Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка миграции лимфоцитов в системе трансмиграции Ex Vivo

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60060

⸱

20 сентября 2019 г.

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе лимфоциты помещаются в верхнюю камеру системы трансмиграции, отделенную от нижней камеры пористой мембраной. Хемокин добавляется в нижнюю камеру, что индуцирует активную миграцию вдоль градиента хемокина. После 48 ч лимфоциты учитываются в обеих камерах для количественной оценки трансмиграции.

Аннотация

В этом случае мы представляем эффективный метод, который может быть выполнен с помощью базовых лабораторных навыков и материалов для оценки лимфоцитов хемокинетического движения в системе экс-виво-трансмиграции. Группа 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) и CD4T помощник клетки были выделены из селезенки и легких куриного яичного овальбумина (OVA) оспаривается BALB / c мышей. Мы подтвердили выражение CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2, сравнительно. CCL17 и CCL22 являются известными лигандами для CCR4; Поэтому, используя этот метод экс-виво-трансмиграции, мы изучили CCL17- и CCL22-индуцированное движение CCR4и лимфоцитов. Для установления градиентов хемокина, CCL17 и CCL22 были помещены в нижнюю камеру системы трансмиграции. Изолированные лимфоциты затем были добавлены в верхние камеры и в течение 48 ч период лимфоциты активно мигрировали через 3 мкм поры к хемокину в нижней камере. Это эффективная система определения хемокинетики лимфоцитов, но, понятно, не имитирует сложности, обнаруженные в микросреде органов in vivo. Это одно ограничение метода, который может быть преодолен путем добавления на месте изображения органа и лимфоцитов в исследовании. В отличие от этого метода является то, что может быть выполнена начального уровня техник на гораздо более экономически эффективным и в том, что такое живая визуализация. Как терапевтические соединения становятся доступными для повышения миграции, как и в случае опухоли инфильтрации цитотоксических иммунных клеток, или ингибировать миграцию, возможно, в случае аутоиммунных заболеваний, где иммунопатология вызывает озабоченность, этот метод может быть использован в качестве инструмент скрининга. В целом, метод эффективен, если хемокин интереса последовательно генерации хемокинетии на статистически более высоком уровне, чем контроль средств массовой информации. В таких случаях также может быть определена степень торможения/усиления данным соединением.

Введение

Этот оригинальный метод трансмиграции был представлен Стивен бойден в 1962 году в журнале экспериментальной медицины1. Многое из того, что мы знаем о химоксике и хемокинетике, было бы невозможно без развития Бойденской камеры. До открытия первого хемокина в 1977 году, ex vivo трансмиграции системы были использованы, чтобы узнать о сыворотки-факторов, которые могли бы остановить клеточное движение в макрофагах при одновременном усилении подвижности клеток в нейтрофилов1,2. Массивное богатство знаний было разработано в отношении миграции иммунных клеток, и на сегодняшний день, 47 хемокины в настоящее время обнаружены с 19 соответствующих рецепторов3,4. Кроме того, множество ингибиторов /усилителей этих хемокиновых путей претерпели развитие в терапевтических целях5,6,7,8. Многие из этих соединений были протестированы в аналогичных камерах трансмиграции, чтобы понять прямое взаимодействие между соединениями и иммунной реакции клеток к данному хемокину9.

Трансмиграция, или диапедез, в воспаленные ткани является важным процессом для здорового воспалительного ответа на ясную инфекцию10,11. Камера Бойдена, трансмиграционная система или трансвелл-аппарат, как правило, состоят из двух камер, разделенных пористой мембраной1,12. Нижняя камера чаще всего содержит средства, содержащие хемокин интерес, в то время как лейкоциты помещаются в верхней камере. Размер поры в мембране может быть выбран в зависимости от размера клетки интереса. Для этого проекта мы выбрали пористую мембрану площадью 3 мкм, так как лимфоидные клетки имеют размер 7-20 мкм в зависимости от стадии клеточного развития. Этот размер пор гарантирует, что эти клетки не пассивно падают через поры, но что они активно мигрируют в ответ на градиент хемокина.

