Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гибридная система микроdrive с восстанавливаемым Opto-Silicon зондом и Tetrode для двойной-сайта высокой плотности записи в свободно движущихся мышей

10.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60028

⸱

10 августа 2019 г.

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает конструкцию гибридного массива микропривода, который позволяет имплантировать девять независимо регулируемых тетродов и один регулируемый опитро-кремний зонд в двух областях мозга в свободно движущихся мышах. Также продемонстрирован метод безопасного восстановления и повторного использования опито-кремниевого зонда для различных целей.

Аннотация

Многорегиональные нейронные записи могут предоставить важную информацию для понимания тонковременных взаимодействий между несколькими областями мозга. Тем не менее, обычные конструкции микропривода часто позволяют использовать только один тип электрода для записи из одного или нескольких регионов, ограничивая выход записей одного блока или глубины профиля. Он также часто ограничивает возможность комдота записей с оптогенетическими инструментами для целевой пути и / или типа клеток конкретной деятельности. Представлено здесь гибридный массив микроприводов для свободно движущихся мышей для оптимизации урожайности и описание его изготовления и повторного использования микропривода массива. Текущий дизайн использует девять тетродов и один опто-силиконовый зонд имплантируется в двух различных областях мозга одновременно в свободно движущихся мышей. тетроды и опто-силиконовый зонд независимо регулируются вдоль дорсовентальной оси в головном мозге, чтобы максимизировать выход единицы и колеи. Этот массив микроприводов также включает в себя настройку для света, посредничество оптогенетических манипуляций для изучения региональных или клеточных типов конкретных реакций и функций нейронных цепей дальнего радиуса действия. Кроме того, опто-силиконовый зонд можно безопасно восстановить и повторно использовать после каждого эксперимента. Поскольку массив микроприводов состоит из деталей, напечатанных на 3D-принтере, дизайн микродисков можно легко модифицировать с учетом различных параметров. Первый описан дизайн массива микропривода и как прикрепить оптическое волокно к кремниевому зонду для экспериментов оптогенетики, а затем изготовление тетродерас пучка и имплантации массива в мозг мыши. Запись локальных полевых потенциалов и единицы спайкинга в сочетании с оптогенетической стимуляцией также демонстрирует осуществимость системы микроприводов у свободно движущихся мышей.

Введение

Очень важно понять, как нейронная активность поддерживает когнитивные процессы, такие как обучение и память, исследуя, как различные регионы мозга динамически взаимодействуют друг с другом. Для выяснения динамики нейронной активности, лежащей в основе когнитивных задач, крупномасштабная внеклеточнаяэлектрофизиология была проведена у свободно движущихся животных с помощью микроприводных массивов 1,2,3, 4. В последние два десятилетия, несколько типов микроdrive массив арантом были разработаны для имплантации электродов в нескольких областях мозга для крыс5,6,7,8 и мышей9, 10 Лет , 11 Год , 12. Тем не менее, текущие конструкции микропривода, как правило, не позволяют использовать несколько типов зондов, заставляя исследователей выбирать единый тип электрода с конкретными преимуществами и ограничениями. Например, тетроде массивы хорошо работают для густонаселенных областей мозга, таких как дорсальный гиппокамп CA11,13, в то время как кремниевые зонды дают лучший геометрический профиль для изучения анатомических связей14 , 15.

Тетроды и кремниевые зонды часто используются для хронической записи in vivo, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Тетроды, как было доказано, имеют значительные преимущества в лучшей изоляции одного блока, чем одиночные электроды16,17, в дополнение к экономической эффективности и механической жесткости. Они также обеспечивают более высокую урожайность однойединицы деятельности в сочетании с микродисками 8,18,19,20. Важно увеличить количество одновременно зарегистрированных нейронов для понимания функции нейронных цепей21. Например, большое количество клеток необходимо для исследования небольших популяций функционально неоднородных типов клеток, таких как связанные с временем22 или вознаграждение кодирования23 ячеек. Гораздо больше ежеклеток требуется для улучшения качества расшифровки последовательностей шипов13,24,25.

Тетроды, однако, имеют недостаток в записи пространственно распределенных клеток, таких как в коре головного мозга или таламус. В отличие от тетродов, кремниевые зонды могут обеспечить пространственное распределение и взаимодействие локальных полевых потенциалов (LFPs) и пики деятельности в рамках локальной структуры14,26. Multi-хвостак кремния зонды дальнейшего увеличения числа записи сайтов и позволяют записи через отдельные или соседние структуры27. Однако такие массивы менее гибки в позиционировании участков электродов по сравнению с тетродами. Кроме того, в зондах высокой плотности требуются сложные алгоритмы сортировки шипов для извлечения информации о потенциалах действия соседних каналов для отражения данных, полученных тетродами28,29,30. Таким образом, общая доходность отдельных единиц часто меньше, чем тетроды. Кроме того, кремниевые зонды являются невыгодными из-за их хрупкости и высокой стоимости. Таким образом, выбор тетродпротив кремниевых зондов зависит от цели записи, которая заключается в том, является ли получение высокой доходности одноъюмносного или пространственного профилирования на сайтах записи приоритетом.

