Методическая статья

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

DOI:

10.3791/60009

⸱

31 декабря 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод характеристики протонных мембранных переносчиков в мембранных препаратов везикулы, производимых гетерологическим выражением в кишечной палочке и лизисклетов с помощью французской прессы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было разработано несколько методов функциональной характеристики новых мембранных транспортеров. Полиамины широко распространены во всех организмах, но полиаминовые обменники в растениях не были выявлены. Здесь мы намечаем метод характеристики полиаминов антипортеров с использованием мембранных пузырьков, полученных из лизиса клеток кишечной палочки, гетеролологически выражающих растительный антипорт. Во-первых, мы heterologously выразили AtBAT1 в штамме кишечной палочки, дефиците полиамина и аргинина обмен транспортеров. Vesicles были произведены с использованием французской прессы, очищены от ультрацентрифугации и использованы в мембранной фильтрации проверки помечены субстратов, чтобы продемонстрировать специфику субстрата транспортера. Эти анализы показали, что AtBAT1 является протонным транспортером аргинина, а-аминомасляной кислоты (ГАМК), путрешкина и спермидина. Штамм мутантов, разработанный для анализа AtBAT1, может быть полезен для функционального анализа других семейств обменников полиамина растений и животных. Мы также предполагаем, что этот подход может быть использован для характеристики многих других типов антипортеров, до тех пор, как эти белки могут быть выражены в мембране бактериальных клеток. E. coli является хорошей системой для характеристики новых транспортеров, так как существует несколько методов, которые могут быть использованы для мутации местных транспортеров.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки, участвующие в торговле метаболитами, представляют собой необходимый уровень физиологической регуляции, однако подавляющее большинство переносчиков растительных мембран еще не были функционально охарактеризованы. Было реализовано несколько стратегий, характеризующих новые транспортные белки. Гетерологические выражения в модельных организмах, таких как кишечная палочка и эукариотические клетки, такие как дрожжи, ксенопусские яйцеклетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых и растительные клетки, все были использованы для определения их транспортной активности1. Эукариотические клетки благоприятствуют экспрессии эукариотических белков, потому что основной клеточный состав, пути преображения сигнала, транскрипция и перевод машины совместимы с родными условиями.

Дрожжи были важной моделью организма для характеристики новых транспортных белков в растениях. Первый растительный транспортный белок, который был успешно выражен в дрожжах(Saccharomyces pombe) был гексозный транспортер HUP1 от Chlorella2. С тех пор многие растительные переносные белки были функционально охарактеризованы с помощью системы экспрессии дрожжей. К ним относятся, транспортеры сахара растений (SUC1 и SUC23, VfSUT1 и VfSTP14) и auxin транспортеры (AUX1 и PIN5). Недостатки использования дрожжей для экспресс-белков растений могут включать в себя нарушение активности пластид-локализованных белков, потому что дрожжи не хватает этой органеллы, mistargeting6, и формирование неправильно сложить агрегаты и активации реакции напряжения в дрожжах из-за переэкспрессии мембранных белков7,8,9.

Гетерологические выражения транспортных белков в оновых яйцеклетках Ксенопуса широко использовались для электрофизиологической характеристики транспортеров10. Первые растительные транспортные белки, характеризуемые с использованием гетерологических выражений в ооцитах Xenopus, были каналом arabidopsis калий KAT110 и арабидопсисом гексоза транспортер STP111. С тех пор, Ксенопус ооциты были использованы для характеристики многих растительных транспортных белков, таких как плазменные мембраны транспортеров12, вакуолярной сахарозы транспортер SUT413 и вакуолярный malate транспортер ALMT914. Важным ограничением ксенопусных яйцеклеток для транспортных анализов является то, что концентрацией внутриклеточных метаболитов нельзя манипулировать1. Кроме того, профессиональные знания необходимы для подготовки ооцитов Ксенопуса и изменчивость партий яйцеклеток трудно контролировать.