Основным преимуществом этого протокола является его рентабельность. Инвиво трансмиграция трудна, потому что она требует обширной подготовки в области обращения с животными и хирургии, и часто включает в себя мощную микроскопию, которая не всегда доступна исследователю. Экономически эффективный скрининг соединений, которые, как считается, усиливают или подавляют трансмиграцию, может быть выполнен до создания in vivo изображений. Поскольку система трансмиграции жестко контролируется, клетки могут быть обработаны сначала затем добавлены в трансвелл аппарат, или, наоборот, хемокин может рассматриваться сначала с ингибитором хемокина, а затем клетки, добавленные в трансвелл аппарата. Наконец, эндотелиальные клетки и/или белки мембраны в подвале могут быть добавлены в нижней части вставки трансуэлла за 1-2 дня до эксперимента по трансмиграции, чтобы понять, как эти барьерные клетки существуют в химиокинетике. Опять же, эти манипуляции системы обеспечивают мощное средство определения важной информации об эффективности данного соединения до более сложных исследований in vivo.

Использование системы камер ы трансмиграции является эффективным способом оценки подвижности лимфоцитов в различных условиях in vivo и in vitro12,13,14. В этом мы описываем оптимизированный метод оценки реакции экзиво-лимфоцитов к хемокины в камере трансмиграции. В этом примере эксперимента, CD4и Т-клеток и группы 2 врожденных лимфоидных клеток (ILC2) были изолированы от мужчин и женщин, BALB /c мышей после ova-аллерген воздействия. Была выдвинута гипотеза о том, что CCR4и CD45- Lineage- (LIN-) ILC2 от аллергенов-проблемных мышей будут мигрировать более эффективно к CCL17 и CCL22, чем CCR4и CD4и T клетки-помощники. CCL17 и CCL22 являются хемокины обычно производятся дендритных клеток и макрофагов М2 (аллергический) фенотип, среди других клеток, в аллергии15,16. CCL17 и CCL22 можно рассматривать как биомаркеры аллергического воспаления, поскольку они легко обнаруживаются в легких во время обострений дыхательных путей16,17,18. Важно отметить, что выражение CCR4 повышено по сравнению с необработанным контролем, как показано в биоинформатичных данных, полученных из ILC2, изолированных от домашней пыли клеща обработанных животных, и аналогичным образом ILC2 от наивных животных, обработанных ex vivo с IL-33 ( аллерген-сопродвигая врожденный цитокин) upregulates CCR419,20. Кроме того, согласно данным для ILC2 в базе данных Проекта иммунологического генома (www.immgen.org), CCR4 mRNA высоко выражен в этих врожденных иммунных клетках. На сегодняшний день мало что известно о торговле ILC2 в тканях, но вполне вероятно, что ILC2 и CD4- Т-клетки используют аналогичные хемокины и рецепторы для хемотаксиса и хемокинетики, поскольку они выражают аналогичные транскрипционные факторы и рецепторы. Таким образом, мы сравнили CCL17 по сравнению с отзывчивостью CCL22, iLC2 и CD4и T лимфоцитов, как от мужчин, так и от женщин, с ova-challenged животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были рассмотрены и одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и использованию в Медицинском центре Университета штата Небраска (UNMC) и Университете штата

