В этом протоколе лимфоциты помещаются в верхнюю камеру системы трансмиграции, отделенную от нижней камеры пористой мембраной. Хемокин добавляется в нижнюю камеру, что индуцирует активную миграцию вдоль градиента хемокина. После 48 ч лимфоциты учитываются в обеих камерах для количественной оценки трансмиграции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка миграции лимфоцитов в системе трансмиграции Ex Vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом случае мы представляем эффективный метод, который может быть выполнен с помощью базовых лабораторных навыков и материалов для оценки лимфоцитов хемокинетического движения в системе экс-виво-трансмиграции. Группа 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) и CD4T помощник клетки были выделены из селезенки и легких куриного яичного овальбумина (OVA) оспаривается BALB / c мышей. Мы подтвердили выражение CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2, сравнительно. CCL17 и CCL22 являются известными лигандами для CCR4; Поэтому, используя этот метод экс-виво-трансмиграции, мы изучили CCL17- и CCL22-индуцированное движение CCR4и лимфоцитов. Для установления градиентов хемокина, CCL17 и CCL22 были помещены в нижнюю камеру системы трансмиграции. Изолированные лимфоциты затем были добавлены в верхние камеры и в течение 48 ч период лимфоциты активно мигрировали через 3 мкм поры к хемокину в нижней камере. Это эффективная система определения хемокинетики лимфоцитов, но, понятно, не имитирует сложности, обнаруженные в микросреде органов in vivo. Это одно ограничение метода, который может быть преодолен путем добавления на месте изображения органа и лимфоцитов в исследовании. В отличие от этого метода является то, что может быть выполнена начального уровня техник на гораздо более экономически эффективным и в том, что такое живая визуализация. Как терапевтические соединения становятся доступными для повышения миграции, как и в случае опухоли инфильтрации цитотоксических иммунных клеток, или ингибировать миграцию, возможно, в случае аутоиммунных заболеваний, где иммунопатология вызывает озабоченность, этот метод может быть использован в качестве инструмент скрининга. В целом, метод эффективен, если хемокин интереса последовательно генерации хемокинетии на статистически более высоком уровне, чем контроль средств массовой информации. В таких случаях также может быть определена степень торможения/усиления данным соединением.
Введение
Этот оригинальный метод трансмиграции был представлен Стивен бойден в 1962 году в журнале экспериментальной медицины1. Многое из того, что мы знаем о химоксике и хемокинетике, было бы невозможно без развития Бойденской камеры. До открытия первого хемокина в 1977 году, ex vivo трансмиграции системы были использованы, чтобы узнать о сыворотки-факторов, которые могли бы остановить клеточное движение в макрофагах при одновременном усилении подвижности клеток в нейтрофилов1,2. Массивное богатство знаний было разработано в отношении миграции иммунных клеток, и на сегодняшний день, 47....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные здесь методы были рассмотрены и одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и использованию в Медицинском центре Университета штата Небраска (UNMC) и Университете штата
1. Установка и подготовка реагентов
-
Подготовьте полный RPMI (Розуэлл Парк Мемориальный институт) СМИ.
- Добавьте 10 мл теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) к 90 мл RPMI.
- Добавьте 1 мл 100-кратного пенициллина-стрептомицина-глютамина до 100 мл 10% FBS RPMI.
-
Подготовьте ILC2 Расширение Медиа.
- Добавьте Ил-2 и Ил-33 (20 нг/мл к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выражение CCR4 на CD4 "Т-клетки и ILC2.
Для успеха эксперимента ex vivo трансмиграции, необходимо определить, являются ли лимфоциты реагировать на CCL17 и CCL22 через CCR4; Поэтому мы определили экспрессию CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2 по цитометрии потока. Хотя хорошо известно, что OVA-специфические CD4и помощник Т-клетки выражают CCR4, меньше известно о выражении CCR4 на ILC2. На рисунке 1 показаны репрезентативные ре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом виде мы представляем устоявшийся метод оценки миграции лимфоцитов, индуцированной хемокином, в системе трансмиграции ex vivo. Есть несколько критических шагов в протоколе, первый из которых является проверка экспрессии правильного рецептора хемокина на иммунных клетках в эксперименте. В наших руках, мы выбрали CCR4 из-за тела литературы, которая подчеркивает важность CCR4 на Th2 помощник Т-клеток при аллергическом воспалении. Овальбумин индуцированных воспаление было показано ранее, чтобы быть ограничены по крайне.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют финансовой информации или конфликта интересов раскрыть.
