Полевой посмертный бешенство Быстрый иммунохроматографический диагностический тест для ресурсно-ограниченных настроек с дальнейшим молекулярным применением

Краткое содержание

Мы представляем полный протокол для посмертной диагностики бешенства животных в полевых условиях с помощью быстрого иммунохроматографического диагностического теста (RIDT), от биопсии мозга выборки до окончательной интерпретации. Мы также описываем дальнейшие приложения с использованием устройства для молекулярного анализа и вирусного генотипирования.

Аннотация

Функциональные системы эпиднадзора за бешенством имеют решающее значение для предоставления надежных данных и повышения политической приверженности, необходимой для борьбы с болезнями. На сегодняшний день животные, подозреваемые в бешенстве-положительном, должны быть представлены на посмертное подтверждение с использованием классических или молекулярных лабораторных методов. Однако большинство эндемичных районов находятся в странах с низким и средним уровнем дохода, где диагностика бешенства животных ограничивается центральными ветеринарными лабораториями. Низкая доступность инфраструктуры эпиднадзора приводит к серьезному занижению данных о болезнях из отдаленных районов. Недавно было разработано несколько диагностических протоколов, требующих низкой технической экспертизы, что дает возможность установить диагностику бешенства в децентрализованных лабораториях. Мы представляем здесь полный протокол полевой посмертной диагностики бешенства животных с помощью быстрого иммунохроматографического диагностического теста (RIDT), от выборки биопсии мозга до окончательной интерпретации. Мы завершаем протокол, описывая дальнейшее использование устройства для молекулярного анализа и вирусного генотипирования. RIDT легко обнаруживает вирус бешенства и другие лиссавирусы в образцах мозга. Принцип таких тестов прост: материал мозга наносится на тест-полоску, где золотые конъюгированные антитела связываются специально с антигенами бешенства. Антиген-антитела комплексы связывают далее к фиксированным антителам на линии испытания, в результате чего четко видна фиолетовая линия. Вирус инактивируется в тест-полоске, но вирусная РНК может быть впоследствии извлечена. Это позволяет безопасно и легко отправляться в оборудованную лабораторию для подтверждения и молекулярного ввода пробов, а проема, а не образец инфекционного мозга. Основываясь на изменении протокола производителя, мы обнаружили повышенную чувствительность к тестам, достигающую 98% по сравнению с методом ссылки на золотой стандарт, прямым тестом на антитела к иммунофлуоресценции. Преимущества теста многочисленны: быстрая, простая в использовании, низкая стоимость и отсутствие требований к лабораторной инфраструктуре, такой как микроскопия или соответствие холодильных цепей. RIDTs представляют собой полезную альтернативу для областей, где справочные методы диагностики не доступны.

Введение

Собачье бешенство является основной причиной бешенства человека, во всем мире ответственность за около 59000 смертей человека в год, почти все происходят в странах с низким и средним уровнем дохода (LMICs) в Азии и Африке¹. Основным этиологическим агентом является нейротропический собачий вирус классического бешенства (RABV, семейство Rhabdoviridae, род лиссавирус,вид лиссавируса бешенства). Тем не менее, другие связанные с бешенством лиссавирусы, в основном циркулирующие в видах летучих мышей, также вызывают болезнь^2,3. В пострадавших регионах эпиднадзор за болезнями и борьба с ней часто затрудняются низкоуровневой политической приверженностью, вероятно, из-за отсутствия достоверных данных^4,,5,,6. Одной из причин занижения данных о болезнях является отсутствие лабораторной диагностики, отчасти из-за ограниченного доступа к оборудованным лабораториям и подготовленного персонала, а также трудностей с отгрузкой образцов. Лабораторная диагностика необходима для подтверждения случаев бешенства и дополнительно позволяет генетическую характеристику участвующих штаммов, обеспечивая понимание передачи вируса на региональном уровне^4,,5,,7.

Нынешние золотые стандарты для диагностики посмертного бешенства, одобренные Как Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (OIE), являются прямым тестом флуоресцентных антител (DFAT), прямым экспресс-тестом иммуногистохимии (DRIT) и молекулярными методами (например, обратная транскрипционная полимераза цепная реакция (RT-PCR))^4,8. Однако надлежащее применение в LMICs остается ограниченным из-за неадекватных лабораторных помещений с несовместимым энергоснабжением, неохлажденными образцами транспорта и отсутствием системы управления качеством. Поскольку диагностика бешенства животных, как правило, проводится только в центральных ветеринарных лабораториях в ЛПМХ, имеющиеся данные эпиднадзора в основном отражают ситуацию с бешенством в городских районах.

Недавно разработанные низкотехнологичную диагностические альтернативы предоставляют возможности для установления диагностики бешенства в отдаленных районах и децентрализованных лабораторий по бешенству^4,,8,,9. Быстрый иммунохроматографический диагностический тест (RIDT) является боковой тест потока на основе иммунохроматографии с использованием золота конъюгированных антител детектор и является очень перспективным бешенства диагностический инструмент^10,11,12,13. Принцип прост: после разбавления, мозг материал смешивается в при условии буфера, и несколько капель применяются на тест-полоске, где золото конъюгированных моноклональных антител связываются специально с антигенами бешенства, в основном нуклеопротеины(Рисунок 1). Антиген-антитела комплексы затем проходят боковой миграции потока, связывание на испытательной линии (T-line) к фиксированным антителам против антигенов бешенства, в результате чего четко видны фиолетовые линии. Оставшиеся золотые конъюгированные антитела, не привязанные к антигенам бешенства, продолжают мигрировать и фиксироваться в мембране с помощью дополнительных целевых антител, в результате чего четко видна фиолетовая линия управления (C-line).

Одношаговый, недорогой метод является быстрым, чрезвычайно простым и не требует дорогостоящего оборудования или специальных условий хранения. С изменением протокола производителя для устранения шага разбавления, почти все оборудование и реагенты, необходимые для выполнения теста, включены в комплект^14. Результат читается через 5-10 минут без микроскопа. Это является основным преимуществом перед тестом DFAT, который требует флуоресценции микроскопа и иммунофлуоресценции конъюгации, наряду с рефрижераторной транспортировки и хранения образцов. Даже тест DRIT, который может быть выполнен с помощью светового микроскопа, требует непрерывной холодной цепи для хранения антител к бешенству, которые также еще не доступны на коммерческой основе. По сравнению с ДРИТ, РИДТ не требует токсичных химических веществ, что является особым преимуществом в странах, где утилизация отходов плохо регулируется. Быстрый тест занимает меньше времени при гораздо более легкой интерпретации по сравнению с тестами золотого стандарта DFAT и DRIT. Это позволяет проводить тестирование на месте персоналом с ограниченным техническим опытом.