1. Установка и подготовка реагентов

  1. Подготовьте полный RPMI (Розуэлл Парк Мемориальный институт) СМИ.
    1. Добавьте 10 мл теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) к 90 мл RPMI.
    2. Добавьте 1 мл 100-кратного пенициллина-стрептомицина-глютамина до 100 мл 10% FBS RPMI.
  2. Подготовьте ILC2 Расширение Медиа.
    1. Добавьте Ил-2 и Ил-33 (20 нг/мл каждый цитокин) до 10 мл полного RPMI.
    2. Если запас цитокинов 10 мкг/мл, то пипетка 20 л ИЛ-2 и Ил-33 в трубку 15 мл, содержащую 10 мл полных носителей RPMI.
  3. Подготовка легких диссоциации Medium.
    1. Добавьте 50 мг коллагеназы типа 1 в 250 мл недополненного RPMI.
    2. Добавьте 2,5 мл 100-кратного пенициллина-стрептомицина-глютамина в 250 мл носителей в шаге 1.3.1.
    3. Аккуратно перемешайте носители, чтобы обеспечить полное растворение коллагеназы типа 1 перед использованием.
  4. Подготовка безсыворотки RPMI.
    1. Разбавить 1 г лиофилизированного сыворотки крупного рогатого скота альбумина (BSA) в 200 мл RPMI.
    2. Добавьте 2 мл 100-кратного пенициллина-стрептомицина-глютамина.
    3. Аккуратно перемешайте средства массовой информации, чтобы обеспечить полное растворение BSA в средствах массовой информации перед использованием.
  5. Подготовка миграции Medium с CCL17.
    1. Приобретите 10 мл безсыворотки RPMI и добавьте CCL17 (50 нг/мл).
      1. Если запас CCL17 составляет 10 мкг/мл, добавьте 50 кЛ запасов CCL17 к 10 мл безсыворотки RPMI средств массовой информации.
  6. Подготовка миграционных средних с CCL22.
    1. Приобретите 10 мл безсыворотки RPMI и добавьте CCL22 (50 нг/мл).
    2. Если запас CCL22 составляет 10 мкг/мл, добавьте 50 кЛ запасов CCL22 к 10 мл безсыворотки RPMI средств массовой информации.
  7. Подготовка CCR4 Антитела запятнать коктейль.
    1. Всего для 10 тестов добавьте 5 кЛ каждого из следующих антител в трубку 5 мл: анти-мышонок CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 и ICOS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример того, как сделать коктейль из антител для 10 образцов: 0,5 л каждого образца антитела х 10 и 5 л каждого из антител, перечисленных в 1.7.1.
    2. Для 10 тестов всего, добавить 2,5 л следующих антител к антител коктейль от шага 1.7.1: анти-мышь CD3, CD11c, и NK1.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример для завершения антитела коктейль для 10 образцов: 0,25 л х 10 образцов 2,5 л CD3, CD11c и NK1.1 антител.
    3. Храните CCR4 Antibody запятнание коктейль на 4 кв с до готовности, чтобы добавить в образцы. Откажитесь от антител коктейль после 1 недели, если не используется.
  8. Подготовка 1x Стабилизация Фиксация.
    1. Добавьте 10 мл деионизированной дистиллированной воды в 5 мл 3x стабилизирующего фиксаторного концентрата

2. Подготовка аллергенов оспаривается BALB/c мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Мужские и женские мыши BALB/c были приобретены у Чарльз Ривер (UNMC) или Jackson Laboratories (Университет штата

  1. После акклиматизации (1 неделя) инсугенифицируют всех животных до OVA.
    1. Смешайте 100 мкг/мл OVA адсорбируется с гидроксидом алюминия (20 мг/мл) в проистиреновой трубке 5 мл.
    2. Смешайте трубку и сразу же нарисуйте 500 кл/л подвески OVA-alum в 1 мл шприца 28 Г (инсулиновый шприц).
    3. Поместите мышь в банку колокола, содержащую изофлуран (1-2 мл под ложным полом, так что животное не стоит прямо в изофлуран). Разрешить мыши идти под наркозом в течение примерно 1-2 мин, или до тех пор, пока скорость дыхания падает.
    4. Быстро подберите мышь мехом на спине и плечах и введите 100 зл и вводите 100 л OVA-alum intraperitoneally на мышь21,22.
    5. Поместите мышь обратно в клетку и смотреть, чтобы убедиться, что они восстановить мобильность; это должно произойти в течение 2-5 минут.
  2. Через семь дней после сенсибилизации, подвергать всех животных интраназальной (т.е.) 1,5% OVA разбавленной в стерильных солизных растворов в камере распылительной (Data Sciences International) в течение 20 минут.
    1. Удалить мышей из их клеток и поместить их в камеру распылительной животных. Закройте крышку на камеру.
    2. Прикрепите шланг для распыления к вхотворному носику на камере распылительности.
    3. Добавьте 30 мл из 1,5% OVA, разбавленного стерильным сольником, в чашку распылителя на небулайзере.
    4. Включите небулайзер и дайте камере заполниться туманом в течение 20 минут.
    5. Выключите небулайзер и дайте туману осесть.
    6. Возвращение животных в клетки.
  3. Повторите шаг 2.2 в общей сложности 5 раз, в 5 дней подряд, чтобы вызвать аллергическое воспаление.