Гетерологические выражения в модельном организме E. coli является идеальной системой с точки зрения характеристики новых растительных транспортных белков. С полностью секвенированным геномом15, молекулярные и физиологические характеристики кишечной палочки хорошо известны. Молекулярные инструменты и методы хорошо созданы16. Кроме того, различные векторы экспрессии, непатогенные штаммы и мутанты доступны17,18,19. Кроме того, кишечная палочка имеет высокие темпы роста и может быть легко выращивается в лабораторных условиях. Многие белки могут быть легко выражены и очищены в больших количествах в E. coli9. Когда белки не могут быть асссированы непосредственно в клеточных системах, восстановление белков в липосомы также было успешным, хотя и сложным нововведением для характеристики очищенных мембранных белков. Функциональная характеристика растительных митохондриальных транспортных белков, включая растворимые транспортеры, такие как фосфатные транспортеры в сое, кукурузе, рисе и арабидопсисе, dicarboxylate-tricarboxylate перевозчика в Arabidopsis были выполнены с помощью этой модели системы20,21. Тем не менее, рекомбинантные белки томатного белка SICAT9 были признаны нефункциональными в экспериментах по восстановлению, а другие члены семейства транспортер CAT были признаны нефункциональными в анализе ооцитов Xenopus 22. Таким образом, необходимы дополнительные молекулярные инструменты для характеристики мембранных транспортеров.

Пять полиаминов транспортных систем находятся в E. coli23. Они включают в себя два abc транспортеров посредничество поглощения спермидин и putrescine, putrescine / орнитин обменник, кадаверин / лизин обменник, спермидин экспортера и putrescine импортера. Putrescine обменник PotE был первоначально охарактеризован с помощью везикулы асссея, где наизнанку пузырьков были подготовлены лизинг клетки с французской прессой и измерения поглощения радиомаркированных putrescine в пузырьки в обмен на орнитин24. Vesicle анализы были также использованы для характеристики транспортера кальция, который опосредовал транспортировку кальция в ответ на градиент протона25. Эти эксперименты побудили нас разработать стратегию характеристики других обменников полиамина. Сначала мы создали штамм E. coli дефицит в PotE и CadB обменников. Здесь мы демонстрируем функциональную характеристику растительного полиаминового антипорта гетерологическим выражением в модифицированном штамме кишечной палочки, генерации мембранных пузырьков с использованием французской прессы и радиомаркированных анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поколение E. coli Двойной knock Out мутант с P1 Трансдукция

  1. Получить E. coli одного нокаута мутант штаммов »PotE и »CadB от E. coli генетический фондовый центр(http://cgsc.biology.yale.edu).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм «PotE» является канамицин устойчивым26 и штаммом «CadB» является тетрациклин устойчивостью27.
  2. Постройте штамм Двойной нокаут PotE/CadB (DKO) с помощью протокола трансдукции P128.
    1. Лизатная подготовка
      1. Разбавить ночную культуру «PotE» в свежем LB (1:100) дополните 10-25 мМ MgCl2,5 мМ CaCl2и 0,1-0,2% глюкозы.
      2. Расти при 37 градусах по Цельсию в течение 1-2 ч.
      3. Добавьте 40 зЛ фаговp lysate P1 в культуру и продолжайте расти при 37 градусах Цельсия. Монитор в течение 1-3 ч до тех пор, пока культура не опрокинет
        ПРИМЕЧАНИЕ: Когда культура lysed, клеточный мусор будет виден в трубке и культура будет иметь значительную потерю мутности.
      4. Добавьте несколько капель хлороформа (50-100 л) в лизат и вихрь. Центрифуга при 12000 х г в течение 2 мин для удаления клеточного мусора и передачи супернатанта в свежую трубку.
    2. Трансдукция
      1. Расти штамма CadB на ночь в LB среде.
      2. Урожай клеток центрифугирования на 4000 х г в течение 2 мин и повторно в 1/5-1/3 собранный объем культуры в свежем LB дополнен 100 мм MgSO4 и 5 мМ CaCl2.
      3. Добавьте суспензию клетки «CadB» в трубку с фагом от шага 1.2.1.4 и быстро перемешайте.
      4. Добавьте 200 кЛ 1 М На-Цитрат (pH5.5), затем добавьте 1 мл LB. Инкубировать при 37 градусах По цельсии на 1 ч, чтобы можно было выразить устойчивость к антибиотикам маркер.
      5. Спиновые клетки при 4000 х г в течение 5 мин.
      6. Повторно езбитая в 100 ЛЛ ЛБ с помощью 100 мМ Na-Citrate (pH 5.5) и вихря хорошо для разгона клеток.
      7. Выберите рекомбинантные штаммы на пластинах агара LB с 50 мкг/мл канамицин омичей и 10 мкг/мл тетрациклина, а затем подтвердите Полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с соответствующими грунтовками26,27.
      8. Проверьте фрагменты ПЦР путем секвенирования.