На основе этих тестовых свойств, быстрая диагностика подозреваемых животных в отдаленных районах становится возможным, облегчая осуществление постпознания профилактики (PEP) для подвергшихся воздействию людей как можно скорее. Кроме того, в дистанционной транспортировке образцов бешенства не требуется, что приводит к улучшению качества проб на момент тестирования. Тем не менее, результаты, полученные с тестами RIDT в настоящее время должны быть подтверждены с помощью эталонного диагностического теста, такого как DFAT или DRIT.

Были оценены методы RIDT для выявления РАБВ и других лиссавирусов. Одно из первых исследований было проведено корейскими исследователями в 2007^{году 10}. По сравнению с методом DFAT, в 51 образце животных и 4 изолятах RABV, RIDT показал чувствительность и специфичность 91,7% и 100%, соответственно. Эти результаты были позже подтверждены 110 образцами мозга животных из Кореи, с чувствительностью и специфичностью, по сравнению с DFAT, 95% и 98,9%, соответственно¹⁵. Совсем недавно, другие исследования оценили производительность этого RIDT с использованием вирусных изолятов и / или инфицированных образцов мозга из различных животных с различным географическим происхождением. Группа из 21 образцов, в том числе африканских RABV и других африканских лиссавирусов (duvenhage вирус (DUVV), Лагос летучая мышь вирус (LBV) и вирус Мокола (MOKV)), были успешно обнаружены, с чувствительностью 100% по сравнению с DFAT¹⁶. Аналогичная высокая чувствительность (96,5%) и специфичность (100%) значения были получены из панели из 115 образцов мозга из Эфиопии¹⁷. Другое исследование оценило европейские изоляты RABV, два других европейских лиссавируса (европейский лиссавирус летучих мышей типа 1 (EBLV-1) и тип 2 (EBLV-2)), и австралийский лиссавирус летучих мышей (ABLV)¹⁸. На основе анализа 172 образцов мозга животных, комплект RIDT имел 88,3% чувствительность и 100% специфичность по сравнению с DFAT, и три связанных с бешенством лиссавирусов были успешно обнаружены. В этом изучении, некоторые из ложных отрицательных результатов пришли от образцов мозга, сохраненных в буфере глицерола, предлагая что неправильное удаление глицерола повлияло на капиллярный поток или связывание антитела. Недавний анализ 43 клинических образцов австралийских летучих мышей подтвердил предыдущие результаты испытаний, с полным согласованием DFAT¹⁹. Два исследования были проведены в Индии с использованием RIDT на ограниченном количестве клинических образцов (11 и 34 образцов). По сравнению с DFAT, чувствительность была между 85,7% и 91,7% и специфичность была 100%^20,21. Другая оценка этого комплекта с использованием 80 образцов мозга животных из Африки, Европы и Ближнего Востока получила полное соответствие с DFAT для специфичности (100%) но более высокая чувствительность (96.9%) по сравнению с предыдущими исследованиями²². В недавнем межлабораторном сравнении этого RIDT, выполненного в 22 различных лабораториях с использованием панели из 10 образцов, общее соответствие составило 99,5%^23.

Только одно недавнее многоцентрическое исследование показало неудовлетворительную общую производительность RIDT²⁴. Были протестированы образцы из трех различных наборов данных, которые обеспечивали переменную чувствительность и значения специфичности по сравнению с DFAT. Например, чувствительность и специфичность, полученные с помощью первой панели (n'51) и второй панели (n'31) образцов экспериментальных инфицированных животных, все они были протестированы в лаборатории А, дали чувствительность 16% и 43%, соответственно, в то время как специфичность была 100% для обоих. И наоборот, результаты третьей панели (n'30) полевых клинических образцов, проанализированных лабораторией В, обеспечили полное соответствие с результатами DFAT, что было дополнительно почти полностью подтверждено лабораторией А (85% чувствительности и 100% специфичности). Вариант пакетов к пакету был предложен в качестве возможного объяснения колебания относительно низкой чувствительности с RIDT^24.

В то же время, другое исследование провело аналогичный процесс проверки выше описанного RIDT, с модификацией производителя рекомендовал протокол¹⁴. Предразбовывание шаг (1:10) в PBS был опущен во время подготовки материала мозга. Основываясь на этом более простом измененном протоколе, авторы получили чувствительность и специфичность 95,3% и 93,3%, соответственно, по сравнению с DFAT путем тестирования, в лабораторных условиях, набор данных 73 образцов мозга животных, естественно или экспериментально инфицированных различными штаммами RABV. В исследовании была представлена первая оценка этого RIDT в полевых условиях (Чад, Африка). В 48 клинических образцах мозга чувствительность и специфичность составляли 94,4% и 100% соответственно. Расхождения между DFAT и RIDT были вызваны ложными положительными результатами с DFAT, определяемыми после подтверждения RT-PCR. Когда эти результаты были удалены, было полное соответствие, и это показало, что RIDT был более надежным, что DFAT в этих условиях^{поля 14}. С помощью измененного протокола не наблюдалось вариаций между партиями и пакетами. Когда измененный протокол был применен к небольшому числу различных образцов DFAT/RIDT (n'8) в исследовании Eggerbauer et al.^24,все были найдены согласованными (100% чувствительность).

Другим важным преимуществом RIDT является вторичное использование для обнаружения вирусной РНК, зафиксированной на полосе с использованием молекулярных методов (таких как RT-PCR) и последующего генотипирования^14,24. После шага по извлечению, L'chenne и др.¹⁴ продемонстрировали вирусную РНК, зафиксированную на мембране устройства Anigen с использованием RT-PCR с чувствительностью 86,3% в панели из 51 образца (включая 18 образцов, протестированных и отправленных из Чада при температуре окружающей среды). Последующий генотипирование было возможно в 93% из 14 проверенных образцов. Секвенирование Сангером Ампликонов ПЦР длиной не менее 500 нуклеотидов. В дополнение к изолятам RABV, тест обнаружил четыре других вида лиссавируса, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 и Лиссавирус летучей мыши Bokeloh (BBLV), во время полностью согласованного международного межлабораторного теста¹⁴. Чувствительность обнаружения вирусной РНК была еще выше (100%) в исследовании Eggerbauer и др., на основе лабораторных образцов экспертизы²⁴. Последнее исследование также показало, что буфер, используемый в комплекте RIDT инактивированного вируса. Таким образом, устройства могут быть отправлены легко, при температуре окружающей среды без конкретных мер предосторожности биобезопасности для справочных лабораторий, для молекулярного подтверждения и генотипирования.