3. Изоляция CD4- Т-клеток от селезенки и легких мышей, бросаемых вызов OVA

  1. Гуманно эвтаназии всех OVA-обработанных мужчин и женщин животных CO2 асфиксии в соответствии с утвержденными протоколами IACUC, используя от 2 до 3 животных на группу, в эксперименте.
  2. Акцизные легкие и селезенки от животных и место тканей в отдельных диссоциационных труб на основе типа ткани и пола животного23.
  3. Диссоциация легочной ткани в 500 ЗЛ средств диссоциации легких (25 U/mL; коллагеназа, тип 1) в автоматизированном диссоциаторе ткани с использованием протокола «легких».
    1. Повторите 3,2 и 3,3 в общей сложности два раза.
  4. Диссоциатив селезенки ткани в 500 Л полных носителей RPMI с использованием "селезенки" протокол на автоматизированной ткани диссоциатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные шаги должны выполняться в шкафу биологической безопасности с использованием стерильной техники.
  5. Промыть диссоциационные трубки, содержащие легкие и селезенки гомогенаты с 5 мл дополнительных средств диссоциации легких или Полный RPMI, соответственно.
  6. Фильтр ячейки суспензии через 40 мкм ячейки ситечко и собирать в 50 мл конических труб.
  7. Инкубировать легких гомогенатов в течение 15-30 мин в 37 КС инкубатор с 5% CO2 для дальнейшего диссоциации легочной ткани.
  8. Добавьте 5 мл полного RPMI в легкие и селезенки гомогенаты и гранулы клетки в нижней части 50 мл труб с помощью центрифугации; 378 х г при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
  9. Объедините спленоциты и клетки легких в одну коническую трубку 50 мл и определите общее количество клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  10. Отрегулируйте мужскую и женскую суспензию клеток до 1 х 108 ячеек/мл в буфере разделения и добавьте в произносную трубку 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол обогащения может быть скорректирован до 14 мл полистироловых труб, когда больше клеток приобретаются из селезенки и легких. Этот протокол был разработан для тканей от 2-3 мышей на группу; поэтому трубки 5 мл должно хватить.
  11. Используйте примерно две трети от общего числа ячеек для изоляции ILC2 в соответствии с протоколом обогащения ILC2.
    1. Добавьте коктейль из антител (50 л/мл) в клеточную подвеску и инкубируйте в течение 5 мин на РТ.
    2. Вихрь быстрых сфер на 30 с и добавить в образец в размере 75 л/мл клеточной подвески. Аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 5 мин на RT.
    3. Топ трубки до 3 мл общего объема с буфером разделения и место в 8-камерный легкий магнит разделения. Инкубировать в течение 3 мин на RT.
    4. Наклоните магнит вперед (вдали от сферы-антитела-клеточных комплексов, прилипаемых к задней части трубки) и пипетки от клеточной подвески в чистую трубку 5 мл.
    5. Добавьте 1,5 мл полного RPMI в трубки и центрифугу при 378 х г в течение 5 минут на RT.
    6. Вылейте средства массовой информации из клеточной гранулы и повторно ILC2 на 1 х 107 ячеек на мл.
    7. Поместите 100 uL мужского и женского ILC2 на скважину в U-дно, 96-колодцов пластины и добавить 100 л ILC2 Расширение Сми для каждого колодца.
    8. Инкубировать клетки в течение 4-5 дней, чтобы расширить ILC2.
    9. Соберите ILC2 в трубку 5 мл и добавьте до 4,5 мл RPMI без сыворотки. Центрифуги клетки на 378 х г в течение 5 мин на RT.
    10. Подсчитайте клетки с помощью гемакитометра и переприимся те на 1 х 107 ILC2 на мл в сывороточном rpMI.
  12. Используйте оставшиеся ячейки для процедуры изоляции клеток CD4и Т, которая проводится в соответствии с протоколом изоляции клеток мыши CD4и T-клеток с несколькими изменениями.
    1. Добавьте крысиную сыворотку (50 л/мл) в суспензию обогащения клеток CD4 T.
    2. Добавьте коктейль Изоляции (50 л/мл) в образец и инкубировать в течение 10 минут на РТ.
    3. Вихрь быстрых сфер на 30 с и добавить в образец со скоростью 75 л/мл.
    4. Аккуратно перемешайте клеточную подвеску и инкубину в течение 2,5 мин и RT
    5. Топ образцов до 3 мл и место 5 мл труб в 8-камерный легкий магнит разделения и инкубировать в течение 5 минут на RT.
    6. Наконечник магнита вперед и пипетка подвески клетки в чистую трубку 5 мл.
    7. Добавьте 1,5 мл RPMI без сыворотки в трубки и центрифугу при 378 х г в течение 5 мин на РТ.
    8. Слейте средства массовой информации из клеток гранулы и resuspend CD4и Т-клеток на 1 х 107 клеток на мл в сыворотке свободной RPMI.