2. Выражение целевого гена (AtBAT1) в E. coli Mutant

  1. Усиль полноформатную последовательность гена-мишени по ПЦР и вставьте в вектор входа шлюза pENTR/D-TOPO29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае ATBAT1.1 был усилен с помощью переднего грунтовки 5'CGGCGATCAATCCTTGTTTTTTTTTTTt и обратной грунтовой 5'GCTAAGAATGTTGGAGGG, первоначальная денатурация при 98 градусах по Цельсию в течение 2 мин, а затем 30 циклов денатурации при 98 градусах по Цельсию в течение 0,1 мин, аннулирование при 59 кв. c в течение 0,3 мин, расширение на 72 кв. м в течение 0,40 мин и окончательное расширение при 72 c в течение 10 мин. Продукт ПЦР был очищен с помощью комплекта очистки ПЦР, количественно оцениваемого с помощью спектрометра. Вставка продукта ПЦР в вектор шлюза была осуществлена по направлениям производительных веществ.
    1. Преобразуйте вектор входа в компетентные клетки Top10 E. coli с помощью теплового удара и выберите для успешных рекомбинантов на LB-носителе с 50 мкг/мл канамицина в соответствии со стандартными протоколами молекулярного клонирования30.
    2. Извлекайте плазмидную ДНК с помощью комплекта плазмидной экстракции, следуя указаниям производителя, и последовательность, чтобы подтвердить правильную вставку.
  2. Передача целевого гена в вектор назначения E. coli, pBAD-DEST49 по клонированию Gateway LR для создания вектор выражения29.
    1. Преобразуйте вектор экспрессии в компетентные клетки Top10 E. coli по тепловым шоку в течение 30 с и выберите успешные рекомбинанты на LB-носителе с 100 мкг/мл ампициллин30.
    2. Извлеките плазмид НУЮ ДНК30 и последовательность для подтверждения правильной вставки.
  3. Преобразуйте вектор экспрессии в E. coli spotE740 (del):kan, 'cadB2231::Tn10 и выберите на пластинах LB с ампициллином, канамицином и тетрациклином30.
  4. Для того, чтобы определить оптимальную концентрацию арабинозы для индукции, выразить целевой ген под контролем промоутера araBAD в LB-медиа с градиентной концентрацией арабинозы, как описано29.
  5. Соберите клеточные гранулы и оцените экспрессию белка sDS-PAGE и визуализацию белковых полос, описанных в руководстве по продукту29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контрольного образца без выражения BAT1 использовался E. coli spotE740 (del)::kan, scadB2231::Tn10 без выражения BAT1. Двойной e.coli выбивает клетки-мутанты с пустым вектором pBAD-DEST49 не использовался в качестве контроля из-за присутствия гена ccdB в векторе.