Основываясь на предыдущих оценках, инструменты RIDT предлагают многочисленные преимущества для использования в полевых условиях, особенно когда методы эталонной диагностики отсутствуют. Тем не менее, этот тест также имеет некоторые ограничения, в частности, низкая чувствительность обнаружения антигена^14,24. Тест применим для образцов, содержащих большое количество вирусных антигенов, таких как образцы мозга. Тем не менее, это не подходит для других образцов, таких как слюна или другие жидкости организма. Другим недостатком является стоимость устройства (около 5-10 евро в Европе), которая дешевле по сравнению со стоимостью выполнения DFAT, RT-PCR или DRIT, но которая по-прежнему остается высокой для LMICs. Однако дальнейшее развитие и проверка аналогичных РИДТ от других компаний может привести к снижению цен. В одном исследовании сообщалось о вариациях пакетов к пакету. Хотя о ней не сообщают другие, строгий контроль качества, тем не менее, должен быть выполнен при тестировании новой партии, как и для любого реагента, используемого в среде управления качеством. Использование измененного протокола не было изменено при использовании различных партий^14. Все, кроме одного исследования, показали, что чувствительность RDIT была высокой по сравнению с DFAT (около 90%-95%). Поскольку бешенство всегда приводит к летальному исходу, по-прежнему настоятельно рекомендуется подтвердить любые отрицательные результаты с ПОМОЩЬЮ эталонного диагностического теста, такого как DFAT, DRIT или RT-PCR^14.

В этой рукописи мы представляем полный протокол полевой посмертной диагностики бешенства животных на основе примера коммерциализированного RIDT, от сбора образцов мозга до применения измененного протокола по сравнению с рекомендациями производителя (которые ранее были проверены¹⁴⁾и последующего молекулярного анализа. Этот протокол неоднократно применялся и подтверждался в полевых условиях в Западной и Центральной Африке, где RIDT регулярно использовался для диагностики бешенства наряду с тестом DFAT. Кроме того, мы демонстрируем второе приложение для устройства, в лабораторных условиях, для извлечения и обнаружения с помощью RT-PCR вирусной РНК, закрепленной на устройстве.

Протокол

1. Сбор образцов через форамен магнум (затылчный маршрут)²⁵

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод может быть реализован в лабораторных условиях или в полевых условиях. Образцы должны быть обработаны как можно скорее после смерти подозреваемого животного или храниться при прохладной температуре (по возможности в холодильнике или заморозке), чтобы избежать разложения, которое может повлиять на результаты. Как и другие методы отсчета, основанные на обнаружении лиссавирусных антигенов, таких как DFAT и DRIT, разложившиеся образцы не должны быть проверены, поскольку это может повлиять на результат (риск ложного отрицательного результата).

ВНИМАНИЕ: Все образцы следует рассматривать как потенциально инфекционные. Правила безопасности и процедуры должны строго соблюдаться, даже в полевых условиях^4. В частности, носите соответствующее средства индивидуальной защиты, включая маску, очки, перчатки и лабораторное пальто. Используйте соответствующие дезинфицирующие средства для обеззараживания материалов и образцов (например, гипохлорит натрия с рекомендуемыми разбавлениями производителя, 70% спирта - этанол или изопропанол, 1% мыльный раствор). Весь персонал, обрабатый образцы, должен быть вакцинирован против бешенства.

1. Удалите голову животного ножом перед первым шейным позвонком (атласным позвонком), чтобы получить доступ к форамен магнуму.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму инфекционный аэрозоль, избегайте использования ручной пилы или аналогичного инструмента.
2. Соберите ствол мозга (медулла продолговата) образец с использованием одноразового пластикового пипетка (Рисунок 2A), питьевой соломы (Рисунок 2B), зажим (Рисунок 2C) или капельницы (поставляется с RIDT) (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе образца необходимо уделить особое внимание, поскольку это крайне важный шаг для надежности результатов. В дополнение к связанному видео, которое показывает простым способом, как собрать часть ствола мозга интерес, учебный шаг настоятельно рекомендуется, чтобы убедиться, чтобы собрать правильный анатомический раздел.
3. Дополнительно и в дополнение к стволу мозга (медулла продолговата), собирать другие части ствола мозга или мозга (мозжечок, гиппокамп, таламус и кора) по той же затылочной маршрут, нажав и вращая пластиковые пипетки или соломы к глазнице(Рисунок 3).
4. При использовании соломы или пипетки аккуратно сожмите ее, чтобы депонировать образец мозга (0,5-2 г) в трубку для последующего анализа и/или биобанкинга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример хранения глицерол не рекомендуется, так как это, кажется, влияет на капиллярный поток или шаг связывания антител RIDT¹⁸.

2. Исполнение измененного протокола RIDT¹⁴

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модификация опускает шаг разбавления (1:10) в PBS, как указано в протоколе производителя (все версии), и может быть реализована в лабораторных или полевых настройках.