4. Определите CCR4 Выражение на CD4и Т-клетках и группе 2 Врожденных лимфоидных ячеек (ILC2) от OVA-оспоренных животных с помощью цитометрии потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут быть выполнены на открытой скамейке сверху, поскольку они являются нестерильной техники.

  1. Приобретайте примерно 1-2,5 х 105 ILC2 ячеек от шага 3.11.10 и 1-2.5 x 106 CD4и Т-клеток от шага 3.12.8 в отдельных трубках 5 мл.
    1. Держите дополнительную трубку, по крайней мере 5,0 х 104 CD4 "Т-клеток в качестве неокрашенного контроля.
  2. Приостановить клетки в 100-200 л буфера FACS и добавить 1 зл и L Fc Block в каждой трубке, а затем инкубировать на льду (или в холодильнике 4 кВ) в течение 10 минут.
  3. Добавьте 1-2 мл буфера FACS к каждой трубке и центрифуге при 378 х г в течение 5 минут на RT.
  4. Слейте супернатант и resuspend клетки в 100-200 Л л FACS буфера.
  5. Добавьте 37,5 зл и л из коктейля CCR4 Antibody, запачкав оговорение клеток, в каждой трубке, кроме трубки, содержащей «неокрашенные» клетки.
  6. Инкубировать трубки на льду, или в холодильнике 4 градусов по Цельсию, в течение 20-30 мин.
  7. Добавьте 1-2 мл буфера FACS к каждой трубке и центрифуге при 378 х г в течение 5 минут на RT.
  8. Налейте супернатант.
  9. Повторите шаги 4.7 и 4.8.
  10. Добавьте в каждую трубку 250-300 л 1x стабилизирующего фиксатора (см. Таблица Материалов).
  11. Подготовка одноцветных бисера управления для каждого антитела в CCR4 антитела коктейль в соответствии с протоколом, предусмотренным компенсации бусы.
    1. Vortex компенсации бусы.
    2. Добавьте одну каплю бисера к каждой одноцветной контрольной трубке.
    3. Добавьте 1 зл каждого антитела в коктейль CCR4 Antibody к своей собственной помеченной трубке.
    4. Аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут в холодильнике 4 градусов по Цельсию или на льду.
    5. Добавьте 1-2 мл буфера FACS ко всем трубкам и центрифуге при 378 х г в течение 5 мин на RT.
    6. Слейте супернатант и resuspend бусы в 200 л буфера FACS.
    7. Охладите одноцветные элементы управления до тех пор, пока все образцы не будут окрашены и готовы к анализу на цитометре потока.
  12. Проанализируйте неокрашенные клетки, одноцветные элементы управления и экспериментальные образцы на цитометре потока в пределах 24 ч от фиксации.

5. Процедура трансмиграции Ex Vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности, так как они требуют стерильной техники.

