Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Макрофаги представляют собой наиболее неоднородные и обильные популяции иммунных клеток в сердце и занимают центральное место в воспалении и репаративных реакциях после сердечной травмы. Как различные подмножества макрофагов организовать иммунные реакции после сердечной травмы является активной областью исследований. Представлен простой протокол, который наша лаборатория выполняет регулярно, для извлечения макрофагов из мыши и человеческих образцов миокарда, полученных от здоровых и больных людей. Кратко, этот протокол включает в себя ферментативное пищеварение сердечной ткани для создания одной подвески клеток, а затем окрашивая антитела, и поток цитометрии. Этот метод подходит для функциональных анализов, выполняемых на отсортированных клетках, а также для секвенирования РНК навалом и одноклеточной РНК. Основным преимуществом этого протокола является его простота, минимальная повседневная вариация и широкая применимость, позволяющая исследует неоднородность макрофагов в различных моделях мыши и человеческих заболеваниях.
Введение
Макрофаги представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток в сердце, и они играют важную роль в генерации надежных воспалительных и репаративных реакций после сердечной травмы1,2,3,4. Ранее наша группа определила два основных подмножества макрофагов в сердце мурина, полученных из различных происхождения развития5,6. В целом, различные популяции тканей резидентов сердечных макрофагов подмножества могут быть определены на основе экспрессии поверхности клетки CCR2 (C-C м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Представленный протокол был одобрен Вашингтонским университетом в Сент-Луисе (#201305086). Все испытуемые предоставляют информированное согласие перед сбором проб, и эксперименты проводятся в соответствии с утвержденным протоколом исследования. Представленный протокол выполняется с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных в Медицинской школе Вашингтонского университета и соответствует руководящим принципам, описанным в руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка человека сердечных тканей Specimens
- Флеш высаживал сердца, консервируя левую и правую коронарную артерию o....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанный протокол позволяет отделять макрофаги от мыши и миокарда человека. Используя тот же протокол, но с другой стратегией окрашивания и гатинга, стромальные клетки также могут быть собраны из миокарда человека. Результаты FACS, представленные здесь, были приобретены либо на платформе BD LSRII, либо на платформе BD FACS ARIA III. Компенсационный контроль был сформирован из одного цветоконтроля образцов из окрашенных спленоцитов. На рисунке 1 показано необ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол позволяет извлечения различных подмножеств макрофагов из миокарда человека. Протокол прост и занимает от 3 до 4 часов, чтобы подготовить одноклеточную подвеску, готовую к анализу FACS. Хотя протокол относительно прост в исполнении, есть определенные технические аспекты, которые необходимо учитывать, что позволит свести к минимуму изменчивость. Во-первых, для оптимальной жизнеспособности клеток необходима своевременная работа с человеческими тканями. Важно держать ткань в холодном сольном/HBSS для того чтобы свес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Этот проект стал возможным благодаря финансированию, предоставленному Детским институтом открытий Вашингтонского университета и Детской больницей Сент-Луиса (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Фондом Барнс-Еврейской больницы (8038-88) и NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. поддерживается NIH K08 HL123519 и Берроуз Добро пожаловать фонда (1014782).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Конокальные трубки 15 мл | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 & микро; m Клеточные фильтры | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 мл Конические пробирки | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Буфер для лизиса | Gibco | A10492-01 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Sigma | A2058 | |
| Коллагеназа 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0,5 м pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Фермент деактивирующий буфер | 490 мл HBSS, 10 мл FBS, 1 г BSA | ||
| FACS Буфер | 976 мл PBS, 20 мл FBS, 4 мл ЭДТА (0,5 М) | ||
| Фетальный Бычья сыворотка | Gibco | A3840201 | |
| щипцы | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Гемостаты | VWR | 63042-052 | |
| Гиалуронидаза типа 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Чашки Петри | Thermo Fisher | ||
| Лезвие бритвы | VWR | 55411-050 | |
| Ножницы | VWR | 82027-578 |
Ссылки
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