1. Используйте тампон/капельник, чтобы собрать эквивалент половины арахиса или гороха (0,1-0,5 г) материала мозга и поместить его в трубку буферного образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измененного протокола все реагенты/расходные материалы включены в комплект (не требуется PBS или дополнительная трубка)(рисунок 4). Документируйте номер пакета комплекта и проверяйте действительность срока годности.
2. Тщательно раздавить мозг материала непосредственно в трубке с тампоном или капельницы около 30 с до однородной подвески не будет получена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буферная реакция инактивирует инфекциву вируса в условиях протокола^{производителя 24.}
3. Используя капельку, внести четыре капли (примерно 100 мл) подвески в вход образца на испытательном устройстве.
4. Дождитесь полной миграции выборки (1-5 мин) перед чтением тестового устройства. Миграция должна начаться быстро после внесения образца (1-5 мин).
5. В случае задержки (из-за высокой вязкости подвески) или для ускорения начала миграции, аккуратно поцарапайте дно места депозита устройства капелькой (1-5 раз) и в итоге добавьте еще 1-2 капли. Миграция должна начаться сразу после этого.
6. Прочитайте результат теста в окне обнаружения через 5-10 мин и не более 20 мин после окончания миграции.
7. Интерпретировать результат на основе наличия или отсутствия линии управления (C-line) и тестовой линии (T-line) (фиолетовые линии) в окне обнаружения, согласно рисунку 5. Рассмотрим пример положительный, когда две линии видны (Рисунок 5A), отрицательный, если только C-линия присутствует(рисунок 5B) и недействительными, если только T-линия присутствует или если нет линий видны (Рисунок 5C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Недействительные результаты должны быть повторены по крайней мере один раз. Другие методы должны быть выполнены, если результаты остаются недействительными. Отрицательные результаты, полученные с ПОМОЩЬЮ RIDT, должны быть впоследствии подтверждены с помощью метода ссылки золотого стандарта, такого как DFAT, DRIT и молекулярные методы (полимеразная цепная реакция или ПЦР). Несмотря на то, что чувствительность этого теста высока (см. репрезентативные результаты), она не составляет 100%.
8. Храните использованные устройства при комнатной температуре или храните в холодильнике/заморозке, когда это возможно, для последующего молекулярного анализа (см. раздел 4). Заморозить оставшуюся суспензию образца при -20 градусов по Цельсию/-80 градусов в буферной трубке, чтобы повторить тест, если это необходимо, или для последующего молекулярного анализа.

3. извлечение и обнаружение РНК РТ-qPCR с устройства RIDT

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть реализован только в лабораторных условиях с адаптированной средой и подходящим оборудованием для молекулярной диагностики. Это может быть сделано вскоре после теста RIDT или ретроспективно на архивных устройствах RIDT, хранящихся при комнатной температуре (15-30 градусов по Цельсию), охлажденных или замороженных.

1. Добыча РНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга шага экстракции рекомендуется использовать внутренний контроль, который может быть эндогенной мРНК (например, экзогенный контроль (например, синтетическая РНК eGFP) непосредственно шипами в образец во время первых шагов извлечения^26,27.
   1. Аккуратно откройте устройство и удалите фильтровальную бумагу.
   2. Вырезать площадь депозита образца и поместить его в трубку, содержащую 1 мл Tri-Реагент LS. Инкубировать на RT в течение 1 часа с нежным регулярным ручным возбуждением.
   3. Выполните добычу в соответствии с рекомендациями производителя, как описано ранее²⁷. На этом этапе может быть добавлен экзогенный внутренний контроль.
   4. В ходе процесса, добавить 2 МЛ гликогена для облегчения осадков РНК, в соответствии с рекомендациями производителя.
   5. Отрегулируйте окончательный объем для респенсации РНК в воде без нуклеазы, с объемом 50 МЛ, обычно используемым.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце шага центробежища для аквемного и органического разделения фазы (после добавления 200 мл хлороформа в Tri-Reagent LS), кусок мембраны от устройства будет находиться в нижней части трубки и не мешать сбору верхней аквеозной фазы. Кроме того, могут быть использованы другие простые и быстрые протоколы, например, с использованием реагентов на основе фенола и кремнеземных мембран^28.
2. Обнаружение по РТ-qPCR²⁶
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение потенциальной вирусной РНК, присутствующая в извлеченных образцах, может быть сделано с использованием различных молекулярных методов, таких как обратная транскрипция ПЦР, обычные (конечная точка) или в режиме реального времени PCR (qPCR). Несколько методов доступны, такие как обычные RT-PCR^27,29 или RT-qPCR^26,30 ориентации вирусного нуклеопротеина или гена полимеразы. Один из примеров будет представлен ниже на основе двойного комбинированного пан-лиссавируса RT-qPCR, ориентированного на консервированный регион среди вирусной полимеразы. Эта техника RT-qPCR ассоциирует два различных RT-qPCR: одна основана на технологии зонда TaqMan (pan-RABV RT-qPCR), а другая с использованием обнаружения SyBR Green (pan-lyssa RT-qPCR). Кроме того, обнаружение экзогенного внутреннего контроля (eGFP RNA), непосредственно шипами в процессе экстракции, осуществляется конкретным зондом TaqMan на основе RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Тщательная проверка на месте молекулярных методов, отобранных для обнаружения вирусной РНК, важна, в частности, для проверки того, что грунтовки и зонды для RT-PCR в режиме реального времени адаптированы для обнаружения штаммов, циркулирующих в регионе^{интереса 4.}
   1. Разбавить образец РНК до 1:10 в нуклеазе свободной воды. Проверьте каждый образец РНК в дубликате, используя 96-ну реакционные пластины или другие форматы. Используйте положительные и отрицательные элементы управления для каждого анализа и проверьте по крайней мере в дубликате.
   2. Подготовьте решение реакции мастер-микса для трех различных анализов RT-qPCR в соответствии со таблицей 1,а также с праймерами/зондами, указанными в таблице 2.
   3. Добавьте 5 мл разбавленных образцов РНК и 15 мл мастер-микса к каждому из трех различных анализов. Пан-RABV RT-qPCR анализ и eGFP RT-qPCR анализ может цикл в той же пластине.
   4. Выполнить различные анализы после термальных условий велосипедного, указанных в таблице 3. Если доступен только один тепловой циклер ПЦР, начните с пан-RABV RT-qPCR и сохраните пластину для пан-лисса РТ-qККРР при 4 градусов по Цельсию до конца пан-RABV RT-qPCR.
   5. Проанализируйте результаты, полученные с помощью трех анализов, согласно таблице 4.