  1. Приобретите ILC2 от ячеек шага 3.11.10 и CD4 T со ступени 3.12.8 и определите количество вставок Transwell, необходимых для эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример: Для 1,2 мл обогащенных КЛЕТОк CD4 Т от шага 3.12.8, размножить 1,2 х 1000 л и 1200 л; затем разделить 1200 uL на 100 qL и 12, количество вставок, необходимых для трансмиграции CD4 T.
  2. Аккуратно переместите 3 мкм трансвелл вставки из средних рядов 24-хорошо пластины.
  3. Добавьте 500 л миграционных носителей с CCL17 примерно к одной трети скважин.
  4. Добавьте 500 л миграционных носителей с CCL22 еще на одну треть скважин.
  5. Добавьте 500 л RPMI без сыворотки, не содержащую хемокина, к последней трети скважин.
  6. Четко наметьте крышку на тарелку соответствующими средствами миграции, размещенными в нижних колодцах.
  7. Поместите трансвелл вставки обратно в колодцы, содержащие различные процедуры.
  8. Аккуратно добавьте 100 л из CD4 Т-клеток или ILC2 в верхний колодец каждой вставки. Не смешивайте или пипетка подвески клетки вверх и вниз в transwells, так как это может сбить с ног на результаты эксперимента.
  9. Четко обозначите крышку пластины с типом клеток, помещенным в каждый колодец, и напишите дату и время суток, что клетки были добавлены.
  10. Повторите шаги от 5,2 до 5,9 до тех пор, пока все ячейки не будут помещены в вставки трансвелл со средствами массовой информации.
  11. Аккуратно поместите тарелку в инкубатор 37 градусов с 5% CO2 на 48 ч. Минимизируйте контакт с пластиной в течение инкубационного периода.

6. Количественная оценка трансмиграции Ex Vivo

  1. Аккуратно удалите пластину из инкубатора и удалите все вставки трансвелл из средних рядов в пустые колодцы чуть выше или ниже.
  2. Соберите клетки из нижней и верхней колодцев трансвелл вставки в трубки помечены TOP или BOTTOM, с CCL17, CCL22, или средства массовой информации, с типом клетки, и с номером репликации (по крайней мере 3 репликации за эксперимент).
  3. Промыть нижние скважины с 500 л 1x PBS и собрать этот промыть в соответствующую трубку.
  4. Промыть верхние скважины с 250 л 1x PBS и соберите этот промыть в соответствующую трубку.
  5. Пелле клетки центрифугации на 378 х г в течение 5 мин на RT.
  6. Аккуратно pipette от всех супернатант из клеточной гранулы.
  7. Повторное действие Т-клеток и ILC2 в 50 Зл 1x PBS.
  8. Возьмите 10 qL клеточных суспензий и добавьте к 90 зл 0,4% трипан синий.
  9. Подсчитайте ячейки на автоматизированном счетчике ячейки.
    1. Рекордная жизнеспособность%.
    2. Запись количества клеток на мЛ для каждого образца.
    3. Определить общее количество клеток на лечение в верхней и нижней камере; запись количества ячеек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выражение CCR4 на CD4 "Т-клетки и ILC2.