В дополнение к записи нейронной активности, оптогенетические манипуляции стал одним из наиболее мощных инструментов в неврологии, чтобы изучить, как конкретные типы клеток и / или пути способствуют нейронной цепи функции13,31, 32,33. Тем не менее, оптогенетические эксперименты требуют дополнительного рассмотрения в микроdrive массив астратива для присоединения волокна разъем для стимуляции источников света34,35,36. Часто соединение волоконно-оптической требует относительно большой силы, что может привести к механическому сдвигу зонда в головном мозге. Поэтому совместить имплантируемое оптическое волокно с обычными массивами микроприводов не является тривиальной задачей.

По вышеуказанным причинам исследователи должны оптимизировать выбор типа электрода или имплантировать оптическое волокно в зависимости от цели записи. Например тетроды используются для достижения более высокой урожайности единицы в гиппокампе1,13, в то время как кремниевые зонды используются для исследования ламинаров глубины профиля корковых областей, таких как медиальной энторинальной коры (MEC)37. В настоящее время, микродиски для одновременной имплантации тетродов и кремниевых зондов были зарегистрированы для крыс5,11. Тем не менее, это чрезвычайно сложно имплантировать несколько тетрод и кремниевых зондов в мышей из-за веса микродисков, ограниченное пространство на голове мыши, и пространственные требования для проектирования микропривода использовать различные зонды. Хотя можно имплантировать кремниевые зонды без микропривода, эта процедура не позволяет регулировки зонда и снижает скорость успеха восстановления кремниевого зонда12,38. Кроме того, оптогенетические эксперименты требуют дополнительных соображений при проектировании микроприводных массивов. Этот протокол демонстрирует, как построить и имплантировать микроприводный массив для хронической записи у свободно движущихся мышей, что позволяет имплантировать девять независимо регулируемых тетродов и один регулируемый опитро-кремний зонд. Этот массив микроприводов также облегчает оптогенетические эксперименты и восстановление кремниевого зонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Техаса Southwestern Medical Center.

1. Подготовка деталей микроприводного массива

  1. Печать деталей массива микропривода с помощью 3D-принтера с использованием зубной модели мелины(рисунок 1A,B). Убедитесь, что толщина отдельных 3D печатных слоев составляет менее 50 мкм, чтобы держать небольшие отверстия на печатных частях ясно и жизнеспособно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Массив микропривода состоит из пяти частей(Рисунок 1C):(1) основной корпус массива микропривода, который включает в себя девять микроприводных винтов для тетродов и один винт для кремниевого зонда (рисунок1Ca-d). Координация тетрод расслоения и отверстия для опто-силиконового зонда внизу зависит от координат области головного мозга(рисунок1Cd); (2) шаттл, чтобы прикрепить кремниевый зонд или optrode(Рисунок1Ce); (3) зонд электрического разъема крепления для хранения разъема кремниевого зонда(рисунок 1Cf); (4) держатель волокна ferrule который зажимы к центральной части тела для того чтобы предотвратить нежелательные движения имплантированного оптико-силиконового зонда затыкая/отключать разъем оптического волокна(рисунок1Cg); и (5) экранный конус, обеспечивающий физическую и электрическую защиту массива микроприводов для стабильной записи(рисунок 1Ch). Общий вес массива микропривода составляет 5,9 г, включая экранный конус(таблица 1). Если отверстия забиты в печатных частях, просверлить отверстия с помощью сверла бит: #76 для внутренних отверстий и #68 для внешних отверстий для тетрод-микропривод винты, #71 для tetrode микропривод-винт сторонник отверстие, и #77 для отверстий для направляющих столбов в нижней части тела.
  2. Вставка направляющих столбов в корпус массива микропривода.
    1. Вырежьте два 16 мм длины 26-Ga нержавеющей стали проволоки. Аккуратно оттачивать кончики проводов с помощью вращающейся шлифовальной машины.
    2. Вставьте провода в нижние отверстия тела(рисунок 2A). Нанесите небольшое количество клея цианоакрилата в нижней части тела, чтобы обеспечить руководство должностей.