3. Поколение наизнанку Мембраны Весиклы

  1. Культура E. coli мутантных клеток, выражающих целевой белок, выращивая одну колонию в одночасье в 5 мл неполиаминовых носителей (2% глицерола, 6 г K2HPO4, 3 г KH2PO4, 0,5 г NaCl, NH4Cl, 50 мг тиамина, 0,79 г дрожжей полного синтетического медиа аденина гемисульфата (10 мг/л), L-аргинина (50 мг/л), L-аспарновой кислоты (80 мг/л), L-Histi Моногидрат гидрохлорида (20 мг/л), L-лейцин (100 мг/л), Л-лизин гидрохлорид (50 мг/л), L-метионин (20 мг/л), L-фенилаланин (50 мг/л), L-трионин (100 мг/л), L-триптофан (50 мг/л), L-тирозин (50 мг/л), L-Валин (140 мг/л), Урасил (20 мг/л)... Перенесите эту культуру на 500 мл свободных от полиамина средств массовой информации, дополненных 0,0002% арабинозы и расти до тех пор, пока клеточная культура достигает ОД600 0,6-0,8 (обычно 5 ч).
  2. Соберите клеточные гранулы центрифугированием при 2000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Отрежь гранулы и промыть три раза с 0,1 М фосфатного буфера калия, рН 6,6, содержащий 10 мМ EDTA (Буфер 1). Окончательный объем ячеек в Буфере 1 после третьего вращения должен быть 10 мл.
  3. Создание наизнанку мембранных пузырьков по процедуре французской прессы (10000 p.s.i.) из нетронутых клеток с помощью 35 мл французского давления Cell.
  4. Перед загрузкой образца в стандартную французскую ячейку давления, смазать поршень и O-кольца, чтобы сделать его легче вставить в ячейку.
    Примечание:Эти инструкции специфичны для использования стандартной ячейки давления31.
    1. Тщательно винт замыкания подключить в нижнем конце ячейки. Убедитесь, что ячейка является правой стороной вверх на основе надписи на стороне ячейки. Вставьте поршень в ячейку и переместите его в ячейку, пока максимальная линия заполнения на поршня не достигнет верхней части поршня. Переверните устройство снова и поместите на предоставленную позицию между тремя должностями.
    2. Налейте суспензию клетки в тело клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали только 10 мл, так что будет много места осталось во французской камере ячейки давления, которая имеет емкость 35 мл.
    3. Установите стандартную ячейку давления на французский блок ячейки давления.
      1. Сначала проверьте, что электричество выключено. С левой стороны панели находится переключатель Selector Ratio. Оно имеет 3 положения: вниз на конце бега, низко для использования более малой клетки давления, и высокодля пользы с стандартной французской ячейкой давления. Если французская пресса ранее использовалась с меньшей ячейкой, поршень не может быть полностью убран. Установите этот переключатель на Down.
    4. Включите машину с включением RHS в задней части устройства и включите переключатель Pause-Run в положение Run. Это приведет к тому, что поршень будет полностью убран. Переместите переключатель обратно в Паузуи выключите машину.
    5. Потерять винты большого пальца и переместить зажим безопасности, который охватывает до двух столбцов из нержавеющей стали в сторону. Он будет качаться вправо. С одной стороны, держа основание замыкания плагина на месте, выбрать французский давление ячейки вверх обеими руками, и повернуть его 180 ", так что поршень в настоящее время в вертикальном положении. Установите его на платформу, и переместить зажим безопасности обратно на место, так что этот зажим держит французский давление ячейки в положении.