4. Генотипирование после извлечения РНК из устройства RIDT

1. Обратная транскрипция RT^27,29
   1. Подготовьте мастер-микс с 6 мл РНК, 2 л PD(N)6 случайных грунтовок (200 мкг/л) и 2 мл нуклеазной воды для окончательного объема 10 мл.
   2. Насбись при температуре 65 градусов в течение 10 минут в тепловом блоке, а затем хранить на льду.
   3. Подготовьте мастер-микс с 6 мл 5x First-Strand Buffer, 2 л 0,1 М дитиотрейтол (DTT), 1 л (200 U) обратной транскриптазы Superscript II, 2 л (80 U) RNasin, 2 л смеси DNTP (10 МЛ) и в комплекте с нуклеазой свободной водой, чтобы получить окончательный объем 20 мл для каждого образца.
   4. Добавьте мастер-микс (20 мл) в образец (10 мл) (окончательный объем 30 мл) и инкубировать при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 90 мин в тепловом блоке.
   5. Переход к следующему шагу с усилением ПЦР или хранить cDNA при -20 градусов по Цельсию.
2. Обычные ПЦР^27,29,31
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные методы обычных ПЦР доступны для генотипирования. Два представлены, как геми-гнездом ПЦР, ориентации часть нуклеопротеина или часть вирусного белка лиссавируса. Протокол одинаков для каждого из этих анализов, за исключением грунтовок и условий езды на велосипеде. Положительные (положительные РНК) и отрицательные (отрицательные кДНК и/или нуклеазные водные ресурсы) должны быть включены в каждую серию и каждый раунд ПЦР.
   1. Подготовьте к каждому образцу в микротрубке 0,2 мл решение для реакции мастер-микс для первого шага ПЦР. Эта смесь содержит 5 мл 10x NH4 Реакция буфера, 2,5 л раствора MgCl₂ (50 мл), 1 мл dNTP Mix (10 МЛ), 1 л каждой грунтовки (10 мл), 0,2 мл (1 U) полимеразы Biotaq DNA и 37,3 л нуклеазной воды (окончательный объем 48 л). Праймеры указаны в таблице 5.
   2. Добавьте 2 л кДНА в каждую трубку и цикл на отдельном обычном тепловом цикле ПЦР для каждого анализа, согласно таблице 6.
   3. Подготовьте второй мастер смесь реакции решение идентично предыдущему с использованием соответствующих грунтовки (Таблица 5) для геми-гнездом ПЦР реакции.
   4. Добавьте 2 л первого раунда продукта PCR и цикл на обычном тепловом цикле ПЦР, используя велосипедные параметры, указанные в таблице 6.
   5. Визуализируйте различные продукты ПЦР (первый и второй раунд ПЦР) после загрузки их на 1% агарозный гель (100 мЛ Трис-ацетат EDTA буфер 1x - TAE 1x) с бромидом этидия (окончательная концентрация около 0,01%) и запустить гель в течение 30 минут при 120 В. Положительный результат ПЦР наблюдается в виде яркой полосы ожидаемого размера(Таблица 5).
3. Секвенирование Сэнгера
   1. Выполните секвенирование секвенирования ампликонов, полученных с помощью пан-лиссавируса геми-гнездом ПЦР, и заполните анализ генотипирования.

Результаты

Как и в случае с любым диагностическим методом, сбор образцов имеет первостепенное значение для надежности результатов, особенно при выполнении в полевых условиях. Процесс сбора должен быть максимально простым, чтобы гарантировать сбор высококачественных образцов. Сбор биопсии мозга (ствол с продолговатой медулой) по маршруту foramen magnum для посмертной диагностики бешенства животных выполняет это требование, как указано на рисунке 2A-D²⁵.

После сбора образец мозга подается в измененный протокол RIDT, обобщенный на рисунке 6. Как указано в разделе Протокол, основной адаптацией от производителя при условии, протокол является упущение шага разбавления в PBS, который упрощает процедуру и необходимые расходные материалы / реагенты, таким образом, все включены в комплект (Рисунок 4).

Этот измененный протокол был внедрен и оценен в пяти различных лабораториях, включая один совместный центр ВОЗ по бешенству (Lab 1, Франция), один справочный центр ФАО по бешенству (Lab 5, Италия) и три эталонные лаборатории, расположенные в энзоотических африканских странах, Чаде (Лаборатория 2), Кот-д'Ивуаре (Lab 3) и Мали (Lab 4). В Чаде оценка РИДТ проводилась как в лабораторных, так и на местах.

По сравнению с эталонным методом DFAT, чувствительность и специфичность RDIT были высоки для всех лабораторий, с 96% до 100% и 93,7% до 100%, соответственно(таблица 7). Самая низкая чувствительность и специфичность RDIT была получена для лаборатории 1 (Франция) во время лабораторной проверки. На основе совокупного количества проверенных образцов (n-162)(дополнительная таблица 1),общая чувствительность и специфичность по сравнению с DFAT составили 98,2% и 95,8%, соответственно(таблица 7). Однако эти предварительные, но многообещающие результаты были получены на ограниченном наборе выборочных данных и должны быть дополнительно подтверждены на большом количестве положительных и отрицательных проб, особенно для тех, которые были протестированы в энзоотических районах, чтобы избежать любой потенциальной недооценки или предвзятости из-за нынешних неоднородных наборов данных.

Тест RIDT подходит для обнаружения лиссавируса в биопсии мозга у инфицированных животных, где уровень лиссавирусных антигенов имеет важное значение. Тем не менее, тестовый предел обнаружения остается высоким при тестировании суспензии вируса(таблица 8; Рисунок 7).

Таблица 9 (из L'chenne 2016¹⁴) показывает пример результатов, полученных после обнаружения РНК двойным комбинированным пан-лиссавирусом RT-qPCR, нацеленным на вирусную полимеразу лиссавируса. Была протестирована группа из 51 положительного RIDT-теста, проведенного в лабораторных условиях (Lab 1, n-32) или в Чаде (Lab 2, n-19), а затем отправленная при температуре окружающей среды в Лабораторию 1. Положительное обнаружение было получено для 18 (94.7%), 26 (81.2%) и 44 (86,3%) образцы из лаборатории 1, лаборатории 2 и двух комбинированных, соответственно. Кроме того, генотипирование было выполнено для 14 из этих образцов (10 из лаборатории 1 и 4 из лаборатории 2) с использованием геми-гнездой ПЦР ориентации частичного гена нуклеопротеина и был успешным для 13 из них (93%) (из Лехенн и др. 2016¹⁴).