Благодарности
Эта работа была профинансирована Американской ассоциацией легких (K.J.W.), Фондом Мемориала Евгения Кенни, присужденным T.A.W. и K.J.W., щедрой поддержкой стартапа от Университета штата юта для K.J.W., и наградой Департамента по делам ветеранов T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. является лауреатом премии научно-исследовательской карьеры (IK6 BX003781) от Департамента по делам ветеранов. Авторы хотят отметить редакционную помощь от г-жи Лизы Чудомелько. Авторы благодарят ядро ЦИтометрии потока UNMC за их поддержку в сборе данных цитометрии потока, генерируемых для этой рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,4% Трипановый синий | Сигма-Олдрич | 15250061 | |
| 1 мл шприц | BD Bioscience | 329424 | U-100 Шприцы Micro-Fine 28 г 1/2" 1cc |
| 100x Пенициллин-стрептомицин, L-глутамин | Gibco | 10378-016 | Разбавить до 1x в среде RPMI |
| 15 мл конические пробирки | Olympus Plastics | 28-101 | полипропиленовые трубки |
| 3 μ m transwell вставки | Genesee Scientific | 25-288 | 24-луночная пластина, содержащая 12 трансвелловых вставок |
| 3x стабилизирующий фиксирующий | BD Pharmigen | 338036 | Приготовить 1x раствор в соответствии с протоколом производителя |
| 5 мл полистирольные трубки | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 мл конические трубки | Olympus Plastics | 28-106 | полипропиленовые трубки |
| 8-камерный легкоразделительный магнит | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Лизинг Буфер | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Усовершенствованный клеточный фильтр, 40 μ m | Genesee Scientific | 25-375 | нейлоновая сетка, 40 μ m фильтры |
| Гидроксид алюминия, реагент марки | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 мг/мл |
| антимышиный CCR4; APC-сопряженный | Biolegend | 131211 | 0,5 g/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0,5 мкм; g/test |
| антимышиный CD11c; ПЭ eFluor 610 | Термофишер Научный | 61-0114-82 | 0,25 шт; g/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc блок | BD Pharmigen | 553141 | 0,5 мкм; g/test |
| антимышиный CD19; APC-eFluor 780 сопряженный | термофишер научный | 47-0193-82 | 0,5 μ g/test |
| антимышиный CD3; PE Cy 7-конъюгированный | BD Pharmigen | 552774 | 0,25 гкм; g/test |
| антимышиный CD45; ПЭ конъюгированный | BD Pharmigen | 56087 | 0,5 μ g/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 μ g/test |
| антимышиный NK1.1 (CD161); ФИТК-конъюгированный | BD Pharmigen | 553164 | 0,25 гкм; g/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 конъюгированный | Biolegend | 145311 | 0,5 μ g/test |
| Автоматический счетчик клеток | BIORAD | 1450102 | |
| Автоматический диссоциатор | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Бычья сыворотка Альбумин, лиофилизированный порошок | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0,5% в сыворотке RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Овальбумин куриного яйца, Grade V | Sigma-Aldrich | А5503-10G | 500 г/мл |
| коллагеназы, тип 1, фильтрованный | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, купить в виде 5 флаконов по 50 мг (LS004216) | 25 ед/мл в гранулах компенсации RPMI |
| Affymetrix | 01-1111-41 | 1 капля на контрольную пробирку | |
| Диссоциационные трубки | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, с азидом натрия; хранится при температуре 4°С; |
| C Инактивированный при нагревании - FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% в полном объеме RPMI & ILC2 Expansion Media |
| Mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 нг/мл |
| Мышь CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 нг/мл |
| Мышь CD4+ Набор для обогащения Т-клеток | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| Мышь IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 нг/мл |
| Набор для обогащения мышей ILC2 | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| Мышиный рекомбинантный IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 нг/мл |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Разделительный буфер | STEM Cell Technologies | 20144 | 1x PBS + 2% FBS; хранение при 4&�; C |
| Небулайзер и камера для мелких животных | Data Sciences International | ||
| Sterile Salt | Baxter | 2F7124; НДЦ 0338-0048-04 | 0,9% натрия хлорид |
Ссылки
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Imm....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
