Method Article

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамические белково-белковые взаимодействия контролируют клеточное поведение, от подвижности до репликации ДНК и сигнала трансдукции. Однако, мониторинг динамических взаимодействий между несколькими белками в сети взаимодействия белка технически трудно. Здесь мы представляем протокол количественного мультиплексного иммунопрециционного протеина (ЗМИ), который позволяет количественно оценивать изменения складов в белковых взаимодействиях на основе относительных измерений флуоресценции белков в общих комплексах, обнаруженных exposed Поверхностные эпитопы (PiSCES). В ЗМИ белковые комплексы из клеточных лисатов иммунопронифицируются на микросферы, а затем исследуются с помеченным антителом для другого белка, чтобы количественно оставить PiSCES. Иммунопрефференционные антитела спрягаются с различными спектральными областями MagBead, что позволяет цитометро потока дифференцировать несколько параллельных иммунопрециций и одновременно количественно количество антител зонда, связанных с каждым из них. ЗМИ не требует генетической маркировки и может быть выполнена с использованием минимального биоматериала по сравнению с другими методами иммунопреципции. ЗМИ может быть адаптирован атлетировал для любой определенной группы взаимодействующих белков, и до сих пор использовался для характеристики сигнальных сетей в Т-клетках и нейрональных синапсах глутамата. Результаты привели к порождению новых гипотез с потенциальным диагностическим и терапевтическим применением. Этот протокол включает в себя инструкции для выполнения ЗМИ, от первоначального выбора панели антител до беговых анализов и анализа данных. Первоначальная сборка асссея ЗМИ включает скрининговых антител для создания панели и эмпирически определение соответствующего буфера лиза. Последующий препарат реагента включает в себя ковалентно екосочетание иммунопрецитификации антител к MagBeads, и биотинилатации антител зонда, чтобы они могли быть помечены стрептавидин-конъюгированный фторофор. Для запуска асса, lysate смешивается с MagBeads ночь, а затем бисер делятся и инкубируются с различными антителами зонда, а затем флюорофор этикетки, и читать поток цитометрии. Для выявления PiSCES, которые значительно различаются между экспериментальными условиями, проводятся два статистических теста, и результаты визуализироваться с помощью тепловых карт или диаграмм узла.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамические белково-белковые взаимодействия представляют собой молекулярные сигнальные каскады имотил-структуры, которые являются функциональной основой большинства клеточной физиологии 1. Эти процессы часто изображаются как линейные сигнальные пути, которые переключаются между устойчивыми состояниями на основе одного ввода, но экспериментальные и модельные данные ясно показывают, что они функционируют как интегрированные сети2,3, 4. В случае G белков, различные рецепторы часто имеют возможность активировать тот же белок G, и один рецептор может такж....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ассаи дизайн

  1. Препарат антитела кандидата
    1. Для каждого интересуемого белка выберите от 3 до 5 антител для проверки. Когда это возможно, используйте моноклональные антитела, которые распознают различные эпитопы. Также включите одно неспецифическое антитело управления.
    2. Чтобы удалить Tris, выполните буферный обмен, добавив антитела к 30 kDa спин-фильтр, спиннинг до минимального объема, добавив 500 злител фосфат-буферных солив (PBS), и повторять 3 раза. Чтобы удалить белки носителя, выполняйте очистку антител в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу Материалов для конкретной рекомендации по очистке).
      ПРИМЕЧАН....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скрининг антител
Рисунок 2 B показывает результаты экрана для белка Connexin36. Большинство комбинаций IP-зондов не производят сигнала над элементами управления IgG. IP с моноклональным антителом 1E5 и зондом с 1E5 или поликлональным антителом 6200 производит сдвиг вправо в распределении биса по сравнению с контролем IgG. Здесь, IP 1E5 и зонд 6200poly были выбраны, чтобы избежать использования того же антитела, как IP и зонд, как уменьшить вероятность нес.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ ЗМИ требует значительных инвестиций в разработку антител панели, оборудование и реагенты, но как только анализ установлен, можно собирать высокомерные данные наблюдения белковых сетей взаимодействия, как они реагируют на экспериментально контролируемых Стимулы. Технически, ЗМИ требует тщательного пипетки и отслеживания образцов и антител хорошо местах. Тщательная маркировка анализ пластин полезно, как делает подробный шаблон хорошо местах на бумаге, которая затем сохраняется для анализа данных. Важность сохранения.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы отметить Тесса Дэвис за важный вклад в развитие исследования ЗМИ, а также нынешних и бывших членов лабораторий Смита и Шрума за техническое руководство и интеллектуальный вклад. Эта работа финансировалась NIMH гранты R01 MH113545 и R00 MH 102244.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-луночные планшеты с плоским дномBio Rad171025001
96-луночные ПЦР-планшетыVWR82006-704
Bioplex 200 Система с HTFBio Rad171000205модифицированы для хранения в частичном охлаждении, подробнее см. Рисунок S1
Моечная станция Bio-Plex Pro BioRad30034376
BSASigma
Шарики ХМЛInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex МикросферыLuminexMC12xxx-01xxx - это 3-значная область гранул
Melon Gel IgG Spin Purification KitThermo Scientific45206используется для очистки антител
MESSigmaM3671
Микропланшетная пленка, нестерильнаяСША Scientific2920-0000
Коктейль ингибиторов фосфотазы #2SigmaP5726
Коктейль ингибиторов протеазыSigmaP8340
Сэндвич Подготовка ХолодильникNorlakeSMP 36 15для индивидуального охлаждения Bioplex 200
Sodium фторидSigma201154
Ортованадат натрияSigma450243
Streptavidin-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
Tris Fisher ScientificBP152

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Co ImmunoprecipitationProtein Interaction NetworkQuantitative Multiplex ImmunoprecipitationFlow Cytometry AnalysisMagnetic Bead ImmunoprecipitationProtein Co AssociationsSignal Transduction SystemsAntibody Panel SelectionStreptavidin PE LabelingCytoscape Network Visualization

Related Articles