Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60031

⸱

19 октября 2019 г.

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом отчете мы описываем простой протокол для изучения невритовых наростов эмбриональных крысиных корковых нейронов путем совместного перевода с EGFP и белка, интересующего.

Аннотация

Невритный рост является фундаментальным событием в формировании нейронных цепей при развитии нервной системы. Тяжелые повреждения неврита и синаптической дисфункции происходят при различных нейродегенеративных заболеваниях и возрастной дегенерации. Исследование механизмов, которые регулируют невритный рост будет не только пролить ценный свет на процессы развития мозга, но и на такие неврологические расстройства. Из-за низкой эффективности трансфекции, в настоящее время сложно изучить влияние конкретного белка на нейрит нарост в первичных нейронов млекопитающих. Здесь мы описываем простой метод исследования невритовых наростов путем со-трансфекции первичных крысиных корковых нейронов с EGFP и белка, представляющих интерес (POI). Этот метод позволяет идентифицировать POI трансинфицированных нейронов через сигнал EGFP, и, таким образом, влияние POI на неврит рост может быть определена точно. Этот результат на основе EGFP обеспечивает удобный подход для исследования путей, регулирующих неврит.

Введение

Нейриты, включая аксоны и дендриты, являются проекциями нейронов, участвующих в создании нейронных сетей. Динамический рост невритов необходим для нейроразвития. Однако основные механизмы регулирования, лежащие в основе, остаются неясными. В частности, повреждение неврита часто наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях и после травм головного мозга1. Таким образом, исследование роли индикативных молекул в различных невритовых путях роста улучшило бы наше понимание процесса. Кроме того, он может выявить новые терапевтические цели для различных неврологических расстройств. Нейронные клеточные линии являются ценными моделями для изучения нейронных процессов, включая невритовый рост, поскольку они легко манипулировать и трансфекта2,3. Тем не менее, генетический дрейф, как сообщается, происходит в некоторых широко используемых клеточных линий, которые могут привести к изменениям в их физиологических реакций4. Кроме того, дифференциальная экспрессия белка была показана между нейрональными клеточными линиями и первичными нейронами. Например, PC12, нейрональной линии клеток, полученных из крыс надпочечников, которая широко используется для изучения неврит овых2,3, не выражает NMDA рецепторов5. Кроме того, было предложено, что снижение отзывчивости линии нейробластомы мыши нейробластомы нейро-2а к нейротоксинам по сравнению с первичными нейронами связано с отсутствием экспрессии определенных мембранных рецепторов и ионных каналов6. Таким образом, первичные нейроны являются более желательной и репрезентативной моделью для исследования невритовых наростов. Тем не менее, использование первичных нейронов препятствует их низкой эффективностью трансфекции7.

Здесь мы описываем метод, который включает в себя совместное трансфекцию белка, представляющих интерес (POI) и EGFP для первичных крыс корковых нейронов. EGFP действует как морфологический маркер для идентификации успешно трансинфицированных нейронов и позволяет измерять невриты. Мы подтвердили этот метод с помощью соединений / молекул, которые, как сообщается, модулировать неврит нарастания. Кроме того, FE65, нейрональный адаптер белка, который, как было показано, стимулировать неврит нарост, был использован, чтобы проиллюстрировать этот подход8,9. Этот протокол включает в себя (1) изоляцию первичных корковых нейронов от эмбриональных эмбрионов 18 (E18) крысиных эмбрионов, (2) совместное трансфекцию нейронов с EGFP и POI (FE65 в данном исследовании) и (3) визуализацию и анализ нейронов с помощью обработки изображений программное обеспечение ImageJ с плагином NeuronJ10,11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все последующие процедуры соответствовали этическим стандартам комитета по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга.

1. Подготовка заедок

  1. Поместите стерильный 18-мм круговой покрывало в каждый колодец 12-хорошей пластины культуры тканей.
  2. Пальто coverslip с 5 мг /мл поли-D-лизин раствор в увлажненный 37 C инкубатор, по крайней мере 1 ч.
  3. Аспирировать поли-D-лизина раствор из ткани культуры пластины и промыть покрытием охватывает один раз со стерильной водой.

2. Крыса эмбрионального нейронов Рассечение

  1. Пожертвуйте приурочен-беременной крысы Sprague-Dawley в гестационном возрасте 18 дней (E18) либо вывихшей шейки матки или CO2 удушья.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, проверьте местные правила для жертвоприношения беременных крыс.
  2. Откройте брюшную полость беременной крысы рассекающими ножницами и перенесите матку на 10 см чашку Петри.
  3. Откройте матку и амниотический мешок тщательно с небольшими вскрытия ножницами и удалить плаценту из эмбриона крысы с помощью небольших вскрытия ножницами. Перенесите весь эмбрион в 10-сантиметровую чашку Петри с предварительно охлажденным фосфатным солевым раствором, дополненным глюкозой (PBS-глюкоза, 10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мм хлорид калия, 140 мМ хлорид натрия и 3 г/л глюкозы) с помощью пары небольших щипц.
  4. Вырежьте вдоль сагитального шва черепа и тщательно откройте его парой маленьких рассекающих ножниц. Перенесите эмбриональный мозг с помощью небольшого плоского шпателя в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяной PBS-глюкозой.
  5. Отделите два полушария головного мозга от мозжечка и ствола мозга, используя два #5 пинцета под микроскопом вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите ссылку12 для структуры мозга крысы.
  6. Удалите оленя с помощью #5 пинцетом.
  7. Изолировать кору из полушарий головного мозга двумя прямыми #5 пинцетом.
  8. Перенос изолированной коры на ледяную PBS-глюкозу в центрифуге мощностью 15 мл.