    6. Обратите внимание, что сборка Flow Valve на замыктах должна быть доступна для эксплуатанта и расположена таким образом, чтобы клапан мог быть свободно повернут. Откройте сборку клапана потока несколькими против часовой стрелки. Расположите руки поршня так, чтобы они были ориентированы в положении «два часа» и «восемь часов». Затяните большие пальцы винты так, что стандартная ячейка давления удерживается на месте.
    7. Вставьте образец розетки трубки в замыкание штепсельной вилки, и подключить короткий кусок гибкой трубки так, что сломанной клетки мусора могут быть собраны в трубку сокола. Обычно мы используем заполненный льдом 300 мл стакан, чтобы держать трубку сокола в вертикальном положении, и держать мусор клетки охлажденным.
    8. Убедитесь, что переключатель Pause-Run настроен на паузу,а сборка клапана находится в открытом положении. Включите машину обратно, adust Коэффициент селектора переключатель на высокий, и повернуть давление увеличение клапана на передней панели справа около половины оборота.
    9. Поршень начнет подниматься с базы, чтобы вытеснить воздух в камере. Направьте воздух, выходящий из трубки Tygon, прикрепленной к трубе розетки образца к трубке в стакане.
    10. Когда первые капли жидкости выходят, закройте сборку клапана потока, повернув его по часовой стрелке. Это создает металл к уплотнению металла, с клеткой давления, поэтому не overtighten.
    11. Перед французской прессой есть диаграмма на передней панели для создания надлежащего давления на биологические клетки внутри клетки давления. В этом случае, увеличить давление, повернув давление Увеличение valve по часовой стрелке, пока Gauge достигает 640 пси. Это создаст внутреннее давление 10000 пси.
    12. После того, как ячейка достигла целевого давления открыть сборку клапана потока немного, повернув его против часовой стрелки. Отрегулируйте отверстие клапана, чтобы скорость потока составила всего около 10 капель на мин.
    13. Когда стоп-линия на поршень тело достигает верхней части потока ячейки. Переключите переключатель паузы-run на паузу. Это имеет решающее значение, потому что с поршневой вставляется дальше в ячейку повредит устройство. Откройте сборку клапана потока и соберите оставшиеся капли.
    14. Переверните коэффициент коэффициента в Down,а затем установите переключатель Pause Run на Run. Когда нижняя пластина полностью убирается, установите переключатель Run на паузуи выключите машину.
    15. Удалите французскую ячейку давления из французской прессы, и разобрать для очистки. Храните все части сухими с легким покрытием глицерола. Удалите и замените любые прокладки или уплотнения с признаками износа.
  5. Удалите непрерывные клетки и клеточные обломки французского пресса eluent центрифугированием при 10000 х г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от гранул и перенесите супернатант в ультрацентрифугные трубки.
  6. Пеллетная мембрана пузырьков из полученного супернатанта при ультрацентрифюгегации 150 000 г на 1 ч при 4 градусах Цельсия.
  7. Вымойте мембранные пузырьки один раз, без повторной подвески, в 1 мМ Tris-мацеат, рН 5.2, содержащий 0,14 M KCl, 2 мМ 2-меркаптоэтанол и 10% глицерола и resuspend в том же буфере (Буфер 2)23 с помощью dounce ткани шлифовальной машины. Как правило, мембранная фракция от 500 мл культуры будет приостановлена в 5 мл буфера, и концентрация 5-10 мг мембранного белка / мл с использованием биохиновой кислоты анализ32.
  8. Храните 100 аликотов мембранных препаратов при -80 градусах По Цельсию в микроцентрифуговых трубках 1,5 мл.