2. Подготовка опто-силиконового зонда

  1. Подготовьте винт микропривода для кремниевого зонда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроприводный винт для кремниевого зонда состоит из пользовательского винта (300 мкм шаг), поддерживая поддержку трубки, и L-образная трубка (Рисунок 2B).
    1. Подготовка формы для микропривода голову(рисунок 2C). Чтобы построить форму, подготовить 3D-печать пластиковый узор микропривода(рисунок 2Ca). Затем, залить жидкий силиконовый гель после принятия височной стенки, поставив ленты вокруг картины. Удалить пузырьки воздуха, встряхивая осторожно, подождите, пока он вылечить, а затем удалить силиконовый гель формы из шаблона(рисунок 2Cb).
    2. Вырезать 18 мм и 9,5 мм длины 23 G нержавеющей проволоки с помощью роторной шлифовальной машины. Измельчите верхние 2-3 мм проводов с помощью роторной шлифовальной машины для повышения адгезии акрила зубов.
    3. Возьмите один пользовательский винт и применить небольшое количество кремниевого масла, чтобы уменьшить трение с акрилом зубов. Установите провода и пользовательский винт к плесени.
    4. Налейте зубной акрил в форму с помощью шприца для устранения пузырьков воздуха вокруг проводов и винтов. Загрязнение воздушного пузыря сделает микропривод хрупким. Подождите, пока акрил зубов полностью вылечить, а затем снять микропривод винты из формы. Согните 6 мм более длинного кончика провода под углом 60 градусов с помощью плоскогубцев.
    5. Проверьте качество винтов микропривода (например, трещины, пузырьки воздуха и трение), чтобы повернуть винт. Если есть высокое трение, поверните винт, пока они не станут гладкими с помощью электрического водителя винта с индивидуальным кончиком водителя, который соединяется с микроприводом винта.
    6. Установите винт микропривода в корпус массива микропривода, чтобы проверить, движется ли он вверх и вниз плавно, поворачивая винт. Нити для винта автоматически создаются при вставке винта в отверстие тела.
  2. Подготовка шаттла(рисунок 3Aa).
    1. Вырезать две 5 мм длины полиэтерэктона (PEEK) трубки с помощью острых ножниц. Выровнять трубы с обеих сторон шаттла. Клей трубки и шаттл с использованием эпоксидной смолы.
    2. Нанесите небольшое количество кремниевого масла на направляющие столбы. Проверьте качество шаттла, вставив на направляющие столбы корпуса микроприводного массива. Убедитесь, что шаттл движется плавно без чрезмерного трения.
  3. Подготовка оптород(Рисунок 3Ab). Этот шаг можно пропустить, если оптогенетический эксперимент не требуется.
    1. Расщепляйте оптическое волокно до 21 мм в длину с помощью рубиного резака. Измельчить кончик волокна, чтобы сделать кончик плоским и блестящим.
    2. Аккуратно поместите оптическое волокно на переднюю сторону кремниевого зонда. Наконечник волокна расположен на 200-300 мкм над верхней частью электродов. Временно удерживайте волокно прозрачной лентой.
    3. Приклейте оптическое волокно к основанию кремниевого зонда, используя небольшое количество эпоксидной смолы. Подождите, по крайней мере 5 ч, пока эпоксидная кислота полностью вылечить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется прикрепить оптическое волокно на той же стороне, что и электродные участки. Прикрепление волокна на задней стороне может предотвратить свет от правильного освещения записи сайтов.
  4. Прикрепите шаттл к кремниевому зонду(рисунок 3Ac):нанесите небольшое количество эпоксидной смолы в задней части основания кремниевого зонда. Прикрепите нижнюю часть шаттла к основанию кремниевого зонда и осторожно удерживайте в положении 2-3 мин, чтобы избежать образования зазора между шаттлом и базой кремниевого зонда во время первоначального лечения эпоксидной смолы. Подождите, по крайней мере 5 ч, пока эпоксидная кислота полностью вылечить.
  5. Аккуратно вставьте челночные трубки на направляющие столбы основного тела под микроскопом(рисунок 3B). Во время этой процедуры, удерживайте паз шаттла с тонкими пинцетом.
  6. Вставьте микропривод-винт в винтовую скважину, повернув винт. Занимайте кремниевый зонд и микропривод-винт, вставив кончик L-образной проволоки в паз головки шаттла(рисунок 3C).
  7. Прикрепите держатель электрического разъема зонда к корпусу массива микропривода(рисунок 3D).
    1. Вырезать два винта #0 до 3,5 мм длиной нити. Измельчить советы, чтобы удалить заусенцы.
    2. Поместите держатель разъема зонда на корпус. Поместите электрический разъем кремниевого зонда в держатель.
    3. Закрепите разъем кремния зонда в держателе с помощью эпоксидной смолы, и не приклеить его к корпусу массива микропривода, чтобы обеспечить процедуру восстановления кремниевого зонда. Вставьте винты, чтобы держать держатель разъема зонда.
  8. Прикрепите держатель феррула к опито-кремниевому зонду и корпусу массива микропривода(рисунок 3D).
    1. Вырезать два винта #0 до 6 мм длиной нити. Измельчить советы, чтобы удалить заусенцы.
    2. Измельчить за пределами двух #0 винтовка гайки, чтобы сделать небольшие гекс орехи с 2,5-3,0 мм внешнего диаметра, чтобы уменьшить вес и пространство.
    3. Вставьте винты в компонент А держателя. Клей винт головы с помощью эпоксидной смолы.
    4. Нанесите небольшое количество кремниевой смазки на компонент A и B, чтобы уменьшить трение с телом. Вставьте компонент А в тело, затем временно удерживайте с помощью обратных пинцетов.
    5. Поместите компонент B на винты компонента А. Нить настроенных орехов в винты. Используйте плоскогубцы, чтобы затянуть гайки, чтобы обеспечить феррульное держатель на теле.
    6. Вставьте волокна ferrule в паз волокна ferrule держатель (компонент B). Убедитесь, что волокна ferrule торчит 4-5 мм из держателя.
    7. Нанесите небольшое количество эпоксидной смолы между феррулем и держателем паз. Подождите, пока эпоксидная кислота полностью вылечится и убедитесь, что ферруле не двигается. Проверьте шаттл и феррульное держатель для плавного движения, ослабив гайки перед поворотом микропривод-винт.
    8. Проверьте рабочую дистанцию зонда. Убедитесь, что наконечник зонда полностью втягивается в тело, когда держатель феррула находится в верхнем положении, в то время как челночные трубы все еще связаны с направляющими столбами. Максимальное рабочее расстояние определяется длиной силиконового зонда и областью мозга цели.
    9. Если микропривод-винт свободен, нанесите небольшое количество зубного акрила вокруг винта, чтобы добавить больше нитей для поддержки. Когда он вылечится, поверните винт, чтобы проверить герметичность и стабильность.