Для успеха эксперимента ex vivo трансмиграции, необходимо определить, являются ли лимфоциты реагировать на CCL17 и CCL22 через CCR4; Поэтому мы определили экспрессию CCR4 на обоих CD4и Т-клетках и ILC2 по цитометрии потока. Хотя хорошо известно, что OVA-специфические CD4и помощник Т-клетки выражают CCR4, меньше известно о выражении CCR4 на ILC2. На рисунке 1 показаны репрезентативные ре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом виде мы представляем устоявшийся метод оценки миграции лимфоцитов, индуцированной хемокином, в системе трансмиграции ex vivo. Есть несколько критических шагов в протоколе, первый из которых является проверка экспрессии правильного рецептора хемокина на иммунных клетках в эксперименте. В наших руках, мы выбрали CCR4 из-за тела литературы, которая подчеркивает важность CCR4 на Th2 помощник Т-клеток при аллергическом воспалении. Овальбумин индуцированных воспаление было показано ранее, чтобы быть ограничены по крайне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют финансовой информации или конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Американской ассоциацией легких (K.J.W.), Фондом Мемориала Евгения Кенни, присужденным T.A.W. и K.J.W., щедрой поддержкой стартапа от Университета штата юта для K.J.W., и наградой Департамента по делам ветеранов T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. является лауреатом премии научно-исследовательской карьеры (IK6 BX003781) от Департамента по делам ветеранов. Авторы хотят отметить редакционную помощь от г-жи Лизы Чудомелько. Авторы благодарят ядро ЦИтометрии потока UNMC за их поддержку в сборе данных цитометрии потока, генерируемых для этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,4% Трипановый синийСигма-Олдрич15250061
1 мл шприцBD Bioscience329424U-100 Шприцы Micro-Fine 28 г 1/2" 1cc
100x Пенициллин-стрептомицин, L-глутаминGibco10378-016Разбавить до 1x в среде RPMI
15 мл конические пробиркиOlympus Plastics28-101полипропиленовые трубки
3 μ m transwell вставкиGenesee Scientific25-28824-луночная пластина, содержащая 12 трансвелловых вставок
3x стабилизирующий фиксирующийBD Pharmigen338036Приготовить 1x раствор в соответствии с протоколом производителя
5 мл полистирольные трубкиSTEM Cell Technologies38007
50 мл конические трубкиOlympus Plastics28-106полипропиленовые трубки
8-камерный легкоразделительный магнитSTEM Cell Technologies18103
ACK Лизинг БуферLife Technologies CorporationA1049201
Усовершенствованный клеточный фильтр, 40 μ mGenesee Scientific25-375нейлоновая сетка, 40 μ m фильтры
Гидроксид алюминия, реагент маркиSigma-Aldrich239186-25G20 мг/мл
антимышиный CCR4; APC-сопряженныйBiolegend1312110,5 g/test
anti-mouse CD11bBD Pharmigen5573960,5 мкм; g/test
антимышиный CD11c; ПЭ eFluor 610Термофишер Научный61-0114-820,25 шт; g/test
anti-mouse CD16/32, Fc блокBD Pharmigen5531410,5 мкм; g/test
антимышиный CD19; APC-eFluor 780 сопряженныйтермофишер научный47-0193-820,5 μ g/test
антимышиный CD3; PE Cy 7-конъюгированныйBD Pharmigen5527740,25 гкм; g/test
антимышиный CD45; ПЭ конъюгированныйBD Pharmigen560870,5 μ g/test
anti-mouse ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 μ g/test
антимышиный NK1.1 (CD161); ФИТК-конъюгированныйBD Pharmigen5531640,25 гкм; g/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 конъюгированныйBiolegend1453110,5 μ g/test
Автоматический счетчик клетокBIORAD1450102
Автоматический диссоциаторMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Бычья сыворотка Альбумин, лиофилизированный порошокSigma-AldrichA2153-10G0,5% в сыворотке RPMI
Cell Counter ClidesBIORAD1450015
Овальбумин куриного яйца, Grade VSigma-AldrichА5503-10G500 г/мл
коллагеназы, тип 1, фильтрованныйWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, купить в виде 5 флаконов по 50 мг (LS004216)25 ед/мл в гранулах компенсации RPMI
Affymetrix01-1111-411 капля на контрольную пробирку
Диссоциационные трубкиMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS BufferBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, с азидом натрия; хранится при температуре 4°С;
C Инактивированный при нагревании - FBSGenesee Scientific25-525H10% в полном объеме RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17GenScriptZ02954-2050 нг/мл
Мышь CCL22GenScriptZ02856-2050 нг/мл
Мышь CD4+ Набор для обогащения Т-клетокSTEM Cell Technologies19852
Мышь IL-2GenScriptZ02764-2020 нг/мл
Набор для обогащения мышей ILC2STEM Cell Technologies19842
Мышиный рекомбинантный IL-33STEM Cell Technologies7804420 нг/мл
RPMILife Technologies Corporation22400071
Разделительный буферSTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; хранение при 4&�; C
Небулайзер и камера для мелких животныхData Sciences International
Sterile SaltBaxter2F7124; НДЦ 0338-0048-040,9% натрия хлорид

Ссылки

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Градиент хемокиновэкспрессия CCR4изоляция ILC2CD4-T-клеткаанализ в системе Transwellпроточная цитометрияжизнеспособность клетокскрининг хемокинов
Оценка миграции лимфоцитов в системе трансмиграции Ex Vivo
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.