Рисунок 1: Схемаическое представление структуры RIDT для диагностики бешенства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Примеры быстрых простых методов сбора образцов мозга (ствол мозга с продолговатой медуллы) у животных (собака показана здесь) через затылочной фораменов в полевых условиях (Мали). () Коллекцияс одноразовой пластиковой пипеткой (B) Коллекция с пластиковой питьевой соломы(C) Коллекция с зажимом (D) Коллекция с удалением капельницы, представленной в комплекте RIDT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Продольная анатомическая секция головы собаки, показывающая различные части мозга (ствол мозга, мозжечок, гиппокамп, таламус и кора) собраны при нажатии, в вращательном движении, одноразовый пластиковый пипетка через затылочной форамен маршрут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Описание содержимого комплекта RIDT, включая устройство, одноразовую пластиковую капельку, одноразовый мазок и дилюентное анализ. Трубка, в которой будет собран и сохранен образец, не предоставляется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Результаты представительства для интерпретации Anigen RIDT. (A) Положительные результаты (видимое наличие двух линий, C-line и T-line) (B) Отрицательные результаты (видимое присутствие только C-line)(C) Недействительные результаты (отсутствие видимой C-линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: Схемаическое представление протокола RIDT, адаптированное из инструкций производителя. ( A )Модифицированнаяверсия протокола, с удалением шага разбавления, рекомендованного производителем(B) Первоначальный протокол, рекомендованный производителем, с предварительным шагом разбавления 1:10 в PBS образцов мозга. Шаги, удаленные в модифицированной версии протокола (представленной на рисунке 6A),указаны красной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: Пример определения предела обнаружения RIDT¹⁴. Было использовано серийное 10:1 разбавление титрованного вируса бешенства штамма 9704ARG. Количество вируса, депонируемого на каждом устройстве, указывается в ФФУ (флуоресцентные фокус-формирующие единицы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Пан-RABV РТ-qPCR анализ
Реагента	ЗЛ/Реакция
2X Reaction Mix (буфер, содержащий 0,4 мМ каждого dNTP и 6 мМ MgSO4)	10
Нуклеазная бесплатная вода	1.5
Taq3long (Вперед)	1
Так17ревлонг (Обратное)	1
РАБВ4 (10 м)	0.3
РАБВ5 (10 м)	0.3
MgSO4 (предоставлено в комплекте)	0.25
СПРАВКа ROX (25 МК) (предоставлена в комплекте)	0.05
Рнасин (40U/L) (Промега)	0.2
Суперскриптор III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Итого за реакцию	15
eGFP RT-qPCR анализ
Реагента	ЗЛ/Реакция
2X Reaction Mix (буфер, содержащий 0,4 мМ каждого dNTP и 6 мМ MgSO4)	10
Нуклеазная бесплатная вода	2.8
EGFP1F (Вперед)	0.5
EGFP2R (Обратное)	0.5
EGFP зонд (10 М)	0.3
MgSO4 (предоставлено в комплекте)	0.25
СПРАВКа ROX (25 МК) (предоставлена в комплекте)	0.05
Рнасин (40U/L) (Промега)	0.2
Суперскриптор III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Итого за реакцию	15
Пан-лисса RT-qPCR анализ
Реагента	ЗЛ/Реакция
2x SYBR Зеленая реакция Mix	10
Нуклеазная бесплатная вода	2.1
Taq5long (Вперед)	1
Так16ревлонг (Обратное)	1
MgSO4 (предоставлено в комплекте)	0.25
Справка ROX (25 МК)	0.05
Рнасин (40U/L) (Промега)	0.2
Суперскриптор III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Итого за реакцию	15

Таблица 1: Описание решения реакции мастер-микса для трех различных анализов RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR и eGFP RT-qPCR).

Анализ RT-qPCR	Имя	Тип	Длина	Последовательность (5'-3')	Смысле	Позиции
общерабочат РТ-qPCR анализ	Так3лонг	Грунтовка	22	ATG АГА АГТ ГГА АйЯ АЙК ОК А	S	7273-7294a
	Так17ревлонг	Грунтовка	25	GAT CTG TCT GAA TAA ТЕГ AYC АВТОМОБИЛЬ G	Как	7390-7414a
	РАБВ4	Зонд (FAM/TAMRA)	29	AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC	Как	7314-7342a
	РАБВ5	Зонд (FAM/TAMRA)	32	AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA	S	7353-7384a
Пан-лисса RT-qPCR анализ	Так5лонг	Грунтовка	23	ТАТ КЛЯП ААА ТГГ ААК ААЙ КЕЙ КАИ КА	S	7272-7294a
	Так16ревлонг	Грунтовка	25	GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C	Как	7366-7390a
eGFP RT-qPCR анализ	EGFP1F	Грунтовка	20	GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC	S	637-656b
	EGFP2R	Грунтовка	19	ГАА CTC CAG CAG GAC Cat G	Как	768-750b
	ЭГФФ	Зонд (FAM/TAMRA)	22	AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A	S	703-724b

Таблица 2: Описание грунтовок/зондов для трех различных анализов RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR и eGFP RT-qPCR). ^а Согласно последовательности генома вируса Пастера (PV) RABV (номер присоединения GenBank M13215). ^б По последовательности клонирования pEGFP-1 (номер присоединения ГенБанка U55761).

Пан-РАБВ РТ-qПКР и eGFP РТ-qPCR анализы
Шаг	Цикл	Temp	Время	Сбор данных
Обратная транскрипция	1	45 КК	15 мин.
Инактивация/начальная денатурация RT	1	95 кк С	3 мин.
Усиления	40	95 кк С	15 с
		61 кк С	1 мин.	Конечная точка
Пан-лисса RT-qPCR анализ
Шаг	Цикл	Temp	Время	Сбор данных
Обратная транскрипция	1	45 КК	15 мин.
Инактивация/начальная денатурация RT	1	95 кк С	3 мин.
Усиления	40	95 кк С	15 с
		55 градусов по Цельсию	1 мин.	Конечная точка
Кривая диссоциации	1	95 кк С	15 с	Увеличьте 0,1 С/с, 55–95 градусов по Цельсию
		55 градусов по Цельсию	1 мин.
		95 кк С	15 с
		55 градусов по Цельсию	15 с

Таблица 3: Описание условий теплового цикла для трех различных анализов RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR и eGFP RT-qPCR).