3. Тетроде препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура похожа на ранее опубликованные статьи8,19,20,39.

  1. Подготовьте винты микропривода для тетрода. Микропривод для тетрода состоит из винта на заказ и 23 G трубки(рисунок 2B). Эта процедура аналогична разделу 2.1.
  2. Сделать пучок 30 G трубки из нержавеющей стали, который имеет 5,5 млн проволоки внутри. В этом случае было использовано в общей сложности девять труб 30 G (восемь записывающих тетродов и один эталонный электрод).
  3. Нить 30 G расслоение из нижней части корпуса привода, и закрепите их с 20 G тонкостенки труб к основному телу. Обрезать нижней части расслоения с роторной шлифовальной машины, чтобы сделать кончик даже и флеш. Обрезать верхнюю часть 30 G труб с роторной шлифовальной машины так, что 30 G трубки торчит около 0,5 мм от основного тела.
  4. Загрузите 5,5 млн полиимидных изоляционных труб в трубку 30 G. Подготовьте тетроды и загрузите их в 32-канальный электрический интерфейс (EIB). Проверьте электрическую связь с тестером impedance перед окончательным разрезом точности.
  5. Нижний электрод наконечник impedance до 250-350 кЗ с золотым покрытием раствора. Исправить все тетроды с суперклеем.
  6. Заполните чрезмерный зазор между полиимидной трубкой и тетрод минеральным маслом для герметизации и смазки. Маршрут наземного провода к ЕИБ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости оптическое волокно может быть интегрировано вдоль тетродовых проводов12.

4. Присоединение защитного конуса

  1. Краска серебра проводящих экранирования краски на внутренней стороне печатного конуса. Поместите массив микропривода внутри конуса(рисунок 3E).
  2. Вырезать два винта #0 до 3,5 мм длиной нити. Закрепите винты с внешней стороны конуса, чтобы удерживать массив микропривода на месте.
  3. Нанесите серебряную краску вокруг винта головой, чтобы электрически соединить экранирование конуса с электрической землей. Проверьте электрическую связь между наземным проводом и конусом. Нанесите небольшое количество эпоксидной смолы между телом массива микропривода и экранным конусом, чтобы надежно прикрепить тело.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Еще один способ подготовить щито-конус заключается в использовании алюминиевой ленты40 (рисунок 3F). Во-первых, подготовить шаблон бумаги для щито-конуса после прилипания алюминиевой фольги на бумаге(Рисунок 3Fa). Затем свернуть бумагу и прикрепить ее к корпусу микропривода, используя небольшое количество клея цианоакрилата(рисунок 3Fb). Вес этого конуса составляет 0,72 г, а общий вес массива микропривода уменьшается до 4,7 г(таблица1).

