Методическая статья

Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши

DOI:

10.3791/60015

⸱

17 декабря 2019 г.

 , 
1Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Immunology and Pathology, Washington University School of Medicine, 3Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги представляют собой наиболее неоднородные и обильные популяции иммунных клеток в сердце и занимают центральное место в воспалении и репаративных реакциях после сердечной травмы. Как различные подмножества макрофагов организовать иммунные реакции после сердечной травмы является активной областью исследований. Представлен простой протокол, который наша лаборатория выполняет регулярно, для извлечения макрофагов из мыши и человеческих образцов миокарда, полученных от здоровых и больных людей. Кратко, этот протокол включает в себя ферментативное пищеварение сердечной ткани для создания одной подвески клеток, а затем окрашивая антитела, и поток цитометрии. Этот метод подходит для функциональных анализов, выполняемых на отсортированных клетках, а также для секвенирования РНК навалом и одноклеточной РНК. Основным преимуществом этого протокола является его простота, минимальная повседневная вариация и широкая применимость, позволяющая исследует неоднородность макрофагов в различных моделях мыши и человеческих заболеваниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток в сердце, и они играют важную роль в генерации надежных воспалительных и репаративных реакций после сердечной травмы1,2,3,4. Ранее наша группа определила два основных подмножества макрофагов в сердце мурина, полученных из различных происхождения развития5,6. В целом, различные популяции тканей резидентов сердечных макрофагов подмножества могут быть определены на основе экспрессии поверхности клетки CCR2 (C-C мотив хемокин рецептор 2). CCR2- макрофаги (выражение поверхности клетки: CCR2-MHCIIнизкий и CCR2-MHCIIhigh) имеют эмбриональное происхождение (примитивные и эритромиелоидные линии), способные к самообновлению и представляют доминирующую популяцию в гомеостатичных условиях. Резидент CCR2и макрофаги имеют окончательное гематопоиетическое происхождение, поддерживаются путем набора из циркулирующих моноцитов, и представляют незначительную популяцию в гомеостатических условиях. Функционально, CCR2- макрофаги генерировать минимальное воспаление и имеют решающее значение для коронарного развития неонатальной регенерации сердца5,7. В отличие от этого, CCR2и макрофаги инициировать надежные воспалительные реакции после сердечных оскорблений и способствовать залога травмы кардиомиоцитов, неблагоприятное ремоделирование левого желудочка, и сердечная недостаточность прогрессии8,9.

Недавно мы показали, что миокард человека также содержит два различных подмножества макрофагов, идентифицированных аналогичным образом как CCR2- или CCR2No8. Экспрессия генов и функциональный анализ показали, что макрофаги CCR2человека и CCR2 представляют функционально расходящиеся подмножества и функционально аналогичны CCR2- имакрофагам CCR2, найденным в сердце мыши. Человеческий CCR2- макрофаги выражают устойчивые уровни факторов роста, включая IGF1, PDGF, Cyr61 и HB-EGF. Макрофаги CCR2и обогащаются в химокинах и цитокинах, которые способствуют воспалению, таким как IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 и TNF-a. Стимулированные CCR2- макрофаги выделяют заметно более высокие уровни воспалительного цитокина интерлейкина-1 " (IL-1") в культуре. Как эти подмножества дифференарно способствуют восстановлению тканей и ремоделирования левого желудочка (LV) в контексте сердечной травмы остается областью активных исследований.

Поток-цитометрия на основе анализа макрофаг неоднородности в мыши и человеческого сердца требует переваривания сердечной ткани и генерации одной клеточной подвески с последующим циклометрическим анализом потока или сортировкой клеток для дальнейших процессов вниз по течению, таких как массовое секвенирование РНК/одноклеточная РНК секвенирования или культивирование клеток для функциональной анализа. Первоначальный протокол для принятия одной ячейки подвески из сердца murine были впервые сообщили nahrendorf группы в Nahrendorf и др. 200710. Наша лаборатория адаптировала и модифицировала протокол для извлечения макрофагов из миокарда человека. Используя тот же протокол, но с небольшимизменением в схеме окрашивания и gating, CD45- стромальные клетки из миокарда человека также могут быть собраны. Представленный здесь, в тексте и видео, протокол, который выполняется регулярно для извлечения макрофагов или стромальный из человеческой миокарда.