Анализа	Анализа	Результаты	Интерпретации
eGFP РТ-qPCR	C в интервале принятия	Извлечение проверено	Анализ других анализов может быть сделано
	Сз из интервала принятия	Извлечение не подтверждено	Перепроверить образец (повторите запуск или/и извлечение), запросите другой образец, если это необходимо
пан-RABV РТ-qPCR	Ск Здт;38	Положительные	Положительное обнаружение вирусной РНК
	Сз 38	Отрицательные	Анализ пан-лиссы RT-qPCR
пан-лисса РТ-qPCR	Кривая плавления считается положительной	Положительные	Положительное обнаружение вирусной РНК
	Кривая плавления считается отрицательной	Отрицательные	Отсутствие обнаружения вирусной РНК

Таблица 4: Общая интерпретация двойного комбинированного пан-лиссавируса RT-qPCR анализа.

Геми-гнездо обычных ПЦР анализ	ПЦР раунд	Имя	Длина	Последовательность (5'-3')	Смысле	Позицияa	Размер ампликона (bp)
Геми-гнездо ПЦР ориентации гена полимеразы	1-й тур	PVO5m	20	ATG ACA GAC Aay YTG AAC AAA	S	7170-7189	320
		PVO9	19	TGA CCA TTC АВТОМОБИЛЬ GTN G	Как	7471-7489
	2-й тур	PVO5m	20	АТГА КАГ АКА АЙЕ ТГА АКА А	S	7170-7189	250
		PVO8	22	GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A	Как	7398-7419
Геми-гнездо ПЦР ориентации нуклеопротеин гена	1-й тур	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	1532
		N8m	19	CAG TCT CYT CNG CCA TCT C	Как	1568-1586
	2-й тур	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	845
		N829	19	GCC CTG GTT CGA ACA TTC T	Как	881-899

Таблица 5: Описание грунтовок, используемых для обычного геми-гнездом ПЦР.

	Геми-гнездо ПЦР ориентации гена полимеразы
	Шаг	Цикл	Температура	Время
Первый и второй раунды	Первоначальная денатурация	1	94 КК	3 мин.
	Денатурация	35	94 КК	30 с
	Гибридизация		56 градусов по Цельсию	45 с
	Удлинение		72 КК	40 с
	Окончательное удлинение	1	72 КК	3 мин.
	Геми-гнездо ПЦР ориентации нуклеопротеин гена
	Шаг	Цикл	Температура	Время
Первый раунд	Первоначальная денатурация	1	94 КК	3 мин.
	Денатурация	35	94 КК	30 с
	Гибридизация		56 градусов по Цельсию	30 с
	Удлинение		72 КК	45 с
	Окончательное удлинение	1	72 КК	3 мин.
Второй тур	Первоначальная денатурация	1	94 КК	3 мин.
	Денатурация	35	94 КК	30 с
	Гибридизация		58 градусов по Цельсию	30 с
	Удлинение		72 КК	30 с
	Окончательное удлинение	1	72 КК	3 мин.

Таблица 6: Описание условий теплового велоспорта для обычного геми-гнездом ПЦР.

Лаборатории	Страны	Период оценки	Nb образцов	Результаты DFAT		Результаты RIDT		Чувствительность	Специфика
				Pos	Нег	Pos	Нег
Лаборатория 1	Франция	2015	82	50	32	50	32	96%	93.7%
Лаборатория 2	Чад	2012-2015	44	33	11	33	11	100%	100%
Лаборатория 3	Кот-д'Ивуар	2017	10	8	2	8	2	100%	100%
Лаборатория 4	Мали	2017	18	15	3	15	3	100%	100%
Лаборатория 6	Италия	2016	8	8	0	8	0	100%	-
Все		2015-2017	162	114	48	114	48	98.2%	95.8%

Таблица 7: Определение внутренних параметров (чувствительность, специфичность) теста RIDT по сравнению с эталонным методом DFAT, основанного на анализе в общей сложности 162 образцов и с участием 5 различных лабораторий.

Вирусштамм	Оригинальный хост	Расположение	Начальная концентрация (FFU/mL)b	Ограничение обнаружения (FFU/mL)c
9147FRA	Красная лиса	Франция	3,1 x 107	106
Cvs	Лабораторный изолят	-	1,6 x 107	106
8743THA	Человека	Таиланд	8.1 x 107	8,1 x 106
9508-КЗК (САД)	Лабораторный изолят	-	5,4 x 108	107
Pv	Лабораторный изолят	-	4,3 x 107	106
9001FRA	Собака	Французская Гвиана	2,4 x 106	2,4 x 105
9704ARG	Битой	Аргентина	9,5 x 107	105
04030PHI	Человека	Филиппины	2,5 x 107	105

Таблица 8: Предел обнаружения RIDT с использованием 8 различных титрованых суспензий вируса бешенства (от L'chenne et al. 2016¹⁴). ^а CVS: Вызов штамма вируса, САД: Улица Алабама Дафферин, PV: Пастер вирус. ^б Количество флуоресцентных фокус-образующих единиц (FFU) на мЛ. ^{в г.} Количество флуоресцентных фокус-образующих единиц (FFU), депонированных на полосе.

		RIDT выполняется в
		Лаборатория 1			Лаборатория 2			Комбинированный
		Положительные	Отрицательные	Общая	Положительные	Отрицательные	Общая	Положительные	Отрицательные	Общая
Обнаружение вирусной РНК	Положительные	18	1	19	26	0	32	44	7	51
	Отрицательные	0	0	0	0	0	3	0	3	3
	Общая	18	1	19	26	0	35	44	10	54

Таблица 9: Обнаружение вирусной РНК с РТ-qPCR на тест-полоске Anigen, используемой в лабораторных условиях (Lab 1), в полевых условиях и поставляемой при температуре окружающей среды (Lab 2) или комбинированной (от L'chenne et al. 2016^14).

Дополнительная таблица 1: Описание 162 образцов, проверенных с тестом RIDT для определения его внутренних параметров, представленных в таблице 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы загрузить).

Обсуждение

RIDT является простым, быстрым и недорогим методом диагностики посмертного бешенства и перспективной полевой альтернативой лабораторным испытаниям. Применение такого теста, особенно в децентрализованных районах стран с низким и средним уровнем дохода, позволит лучше понять распространенность и передачу вируса бешенства в местном и потенциально национальном масштабе. В сочетании с быстрым методом сбора образцов мозга (без полной некропсии) большим преимуществом является то, что тест может быть полностью выполнен в полевых условиях, вдали от лабораторных помещений. Образцы мозга, собранные с помощью пробного магнума, могут быть использованы для тестирования, поэтому не требуется полностью открывать череп животного. Тест прост в выполнении и интерпретации и особенно подходит для деятельности полевого наблюдения¹⁴. Другими преимуществами RIDT по сравнению с DFAT или DRIT не являются необходимость в положительном и отрицательном контроле и хранении комплекта при комнатной температуре. Кроме того, измененный протокол, в котором шаг разбавления (1:10) в PBS опущен, не требует дополнительных реагентов для выполнения теста и еще больше упрощает процедуру в полевых условиях.