5. Имплантная хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура изменена из ранее опубликованных статей18,39,41 для двойной имплантации сайта. Убедитесь, что вес животного составляет более 25 г для микроприводного имплантата для более быстрого восстановления после операции.

  1. Подготовка
    1. Для подготовки молотого винта прикрепите серебряную проволоку к черепному винту и нанесите серебряную краску. Затем прикрепите золотую булавку к противоположной стороне провода, используя серебряную краску.
    2. Подготовьте адаптер диска для удержания массива микропривода к стереотаксическому устройству. Прикрепите мужской разъем к нержавеющей ручке с помощью эпоксидной смолы. Убедитесь, что выравнивание разъема и нержавеющей ручки является прямым.
    3. В случае, если гистологическое подтверждение необходимо после записи, применить Di-I к тетродам или задней части кремния-зонд38.
    4. Нижняя кремниевый зонд вниз, чтобы быть желаемой глубины. Освободите гайки держателя феррула с помощью плоскогубцев, опустите кремниевый зонд (опто-кремниевый зонд), повернув микропривод-винт кремниевого зонда, затем закрепите гайки, чтобы обеспечить держатель феррула. При имплантации тетродов в гиппокампе CA1 и кремниевого зонда в MEC расстояние между тетродейной канюлей и наконечником кремниевого зонда составляет 3-4 мм.
  2. Установите анестезирующую мышь (0,8%-1,5% изолюранивая) в стереотаксическом устройстве. Обезопажие состояние мыши подтверждается отсутствием рефлекса ног и щепотки. Нанесите на глаза чистую мазь, чтобы предотвратить высыхание. Обложка глаза с куском фольги для защиты от сильного хирургического воздействия света.
  3. Дезинфицировать кожу головы мыши с йодом и изопропанол после бритья меха. Сделайте разрез 1,5-2,0 см на коже головы с помощью стандартных хирургических ножниц, и удалить ткань над черепом с помощью ватных тампонов после подкожного применения лидокаина.
  4. Выровнять голову мыши со стереотаксическим инструментом. Убедитесь, что разница в высоте между брегма и лямбда составляет менее 100 мкм. Определите место расположения краниотомии с помощью атласа и пометьте эти места стерилизованными карандашами.
  5. Якорь черепа винты (0,8 мм в диаметре, 0,200 мм нить шаг) путем вращения их 1,5 поворотов (0,3 мм) на черепе, используя хирургические пинцеты и отвертку после бурения 8-11 отверстий в черепе с помощью 0,5 мм сверло бит.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2-4 отверстия в лобном черепе, 2-3 отверстия в каждой стороне теменной черепа, и 1-2 отверстия в межпалиетальном черепе предложены.
  6. Прикрепите наземный винт к отверстию, вращая его на один оборот (0,2 мм) после просверливания отверстия в межподерной кости. Убедитесь, что это отверстие не проникает через кость в мозг случае; в противном случае мозжечковые сигналы загрязнят запись. Убедитесь, что импедация составляет менее 20 кЗ на 1 кГц между наземным винтом и черепом винты с помощью impedance метр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более большие impedance причинят введение артефактов движения во время записи.
  7. Выполните краниотомию в отмеченных местах. Дура может быть оставлена нетронутой у мышей.
  8. Соедините мужской штифт наземного винта и наземный разъем микроприводного массива. Проверьте подключение с помощью счетчика импеданса, измеряя между наземным винтом и экранированием.
  9. Установите массив микропривода в адаптер, установите его на стереотаксисическое устройство и медленно опустите кремниевый зонд до нужной глубины. Убедитесь, что тетрод пучки находятся над поверхностью мозга, но все еще внутри массива микропривода, когда кремний зонд вставляется в мозг(рисунок 4A).
  10. Тщательно нанесите кремниевую смазку, чтобы запечатать область кремниевого зонда и тетрод пучка(рисунок 4B). Положите небольшое количество кремниевой смазки на кончике 20 G иглы и применить жир вокруг зондов с помощью иглы. Повторяйте до тех пор, пока кремниевая смазка полностью не покроет область вокруг зонда, чтобы акрил зубов не потечет на или под электродами/зондами. Будьте осторожны, чтобы не позволить жир коснуться электродов сайтов, в противном случае это резко увеличит препятствие записи сайтов.
  11. Применить акрила для фиксации микропривода массива на якорь винты в черепе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется применять акрил зубов в трех слоях, чтобы избежать чрезмерного тепла, вырабатываемого во время лечения акрила.
  12. Тщательно удалите адаптер из массива микроприводов. Вводят 1 мл PBS подкожно для предотвращения обезвоживания. Вводят 5 мг/кг мелоксикама подкожно в качестве обезболиваще.
  13. Обложка кремниевый зонд разъем кусок ленты, чтобы предотвратить любую грязь от попадания внутрь электрических соединений. Обложка микроприводмассива с помощью пластиковой парафина пленки и ленты его на месте.
  14. Администрирование надлежащего обезболивающее лечение в течение 3 дней (например, подкожные инъекции 2 мг/кг мелоксикама один раз в день). Разрешить 3-5 дней для восстановления до начала тетрод корректировки. Имплантированная мышь после восстановительного периода показана на рисунке 4C.