Образцы сердечной ткани получают сяритогецы у взрослых пациентов с расширенной кардиомиопатией (DCM: идиопатической или семейной) или ишемической кардиомиопатией (ИКМ), проходящими левожелудочковой вспомогательной помощью (LVAD) имплантации или трансплантации сердца. Выслаженные сердца или сердечники LVAD внутриваскулярно пронизаны холодным сольнием до начала процедуры пищеварения. Важно отметить, что «качество» образца ткани, определяемые с точки зрения степени образования рубцов или инфильтрации жировой ткани, может значительно повлиять на урожайность макрофагов. Образцы сердца с большими областями рубцов будут иметь гораздо более низкую урожайность клеток и могут представлять серьезные технические ограничения, когда желаемые методы анализа вниз по течению требуют культивирования клеток in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный протокол был одобрен Вашингтонским университетом в Сент-Луисе (#201305086). Все испытуемые предоставляют информированное согласие перед сбором проб, и эксперименты проводятся в соответствии с утвержденным протоколом исследования. Представленный протокол выполняется с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных в Медицинской школе Вашингтонского университета и соответствует руководящим принципам, описанным в руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка человека сердечных тканей Specimens

  1. Флеш высаживал сердца, консервируя левую и правую коронарную артерию ostia и надоеть с 200 мл холодного солевого раствора.
  2. Промыть LVAD апикальных корированных тканей, cannulating эпикардиального сосуда и пронзать с 50 мл холодного сольника.
  3. Вскрыть образец ткани из апкальной или боковой стенки левого желудочка в холодном солевом растворе или HBSS с помощью стерильных ножниц.
  4. Тщательно вскрыть эпикардиальный жир и акдиновые тендины из образца с помощью тонких ножниц.
  5. Рассекать куски ткани на куски весом около 200 мг с помощью стерильного лезвия или ножниц.

2. Подготовка мышиного сердца

  1. Эвтанизировать мышь путем удушья CO2 или вывихшей шейки матки.
  2. Откройте грудную полость с помощью острых ножниц. Используйте тупые гемостаты, чтобы поднять сердце вверх. Пронизыруйте сердце холодным PBS, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 5 мл. Perfuse, пока сердце появляется бланшированный в цвете.
  3. Снимите сердце и поместите в стерильную чашку Петри на льду.

3. Подготовка одноклеточной подвески

  1. Поместите части сердечной ткани человека (200 мг) или сердце мурин в стерильное блюдо Петри. Мелко фарш ткани с помощью стерильного лезвия или ножницы.
  2. Настройка пищеварений:
    1. Используйте окончательный объем пищеварения 3 мл на кусок сердечной ткани человека (200 мг) или на одно сердце мурина. Окончательные концентрации ферментов следующие: Коллагеназе1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
    2. Для каждой реакции пищеварения добавляйте DMEM и все ферменты в коническую трубку 15 мл. С помощью чистых щипцов, поместите мелко рубленые ткани в каждой реакционной трубки. Хорошо перемешайте нежным вихрем.
  3. Дайджест для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в тряся инкубаторе установлен на низкой и средней скорости возбуждения.
  4. После 1 ч пищеварения, вынуть трубки из инкубатора и поместить на лед. Установите 50 мл конических труб с 40 мкм ячейки ситечко на вершине. Влажные фильтры с 2 мл фермента деактивацивирования (ED) буфера.
  5. Деактивируйте ферменты пищеварения, добавив 8 мл буфера ЭД в каждую трубку пищеварения. Затем залить в результате 13 мл общей смеси через 40 мкм ячейки ситечко в 50 мл конических труб. Перенесите образцы обратно в свежую коническую трубку 15 мл. Это обеспечивает оптимальную пеллетирование клеток и сводит к минимуму потерю клеток во время центрифугирования.
  6. Спин образцы на 400 х г в течение 6 мин (Центрифуга установлен при 4 кв С). Откажитесь от супернатанта, оставляя 0,5 мл носителей. Отрежируйте клеточные гранулы нежным пайпетированием и добавьте 1 мл буфера асис-лисиса. Аккуратно закружайте трубку и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для выполнения красная кровь (РБК) лиза.
  7. После 5 минут в буфере ACK добавьте 9 мл DMEM в образец. Положите крышку обратно на трубки и осторожно инвертировать трубки, чтобы смешать, и фильтр через 40 мкм ячейки ситечко. Соберите фильтрат в 15 мл конических труб.
  8. Центрифуга труб на 400 х г в течение 6 мин и отбросить супернатант.
  9. Добавьте 1 мл буфера FACS и приостановите гранулы. Затем перенесите в клетки в буфере FACS в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Центрифуга снова на 400 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и отбросите гранулы в 100 л буфера FACS. Одноклеточная подвеска теперь готова к окрашиванию антител.