Ключевым моментом является качество образцов мозга. Образцы должны быть собраны и проверены как можно скорее после смерти подозреваемого животного, или храниться при прохладной температуре перед тестированием, чтобы избежать деградации. Разложившиеся образцы не должны быть проверены, поскольку это может повлиять на результат (риск ложного отрицательного результата). Хотя данных о потере чувствительности RIDT с течением времени для образцов мозга пока нет, мы предполагаем, что он аналогичен тесту DFAT^32. Однако время между смертью животного и выполнением теста может быть сокращено, так как тест можно сделать быстро и непосредственно в поле. Таким образом, существует в целом более низкий риск разложения образцов.

Другим важным шагом в протоколе является миграция приостановки выборки. Миграция должна начинаться сразу после внесения образца (1-5 мин). Поэтому высокая вязкость приостановки может негативно повлиять на миграцию. Аккуратно царапины нижней части устройства депозит сайта с капельницы и добавить еще 1-2 капель часто решает эту проблему, и миграция начинается сразу после.

Большинство тестов RIDT, проведенных в африканских лабораториях (Чад, Кот-д'Ивуар и Мали), проводились при температуре окружающей среды, которая может превышать 30 градусов по Цельсию, в то время как диапазон температуры для хранения и использования, рекомендованный производителем, составляет 15 градусов по Цельсию - 30 градусов по Цельсию. Хотя мы не выявили какого-либо влияния высокой температуры на производительность теста RIDT, необходимо оценить его более тщательно. Аналогичным образом, влияние высокой температуры при хранении и транспортировке устройства после использования для обнаружения вирусной РНК и генотипирования требует дополнительной оценки. Чувствительность обнаружения вирусной РНК РТ-qPCR от полосы RIDT может зависеть от качества образца мозга, первоначально используемого в тесте, но и от состояния хранения тестов RIDT после использования. Например, чувствительность обнаружения РНК была выше, когда использованные тесты RIDT хранились в контролируемых лабораторных условиях (94,7%) по сравнению с полевыми условиями (например, Чад) (81,2%)¹⁴. Эти условия могут также повлиять на целостность (особенно длина) РНК фиксированной на полосе, возможно, объясняя умеренную чувствительность для генотипирования на основе более ПЦР ампликонов (например, йgt;500 нуклеотидов)¹⁴. Чувствительность RT-qPCR, выполненная на тест-полоске, была ниже, чем у полученных с помощью карт FTA Whatman (80,6%)^14. Как и другие молекулярные методы, вирусная нагрузка может также повлиять на успех генотипирования на основе полос RDIT, с потенциальными отрицательными результатами для образцов с низкой вирусной нагрузкой^14.

В настоящее время этот тест не рекомендован ВОЗ и УСВН для регулярной диагностики и эпиднадзора за болезнями, и результат не может быть использован сам по себе для принятия решений по вопросам ПЭП. Дальнейшая проверка теста по-прежнему необходима. Тем не менее, точная быстрая диагностика бешенства является важнейшим элементом хорошо функционирующих систем непрерывного эпиднадзора за бешенством и играет важную роль в повышении политической приверженности, что крайне важно для успешного устойчивого контроля бешенства³³. Тесты RIDT предлагают новые возможности для диагностики бешенства в этом контексте и являются полезным инструментом для расширения эпиднадзора за бешенством животных в полевых условиях в энзоотических районах с низким или средним уровнем дохода.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конъюгат нуклеокапсида против бешенства (лиофилизированный, адсорбированный)	Bio-Rad, Франция	3572112	Флуоресцеин-5-изотиоцианат (FITC) конъюгированное поликлональное антитело против нуклеокапсида вируса бешенства. Используйте для справочной технологии DFAT.
Applied Biosystems 7500 Система для ПЦР в реальном времени	Applied Biosystems, Франция	4351104	Амплификация вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции из устройства RIDT.
Одноразовая пластиковая пипетка, соломинка для питья, зажим, пипетка	-		Оборудование, используемое для забора ствола мозга (medulla oblongata) через большое затылочное отверстие.
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, Франция	3574911	Противоокрашивание, используемое для DFAT для облегчения считывания показаний под ультрафиолетовым микроскопом.
Праймер eGFPF1	Eurofins Genomics,	Германия-Forward	праймер для амплификации внутреннего контроля eGFP методом ОТ-кПЦР после экстракции РНК из устройства RIDT, последовательность: 5'-GACCACAGCAGAACAC-3'.
Праймер eGFPR2	Eurofins Genomics,	Германия-Обратный	праймер для амплификации внутреннего контроля eGFP методом ОТ-кПЦР после экстракции из устройства RIDT, последовательность: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics,	Германия-Обратный	праймер для амплификации вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции РНК из устройства RIDT, последовательность: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics,	Germany-Forward	праймер для амплификации вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции РНК из устройства RIDT, последовательность: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Германия-Forward	праймер для амплификации внутреннего контроля методом ОТ-кПЦР после экстракции из устройства RIDT, последовательность: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Зонд RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Германия	-	Зонд для амплификации вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции РНК из устройства RIDT, последовательность: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Зонд RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Германия	-	Зонд для амплификации вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции РНК из устройства RIDT, последовательность: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Экспресс-тест на бешенство Ag Test Kit	BioNote Inc., Республика Корея	RG18-01DD	Иммунохроматографический диагностический экспресс-тест (RIDT, также называемый устройством бокового потока или LFD) для посмертной диагностики бешенства.
Фермент рекомбинантный РНКазин рибонуклеаза Promega	, США	N2515	используется в наборе для амплификации вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции из устройства RIDT.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, France	11732-020	Набор для амплификации вирусной РНК методом ОТ-кПЦР после экстракции из устройства RIDT.
Реагент TRIzol	Invitrogen, Франция	15596026	экстракцию общей РНК на основе фенола/хлороформа с использованием целлюлозной мембраны RIDT.