6. Восстановление кремниевого зонда (рисунок 4D)

  1. Вводят кетамин (75 мг/кг) и дексмедетомидин (1 мг/кг) анестезии интраперитонеально и подтвердили отсутствие рефлекса ног и щепотки. Исправить анестезирующую мышь, непосредственно пронизывая 4% параформальдегида через сердце с помощью капюшона. Хирургические методы для грызунов описаны ранее42.
  2. Освободите гайки держателя феррула с помощью плоскогубца. Затем осторожно переместите его в верхней части тела, повернув регулирующий винт, чтобы полностью втянуть кремниевый зонд внутрь тела массива микропривода. Закрепите гайки, чтобы держать зонд в верхней позиции.
  3. Возьмите мыши мозга из нижней части, растрескивая череп со стороны. Массив микропривода теперь отделен от животного.
  4. Полностью удалите L-образный микропривод-винт, который управляет кремниевым зондом. Освободить и вынуть орехи держателя ферруля с помощью плоскогубцев. Вынизвим компонент А держателя феррула.
  5. Отвинтите разъем зонда крепления и отсоединить от корпуса привода. Убедитесь, что монтирование разъема зонда может оторваться от корпуса массива микропривода.
  6. Держите верхнюю часть шаттла с помощью пинцета, а затем осторожно сдвиньте сборку кремниевого зонда из массива микропривода.
  7. Очистите кончик зонда с контактной линзы чище (сначала с ферментом, то 3% перекиси водорода) по крайней мере 1 день. Тщательно протрите наконечник электрода с помощью изопропанола прокладки под микроскопом. Храните зонд в коробке для хранения без статик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаттл и зонд разъем крепления остаются прикреплены к кремниевый зонд и могут быть повторно использованы в следующей имплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые кремниевые зонды не терпимы с перекисью водорода. В этом случае используйте раствор контактных линз, содержащий только протеолитический фермент.
  8. Для повторного использования микроприводного массива тела для следующей операции, удалить акрил зубов с помощью комбинации тонкой наконечник сверла и щипцы. Затем, восстановить черепа винты, погрузив удаленный акрил зубного в ацетон. Обратите внимание, что ацетон растворит пластиковые части массива микропривода.
  9. Удалите эпоксидную кислоту между телом микропривода и экранируя конус с помощью скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никакие дополнительные детали не должны быть напечатаны снова для следующей операции, если микропривод не сломан.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Микроприводный массив был построен в течение 5 дней. Хронология подготовки микропривода описана в таблице 2. Используя этот микродрайв, девять тетродов и один кремниевый зонд были имплантированы в гиппокампа CA1 и MEC мыши 21 недели старый/29 г массы тела мужского pOxr1-Cre (C57BL/6 фон)», соответственно. Эта трансгенная мышь выражает Cre в слое III MEC пирамидальных нейронов. Мышь была введена с 200 nL AAV5-DIO-ChR2-YFP (титр: 7,7 х 1012 gc/mL) в MEC 10 недель до имплантата электрода. LFPs бы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол демонстрирует, как построить и имплантировать гибридный массив микропривода, который позволяет записывать нейронные действия из двух областей мозга с помощью независимых регулируемых тетродов и кремния-зонда в свободно мейков. Он также демонстрирует оптогенетические эксперименты и восстановление кремниевого зонда после экспериментов. В то время как регулируемый кремниевый зонд33 или опто-силиконовый зонд36 имплантации ранее продемонстрированы у мышей, этот протокол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Японским обществом