4. Запятнание антител

  1. Типичная панель антител человека состоит из следующих антител: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Добавьте все антитела к образцам сердца в 1:50 разбавления и инкубировать в течение 30-40 мин при 4 градусах По цельсию в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
  2. Для стромальных клеток (эндотелиальных клеток, фибробластов, гладких мышечных клеток) добавьте DRA-5 (1 ММ конечная концентрация) и CD45-percpCy5.5. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
  3. Для макрофагов сердца мурин добавляются следующие антитела: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 и Ly6G-FITC. Пожалуйста, обратитесь к таблице 2. Добавьте все антитела к образцам сердца в 1:100 разбавления и инкубировать в течение 30-40 мин при 4 градусах Цельсия в темноте. Приступайке к шагу 4.4 ниже.
  4. Дважды вымойте образцы в буфере FACS. Для каждой стирки добавьте 1 мл буфера FACS, аккуратно вихрь, и центрифуга на 400 х г в течение 5 минут, resuspend в 350 л буфера FACS и добавить DAPI (1 ММ, окончательная концентрация). Образцы теперь готовы для анализа/сортировки FACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол позволяет отделять макрофаги от мыши и миокарда человека. Используя тот же протокол, но с другой стратегией окрашивания и гатинга, стромальные клетки также могут быть собраны из миокарда человека. Результаты FACS, представленные здесь, были приобретены либо на платформе BD LSRII, либо на платформе BD FACS ARIA III. Компенсационный контроль был сформирован из одного цветоконтроля образцов из окрашенных спленоцитов. На рисунке 1 показано необ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол позволяет извлечения различных подмножеств макрофагов из миокарда человека. Протокол прост и занимает от 3 до 4 часов, чтобы подготовить одноклеточную подвеску, готовую к анализу FACS. Хотя протокол относительно прост в исполнении, есть определенные технические аспекты, которые необходимо учитывать, что позволит свести к минимуму изменчивость. Во-первых, для оптимальной жизнеспособности клеток необходима своевременная работа с человеческими тканями. Важно держать ткань в холодном сольном/HBSS для того чтобы свес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект стал возможным благодаря финансированию, предоставленному Детским институтом открытий Вашингтонского университета и Детской больницей Сент-Луиса (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Фондом Барнс-Еврейской больницы (8038-88) и NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. поддерживается NIH K08 HL123519 и Берроуз Добро пожаловать фонда (1014782).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конокальные трубки 15 млThermo Fisher14-959-53A
40 & микро; m Клеточные фильтрыThermo Fisher50-828-736
50 мл Конические пробиркиThermo Fisher352098
ACK Буфер для лизисаGibcoA10492-01
Бычья сыворотка АльбуминSigmaA2058
Коллагеназа 1SigmaC0130-1G
DAPIThermo FisherD1306
DMEM 1xGibco11965-084
DNAse 1SigmaD4527-20KU
DRAQ5Thermo Fisher62251
EDTA 0,5 м pH 8Corning46-034-CI
Фермент деактивирующий буфер490 мл HBSS, 10 мл FBS, 1 г BSA
FACS Буфер976 мл PBS, 20 мл FBS, 4 мл ЭДТА (0,5 М)
Фетальный Бычья сывороткаGibcoA3840201
щипцыVWR82027-406
HBSS 1xGibco14175-079
ГемостатыVWR63042-052
Гиалуронидаза типа 1-sSigmaH3506-500MG
PBS 1xGibco14190-136
Чашки ПетриThermo Fisher
Лезвие бритвыVWR55411-050
НожницыVWR82027-578
172931

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
  2. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  3. Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
  4. Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  5. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
  10. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FACS

Похожие статьи