3. Первичная кортикальная культура нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в шагах 3 и 4 выполняются в шкафу биобезопасности класса II.

  1. Поселите изолированную кору под действием силы тяжести при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут и аспирируй PBS-глюкозу.
  2. Добавьте 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в изолированную кору и аккуратно перемешайте, нажав и инкубировать ткани в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы обеспечить ферментативное пищеварение. Нажмите трубку осторожно, чтобы смешивания каждые 2 мин.
  3. Добавьте 4 мл среднего обслуживания (например, Нейробазальная среда) в ткань/трипсинную смесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся среда обслуживания, используемая в этом протоколе, дополняется пенициллином-стрептомицином и B-27дополнением 13.
  4. Мягко отмежевать ткань путем тритурации с помощью 1 мл пипетки.
  5. Пеллети разрозненные клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант.
  6. Повторите шаги от 3,5 до 3,7 дважды.
  7. Отрежь пеллетку клетки в 1 мл среды обслуживания.
  8. Добавьте 10 qL 0.4% Трипан Синий раствор 10 зл и суспензии клеток для подсчета жизнеспособных клеток гемоситометром.
  9. Плита нейронов при плотности 65000/cm2 (жизнеспособные клетки) в 1 мл поддержания среднего в хорошо в 12-хорошо пластины.

4. Трансфекция и фиксация клеток

  1. В течение 2 дней in vitro (DIV2) трансфект 0,5 мкг конструкции EGFP (pEGFP-C1) к нейронам вместе либо с 0,5 мкг POI с помощью 1 зЛ реагента трансфекционного реагента (например, Липофектамин 2000). Используйте инструкции производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Mammalian выражении конструкции были подготовлены с помощью эндотоксина свободной плазмид подготовки комплекта. Лечение химическими веществами/молекулами (в этой рукописи использовались цитошалазин D (Cyto D) и фактор роста нервов (NGF) можно сделать на 6 ч после трансфекции.
  2. Призадыхать культуры среды 24 ч после трансфекции и мыть транс-инфицированных клеток один раз с 37 КС PBS (10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мм хлорид калия, 140 мм хлорид натрия).
  3. Исправить клетки с 4% параформальдегида в PBS в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
  4. Вымойте фиксированные клетки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
  5. Добавьте минимальное количество флуоресценции монтажсреды на микроскоп стеклянной слайд. Аккуратно перенесите крышку из 12-колодца на монтажную среду с образцом, обращенным к стеклянной горке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Печать края крышки с лаком для ногтей, если aqueous монтаж среды используется.

5. Измерение нейрита

  1. Используйте 40-кратный объектив для захвата изображений с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
  2. Захват изображений, по крайней мере 40 нетронутых нейронов с сигналом EGFP на трансфекцию.
  3. Откройте захваченное изображение в программном обеспечении ImageJ с плагином NeuronJ11 для измерения длины самого длинного нейрита, от клеточного тела до кончика конуса роста, каждого изображенного нейрона.
  4. Проанализируйте данные, полученные с помощью программного обеспечения, чтобы определить влияние целевых белков в невритовых нарастаниях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы проверить эту методологию, мы использовали Cyto D и фактор роста нерва NGF, которые, как было показано, ингибируют и стимулируют невритный рост соответственно14,15,16. Длина неврита нейронов, трансфицированных EGFP, измерялась после лечения Сито D или NGF. Эффективность трансфекции EGFP к нейронам составила 2,7% (1068 нейронов подсчитано). Как показано на рисунке 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как указывалось ранее, PC12 и его подклоны широко используются для изучения расширения неврита, потому что они имеют отличную эффективность трансфекции2,3. В отличие от этого, первичные нейроны имеют низкий уровень трансфекции, который является основным препятствием для изучения нейрита нарастания регуляторов трансфекции7. Здесь мы описываем удобный протокол для количественной оценки невритного роста в первичных нейронах. Несмотря на низку...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана за счет средств Из Научно-исследовательского совета Гонконга, Фонда медицинских и медицинских исследований (Гонконг), схемы прямых грантов CUHK, Фонда пожертвований Объединенного колледжа и Благотворительного фонда TUYF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#5 ПинцетRegine5-COB
18 мм Круглая крышка SlipsThermo ScientificCB00180RAСтерилизовать перед использованием
B27 ДобавкаGibco17504044
Цитохалазин DИнвитрогенPHZ1063растворенный в ДМСО
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG8270
ДиметилсульфоксидSigma-AldrichD2650
Ножницы для препарирования, 10 смWorld Precision Instruments14393
Ножницы для препарирования, 12,5 смWorld Precision Instruments15922
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
Флуоресцентная монтажная средаDakoS302380
Липофектамин 2000 Transfection РеагентInvitrogen11668019
нейробазальная средаGibco21103049
NGF 2,5S нативный мышиный белокGibco13257019
Nugent Utility Manneps, 10 мм, прямой наконечникWorld Precision Instruments504489
параформальдегидомSigma-AldrichP6148
pEGFP-C1 Clontech#6084-1
pCI FE65См. артикулы 8 и 15
PBS ТаблеткиGibco18912014
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
Поли-D-лизина гидробромидSigma-AldrichP7280
ШпательSigma-AldrichS4147
Трипсин-ЭДТА (0.05%), фенол красныйGibco25300062
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061

Ссылки

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18(2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899(2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

EGFPImageJFE65
Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.