содействия научным стипендиям научных исследований (HO), Наделенной стипендией (ТЗ), Программой науки о границах человека (ТЗ), Фондом исследований мозга (ТЗ), Факультетом науки и технологий Приобретение и Приобретение Программа удержания (TK), Фонд исследований мозга и поведения (TK), и Грант исследований Фонда Sumitomo (JY), NARSAD Молодой исследователь исследований Грант (JY). Мы благодарим В. Маркса за ценные замечания и предложения во время подготовки рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#00-90 винтJ.I. Morris#00-90-1/8винты EIB
#0-80 гайкаМелкие деталиB00DGB7CT2латунная гайка для удержания держателя волоконного наконечника
#0-80 винтМелкие деталиB000FMZ57Gлатунный машинный винт для крепления разъема щупа, держатель волоконного наконечника и экранирующий конус
22 Ga полиэфирэфиркетоновые трубкиМелкие деталиSLPT-22-24для крепления к челноку, внутренний диаметр 0,025 дюйма 23
Ga нержавеющая трубкаМелкие деталиHTX-23Rдля тетрода
23 Ga нержавеющая проволокаМелкие деталиHTX-23R-24-10для L-образной/опорной проволоки
26 Ga нержавеющая проволокаМелкие деталиGWX-0200для направляющих столбов
30 Ga нержавеющая проволокаМелкие деталиHTX-30Rдля тетрода
Программный комплекс 3-D CADDassault Systè mesSolidWorks 2003
3D принтерFormLab Form2
5,5 мил полиимидные изоляционные трубкиHPC Medical72113900001-012
лента из алюминиевой фольгиTyco TycoAdhesives 617022 Лента из алюминиевой фольгидля альтернативного экранирующего конуса
проводящая пастаYSHIELDHSF54для экранирующего конуса
индивидуальные винты для силиконового зонда микроприводаAMTUNM1.25-HalfMoonполумесяц нержавеющий винт, диаметр 1,5 мм, 300 &; Винты с шагом резьбы по
индивидуальному заказу для тетрода микроприводAMTYamamoto_0000-160_9mmшлицевой нержавеющий винт, диаметр 0,5 мм, 160 &; m шаг резьбы, изготовленный на заказ по нашему дизайну
стоматологический акриловыйStoelting51459
стоматологическая модель смолаFormLabRS-F2-DMBE-02
Вращающийся инструмент Dremelмодель 800сверло для шлифовального
станкаFine Science Tool19007-05
электрическая интерфейсная доскаNeuralynxEIB-36-Narrow
эпоксиднаяDevconGLU-735.905 минут эпоксидная
мазь для глазDechraPuralube Офтальмологическая мазьдля предотвращения пересыхания глаз мышей во время операции
волокнистый полировальный листThorlabsLFG5Pдля полировки оптического волокна
тонкий пинцетProtech International15-368для загрузки/восстановления силиконового зонда
золота пиныNeuralynxEIB Pins Малый
заземляющий проводA-M Systems7815000,010 дюйма голый серебряный провод
предусилительпредусилителя NeuralynxHS-36
импедансBAK электроникаМодель IMP-21 кГц частота тестирования
минерального маслаZONA36-105для смазки винтов и проводов
оптического волокнаDoricMFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Система регистрацииNeuralynxDigital Lynx 4SX
рубиновое волокнописец ThorlabsS90Rдля расщепления оптического волокна
силиконовой смазкойFine Science Tool29051-45
силиконовый зондNeuronexusA1x32-Edge-5mm-20-177Рис. 3, 4A, 4B, 5
силиконовый зондNeuronexusA1x32-6mm-50-177Рис. 4C
силиконовый зонд моющий растворAlconAL10078844очиститель контактных линз
силиконовая смазкаSmooth-OnDragon Skin 10 FASTдля приготовления микропривода
серебряная краскаGC электронная22-023серебряная печать II покрытие, используется для заземления проводов
череп винтOtto Frei2647-10AC0,8 мм диаметр, 0,200 мм шаг нити
стандартные хирургические ножницыROBOZRS-5880
стереотаксический аппаратKopfModel 942
супер клейLoctiteLOC230992для нанесения на направляющие столбы
хирургический пинцетROBOZRS-5135
Tetrode TwisterJun YamamotoTT-01
Провода для тетродаSandvikPX000004
смола