4. Западная подись и ориентация транспортер Асссе

  1. Вымойте и приостановите пузырьки со ступени 3,7 в 30 мм Tris pH 7,8 и 0,1 мм CoCl2.
  2. К 100 л образцов добавьте 1 кл/ 2 мг/мл карбоксипептидаза А в 0,1 М NaCl, 30 мм Tris, 0,2 мМ CoCl2 рН 7,8.
  3. Прививать в течение 20 мин при 20 градусах Цельсия. Остановить пищеварение, добавив 5 л 0,5 М NaEDTA, 0,5 М 2-меркаптоэтанол рН 7,5.
  4. Чтобы полностью инактивировать фермент, инкубируйте раствор на 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Vesicles без catboxypeptidase лечение были использованы в качестве контроля.
  5. Анализ образцов электрофоресиса в присутствии литий-додецил сульфата. Добавьте 5-10 л литий-додецилов огойля, 450 мг/мл глицерола, 0,1 мг/мл бромофенола синий, 0,4 М Трис рН 7,5 до 100 л образца.
  6. Выполните иммуноблоттинг, укладывая фильтр нитроцеллюлозы, смоченный с 25 мМ натриево-водородного фосфата рН 7,5 на полиакриламидный гель. Поместите их между двумя увлажненными фильтрами целлюлозы и, наконец, между двумя увлажненными пластиковыми прокладками для чистки. Поместите эту сборку между электродами камеры, содержащей 25 мМ натрия водорода фосфата рН 7,5 при 2-4 градусах Цельсия.
  7. Разрешить электротрансфер белков, чтобы продолжить в течение 3 ч при 20 В и 2-3 А.
  8. Блок нитроцеллюлозы мембраны на ночь при 2 градусах В блокирующем буфере 0,15 М NaCl, 10 мМ Трис, рН 7,5 и 0,5 мг/мл Tween 2033.
  9. Инкубировать фильтр нитроцеллюлозы на 2 ч с 1:5000 разбавления Анти-His (C терминал)-HRP антитела в блокирующем буфере (20 мл) и мыть дважды с 50 мл буфера в общей сложности 60 минут.
  10. Для визуализации иммуноблота, растворить 6 мг 4-хлоро-1-нафталь в 20 мл денатурированного алкоголя и добавить 80 мл 15 мм Tris pH 7,5 и 50 л 30% H2O2. Купай фильтровальную бумагу в подстрижке в течение 20 минут. Реагент будет реагировать с антителами, чтобы сформировать синий осадок на мембране нитроцеллюлозы. При достаточном цвете развился, промыть мембрану водой и дать высохнуть.

5. Транспортная ассай

  1. Инкубировать 100 аликотов мембранных пузырьков при 12 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
  2. Инициировать транспортировку путем добавления радиомаркированных полиаминов в мембранные пузырьки при конечной концентрации 50 мкм (если не указано иное). Сделайте 3H-субстрата (спермидин или путрешкин) растворами в буфере ассеа, состоящем из 10 мм Tris-HCl, 10 мм фосфата калия, pH 8.0 и 0.14 M KCl23 (Буфер 3) с изменениями в зависимости от ассоса.
  3. Проведите транспортные анализы в течение 1 мин при 12 градусах По Цельсия в микрофуганых трубках 1,5 мл.
  4. После 1 мин, передача реакции смеси фильтрации многообразия и фильтр через 0,45 мкм нитроцеллюлозы мембранного фильтра.
    1. Добавьте 3 мл ледяного асссифированного буфера, содержащего 10-кратную более высокую концентрацию немаркированных полиаминов, за которым и 3 мл буфера асссеа без полиаминов для уменьшения неспецифической связывания.
    2. Перенесите промытые фильтры в 20 мл одноразовых флаконов, содержащих 10 мл сцинтилляционной жидкости, и определите радиоактивность с помощью жидкого счетчика сцинтилляции. Счетчик сцинтилляции измеряет радиоактивность в образце и сообщает о его распаде на мин (dpm).
  5. Рассчитайте чистое поглощение полиамина, поскольку разница между поглощением на 1 мин пузырьками инкубируется при 12 градусах Цельсия и поглощением на 0 мин пузырьками, инкубированными на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масса субстрата, импортируемого в пузырьки, рассчитывается следующим образом. Если объем образца в микрофугной трубе составляет 0,2 л, а стартовая концентрация субстрата составляет 100 мкм, то общая масса субстрата в микрофуге-трубке составляет 20 х 10-12 М. Из-за очень высокой специфической активности коммерчески маркированных субстратов (часто 2,22 х 10 д/мМ) масса добавленного изотопа может быть проигнорирована при расчете. Так что, если общее количество изотопов, который был добавлен в микрофуг трубки было 100 х 106 дм и везикулы были чистый поглощения 1000 дм, то общая масса субстрата, принятых на везики составил 1% от общего числа родинок субстрата или 2 х 10-13 М.
    1. Определите Km для субстрата путем измерять поглощение 10, 25, 50, 250 и 500 мкм радиомаркированный субстрат в пузырьки выражая протеин цели. Рассчитайте кинетику Михаэлиса-Ментена с помощью нелинейного метода регрессии с помощью модели Michaelis Menton статистического пакета программного обеспечения34.
  6. Для проведения конкурсных экспериментов добавьте 100 мкм, 500 мкм, 1 мМ, 1,5 мм или 2 мМ немаркированного конкурентоспособного субстрата, сделанного в буфере асссе, к микроцентрифуге 1,5 мл, содержащей 100 мл пузырьков при 12 градусах Цельсия.
    1. Добавить радиомаркированный полиамин (50 мкм) в микроцентрифугую трубку одновременно.
    2. Измерьте радиоактивность, оказавшись внутри пузырьков, как упоминалось выше, повторяя шаги от 5 до 5.4.2.
    3. Определите видимый Km (Km,app) для конкурентоспособных субстратов, измеряя поглощение 10, 25, 50, 250 и 500 мкм радиомаркированных полиаминов в присутствии 100 мкм или выше немаркированного субстрата и используя нелинейный метод регрессии для составления кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основные шаги в этом протоколе обобщены живописно на рисунке 1. Короче говоря, клетки кишечной палочки, недостающие во всех обменных пунктах полиамина и выражающие AtBAT1, культивируются, центрифугируются, промываются буфером и подвергаются клеточному лисису с помощью французской прессы. Lysis, как правило, производят пузырьки, которые в основном наизнанку и ловушки буфера за пределами клеток. Клеточный мусор удаляется центрифугированием, и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем исследовании мы излагаем метод характеристики антипорта, сначала выражая белок в кишечной палочке, а затем генерируя мембранные пузырьки, так что гетеролоязычно выраженный белок может быть прослежен в системе, свободной от клеток. В дополнение к оборудованию, найденного в большинстве лабораторий молекулярной биологии, эта стратегия требует использования французской прессы, ультрацентрифуги, а также доступа к объекту для проведения радиоизотопных анализов.

