителе без первичных антител. Вместо коммерческих разбавителей антител, 1x PBS с 0,1% Тритон X-100 и 0,01% азида натрия может быть использован.
  5. Вымойте кусок почки в 10 мл 1x мыть буфер ананочь на RT с одной сменой мыть буфера после 8 ч.
  6. Разбавить вторичные антитела (например, 1:100 для Алекса Флюор-конъюгированных вторичных антител) в 500 л нормального разбавителя антител. Инкубировать кусочки почек в разбавленных вторичных антител в течение 4 дней при 37 градусах Цельсия. С этого шага и далее, защитить кусочки почек от света.
  7. Вымойте почки ломтиками в 10 мл 1x мыть буфер ананочь на RT с одной смены мытья буфера после 8 ч.

3. Очистка тканей

  1. Передача ломтика почки до 5 мл высококачественного 100% этанола(Таблицаматериалов) на 2 ч при RT с нежным раскачиванием (с одним изменением на свежий этанол после 1 ч). Этот шаг предназначен для обезвоживания тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокосортный этанол необходим для достижения высокой прозрачности тканей на следующем этапе. Метанол или тетрагидрофуран являются альтернативными реагентами обезвоживания с высоким потенциалом делипидации.
  2. Погрузите ломтик почки в 2 мл ECi(Таблица материалов) с нежным качания на RT (с одним изменением на свежий ECi после 2 ч) на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точка замерзания/плавления ECi составляет 6-8 градусов по Цельсию. Поэтому не храните образцы в холодильнике. Провести погружение в правильно вентилируемый дым капот и избежать прямого контакта с одеждой и кожей (ECi является нетоксичным пищевых продуктов и медикаментов утвержденных соединения, но имеет сильный запах). Используйте обычные трубки Eppendorf или стеклянные сосуды (без полистирола сосудов).
  3. Прозрачность тканей может быть достигнута после погружения ECi и когда кусочки почек будут готовы к визуализации.

4. ConfocalImaging и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации можно использовать другие методы микроскопии до тех пор, пока решение для сопоставления рефракционного индекса совместимо с объективным объективом. Этот протокол использует перевернутый конфокальный микроскоп.

  1. Добавьте 600-1000 л ECi в стеклянное нижнее блюдо(Таблицаматериалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования регулярных блюд клеточной культуры, потому что ECi является органическим растворителем, который растворит пластиковые блюда. Аналогичным образом, ECi может атаковать пластиковые детали/изоляционные кольца на объективных линзах. Обратитесь к соответствующим отчетам для обзора совместимых изображений блюд30 и самодельных 3-D печатных камер28.
  2. Перенесите полупрозрачный кусочек почки в блюдо. Поместите круглый покрывало на срез почки, чтобы применить легкое давление к стекольному дну. Печать блюдо с парафина пленки (Таблица материалов), чтобы избежать утечки ECi.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целые органы или несколько миллиметров толщиной ткани ломтиками может потребовать границы (зубной цемент или силиконовый эластомер; см. Таблица материалов) вокруг ткани, чтобы сделать ECi-бассейн для образца.
  3. Поместите блюдо на платформу визуализации микроскопа.
  4. Возьмите несколько z-стеков и выполните прошивание. Начните с z-шаг размером 5 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность использования длинных рабочих расстояний (5 мм) и высокочисленной диафрагмы (0,9) для визуализации очень толстых ломтиков или органов ткани. После визуализации, передать ткани обратно в этанол и хранить в мытье буфера или PBS с 0,02% азидея натрия.
  5. Проанализируйте изображение с помощью трех-D рендеринга с помощью программного обеспечения(Таблица материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Почки являются сложными органами, состоящими из 43 различных типов клеток31. Большинство из этих клеток образуют большие многоклеточные структуры, такие как гломерули и трубочки, и их функция в значительной степени зависит от взаимодействия друг с другом. Классические 2-D гистологические методы частично захватывают эти крупные структуры и могут пропустить фокусные изменения в нетронутых структурах31. Таким образом, трех-D анализ с использованием оптических методов очистки п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы оптической очистки получили широкое внимание для трехмерной визуализации и количественной оценки микроанатомии в различных органах. Здесь метод очистки на основе растворителя (ECi) сочетался с иммуномаркировкой для трех-D-изображения целых трубок в почках. Этот метод прост, недорог и быстр. Тем не менее, на другие исследовательские вопросы лучше всего ответить с другими клиринговыми протоколами5. Важно также иметь в виду, что методы на основе растворителя вызывают усадку тканей в переменных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Т. С. поддерживается грантами немецкого исследовательского фонда DFG (332853055), Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197) и медицинским факультетом RWTH Aachen (Программа RWTH Returner). V. G. P. поддерживается научными стипендиями от Deutsche Gesellschaft меха Nephrologie, Александр фон Гумбольдт Фонда, и Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии. D. H. E поддерживается Фондом LeDucq. Р. К. поддерживается грантами DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), штата СеверныйВестфалия (MIWF-NRW) и Междисциплинарного центра клинических исследований при Университете RWTH Aachen (O3-11).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m фильтрFisher Scientific09-761-112
15 мл коническая трубкаFisher Scientific339650
21 G иглабабочки BraunVenofix
3-х ходовой запорный кранFisher ScientificK420163-4503
программа для 3D-анализаBitplane AGIMARIS
3D-аналитикапрограмма Cellprofilerбесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом
5-0 шелковый шовный материалFine Science Tools18020-50
50 мл пластиковые шприцыFisher Scientific14-817-57
Моноклональное антитело Anti-BrdURoche11296736001
разбавитель антителDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
Раствор для извлечения антигена на основе цитратаVector LaboratoriesH-3300
Изогнутый гемостатFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Препарирующий микроскопMoticDSK-500
Встраиваемые кассетыCarl RothE478.1
ЭтанолMerck
ЭтилциннаматSigma-Aldrich112372
Гибкая пленка/Парапленка MSigma-AldrichP7793
Козий анти-AQP2Санта-Круз Биотехнологияsc-9882
Морская свинка анти-NKCC2Н/Д/ДDOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
ГепаринSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
Горизонтальное качалкаLabnetS2035-E
Чашка для визуализацииIbidi81218
КетаминMWI Animal Health501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Операционные ножницыMerit97-272
ПараформальдегидThermo Fischer ScientificO4042-500
Кролик антифошоThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Силиконовый эластомерWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
АзиднатрияSigma-AldrichS2002
СлайсерZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
ножницы VannasFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
КсилазинMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Ксилазин)
100983 Н

Ссылки

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916(2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Конфокальная визуализациявосстановление антигеновэтилциннаматмечение антителами3D-визуализацияпрозрачность тканейфлуоресцентные белкификсация параформальдегидом
Оптическая очистка и визуализация иммуномаркированных тканей почек
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.