Ссылки

  1. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
  2. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. The Journal of Neuroscience. 16 (2), 823-835 (1996).
  3. Keating, J. G., Gerstein, G. L. A chronic multi-electrode microdrive for small animals. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 201-206 (2002).
  4. Winson, J. A compact micro-electrode assembly for recording from the freely moving rat. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 35 (2), 215-217 (1973).
  5. Michon, F., et al. Integration of silicon-based neural probes and micro-drive arrays for chronic recording of large populations of neurons in behaving animals. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046018(2016).
  6. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
  7. Billard, M. W., Bahari, F., Kimbugwe, J., Alloway, K. D., Gluckman, B. J. The systemDrive: a Multisite, Multiregion Microdrive with Independent Drive Axis Angling for Chronic Multimodal Systems Neuroscience Recordings in Freely Behaving Animals. eNeuro. 5 (6), (2018).
  8. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  9. Lu, P. L., et al. Microdrive with Two Independent Moveable Sets for Wide-Ranging, Multi-Site, Multi-Channel Brain Recordings. Journal of Medical and Biological Engineering. 34 (4), 341-346 (2014).
  10. Haiss, F., Butovas, S. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
  11. Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Pare, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2721-2732 (2015).
  12. Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: an ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8(2013).
  13. Yamamoto, J., Tonegawa, S. Direct Medial Entorhinal Cortex Input to Hippocampal CA1 Is Crucial for Extended Quiet Awake Replay. Neuron. 96 (1), 217-227 (2017).
  14. Schomburg, E. W., et al. Theta phase segregation of input-specific gamma patterns in entorhinal-hippocampal networks. Neuron. 84 (2), 470-485 (2014).
  15. Fernandez-Ruiz, A., et al. Entorhinal-CA3 Dual-Input Control of Spike Timing in the Hippocampus by Theta-Gamma Coupling. Neuron. 93 (5), 1213-1226 (2017).
  16. Rey, H. G., Pedreira, C., Quian Quiroga, R. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119 (Pt B), 106-117 (2015).
  17. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. Journal of Neuroscience Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
  18. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  20. Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  21. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  22. Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321 (5894), 1322-1327 (2008).
  23. Gauthier, J. L., Tank, D. W. A Dedicated Population for Reward Coding in the Hippocampus. Neuron. 99 (1), 179-193 (2018).
  24. Davidson, T. J., Kloosterman, F., Wilson, M. A. Hippocampal replay of extended experience. Neuron. 63 (4), 497-507 (2009).
  25. Gerwinn, S., Macke, J., Bethge, M. Bayesian population decoding of spiking neurons. Frontiers in Computational Neuroscience. 3, 21(2009).
  26. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  27. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. Journal of Neurophysiology. 90 (2), 1314-1323 (2003).
  28. Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165-1174 (2016).
  29. Hilgen, G., et al. Unsupervised Spike Sorting for Large-Scale, High-Density Multielectrode Arrays. Cell Reports. 18 (10), 2521-2532 (2017).
  30. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  31. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001(2017).
  32. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  33. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
  34. Rangel Guerrero, D. K., Donnett, J. G., Csicsvari, J., Kovacs, K. A. Tetrode Recording from the Hippocampus of Behaving Mice Coupled with Four-Point-Irradiation Closed-Loop Optogenetics: A Technique to Study the Contribution of Hippocampal SWR Events to Learning. eNeuro. 5 (4), (2018).
  35. Liang, L., et al. Integrated and Quick-to-Assemble (SLIQ) Hyperdrives for Functional Circuit Dissection. Frontiers in Neural Circuits. 11, 8(2017).
  36. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773(2017).
  37. Quilichini, P., Sirota, A., Buzsaki, G. Intrinsic circuit organization and theta-gamma oscillation dynamics in the entorhinal cortex of the rat. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11128-11142 (2010).
  38. Sauer, J. F., Struber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  39. Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  40. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. Journal of Visualized Experiments. 91 (91), e51675(2014).
  41. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  43. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
  44. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. The European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  45. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 92-100 (2018).
  46. Jones, M. W., Wilson, M. A. Theta rhythms coordinate hippocampal-prefrontal interactions in a spatial memory task. PLoS Biology. 3 (12), e402(2005).
  47. Frank, L. M., Brown, E. N., Wilson, M. A. A comparison of the firing properties of putative excitatory and inhibitory neurons from CA1 and the entorhinal cortex. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 2029-2040 (2001).
  48. Kitamura, T., et al. Eng and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356 (6333), 73-78 (2017).
  49. McGaugh, J. L., Cahill, L., Roozendaal, B. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13508-13514 (1996).
  50. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304 (5672), 881-883 (2004).
  51. Mikulovic, S., et al. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 3 (1), 015002(2016).
  52. Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
  53. Meng, E., Hoang, T. MEMS-enabled implantable drug infusion pumps for laboratory animal research, preclinical, and clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1628-1638 (2012).
  54. Hu, S., et al. Dietary Fat, but Not Protein or Carbohydrate, Regulates Energy Intake and Causes Adiposity in Mice. Cell Metabolism. 28 (3), 415-431 (2018).
  55. Yang, Y., Smith, D. L. Jr, Keating, K. D., Allison, D. B., Nagy, T. R. Variations in body weight, food intake and body composition after long-term high-fat diet feeding in C57BL/6J mice. Obesity. 22 (10), 2147-2155 (2014).
  56. Morton, D. B., et al. Refinements in telemetry procedures. Seventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement, Part A. Laboratory Animals. 37 (4), 261-299 (2003).
  57. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  58. Lin, L., et al. Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 28-38 (2006).
  59. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869(2014).
  60. Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Запись тетрадамидвухточечная записьзапись нейронных цепейоптогенетическая стимуляциялокальные полевые потенциалыизвлечение кремниевых зондов3D-печатный микропривод
Гибридная система микроdrive с восстанавливаемым Opto-Silicon зондом и Tetrode для двойной-сайта высокой плотности записи в свободно движущихся мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.