Основное требован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддержку этому проекту оказали Высшее училище БГГУ и Управление спонсорских программ и исследований БГГУ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолSigmaM6250sup
>3H-путресцинPerkinElmerNET185001MC
3H-спермидинPerkinElmerNET522001MC
4-хлор-1-нафтолSigma-AldrichC8890
14C аргининMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP антителоThermoFisherR931-25Обнаруживает С-концевую полигистидиновую метку (6xHis), для обнаружения требуется свободная карбоксил
группа
ArabinoseSigma-AldrichA3256
для анализа белка BCAThermoFisher23227Pierce BCA protein asay комплект.
Бромофенол синийBio-Rad161-0404
карбоксипептидаза BSigma-AldrichC9584-1mg
ЦентрифугаSorvallSS-34 с фиксированным углом наклона ротор и ротор с фиксированным углом GA-6
Dounce тканевая мельница DounceLabGenome7777-7Corning 7777-7 гомогенизатор pyrex с носиком.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275сцинтилляционный коктейль
EDTASigma-Aldrich
Фильтрационный коллекторHoeferFH225V
Французская ячейка давленияGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
ГлутаматSigma-AldrichG6904
Программное обеспечение Glycerin
GraphPad Prism <a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Перекись водородаKROGER
Хлорид калияJ.T. Baker3040-01
Счетчик жидкого сцинтилляцииBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Нитроцеллюлозные мембранные фильтрыMerck Milliporehawp025000.45 &; M
Набор для очистки ПЦРGenscriptQuickClean II
Фосфат калия двухосновнойThermoFisherP290-500
путресцинфлюка32810
Фосфат калия одноосновнойJ.T.Baker4008
СпермидинSigma-aldrichS2501
Штаммы: E. coli & Delta; potE740(del)::kan, Δ cadB2231::Tn10Эта рукописьдоступна по запросу.Дефицит штамма в полиаминообменниках PotE и CadB.
Исследовательская продукцияTris-baseT60040-1000
УльтрацентрифугаSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT Ротор с фиксированным углом
наклона Ультрацентрифужные пробиркиThermoFisher45237Центрифужные пробирки для ротора S150-AT
Вектор: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway вектор экспрессии для E. coli
Набор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191(2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи