Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка человека S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60065

⸱

29 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод очистки для рекомбинантных тегов без кальция связывающий белок S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для человека моноцитов стимуляции анализов.

Аннотация

В этом протоколе мы описываем метод очистки человека кальций-связывающий белок S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров из культуры escherichia coli для стимуляции иммунных клеток. Этот протокол основан на двухступенчатой стратегии хроматографии, которая включает в себя предочищение белка на колонке хроматографии анион-обменификации и последующий полировка шага на колонке гидрофобного взаимодействия. Эта стратегия производит белок S100A12 высокой чистоты и урожайности при управляемых затратах. Для функциональных анализов на иммунных клетках возможное пережитеевое эндотоксинное загрязнение требует тщательного мониторинга и дальнейших мер по очистке для получения белка без эндотоксина. Большинство эндотоксинных загрязнений могут быть исключены с помощью анион-обменной хроматографии. Для истощения остаточного загрязнения в этом протоколе описывается шаг удаления центробежных фильтров. В зависимости от доступных ионно-силовых S100A12 может организовать в различных homomultimers. Для изучения взаимосвязи между структурой и функцией, этот протокол далее описывает ионную обработку белка S100A12 с последующим химическим перекрестным соединением для стабилизации олигомеров S100A12 и их последующего разделения путем исключения размера Хроматографии. Наконец, мы описываем анализ на основе клеток, который подтверждает биологическую активность очищенного белка и подтверждает препарат без LPS.

Введение

S100A12 является кальциевый связывающий белок, который в основном производится человеческими гранулоцитами. Белок переэкспрессирован во время (системного) воспаления и его уровня сыворотки, особенно при (авто) воспалительных заболеваниях, таких как системный ювенильный идиопатический артрит (sJIA), семейная средиземноморская лихорадка (FMF) или болезнь Кавасаки (KD) может сообщить о активности заболевания и реакции на терапию. В зависимости от рецепторов распознавания образов (PRRs), таких как платные рецепторы (TLRs), врожденная иммунная система может быть активирована патогенно-ассоциированными молекулярными моделями (PAMP), такими как липополисахариды (LPS) или повреждения, связанные с молекулярными моделями (DAMPs; также называют «аларминами»). DAMPs являются эндогенные молекулы, такие как клеточные белки, липиды или нуклеиновые кислоты1. DAMP-функции хорошо описаны для членов семейства белка кальгранулин, S100A8/A9 и S100A122, которые также, как сообщается, работают как divalent металл ион-chelating антимикробных пептидов3,4, 5,6. В зависимости от имеющейся ионной силы S100A12 может, как и другие члены семейства S100, организовать в различных homomultimers и до недавнего времени влияние S100A12-олигомеризации на PRR-взаимодействия, в частности TLR4, было неизвестно.

Мономерная форма белка (92 аминокислоты, 10,2 кДа) состоит из двух структур сгелиса-петли-селикса EF, соединенных гибким связующим звеном. C-терминальныйEF-hand содержит классический мотив Ca 2'-связывающий, в то время как N-терминальныйEF-hand демонстрирует структуру расширенной петли S100 («псевдо-EF-hand») и показывает уменьшенную Ca2'-сродство. Ca 2 "-связывание S100A12 может вызвать серьезные конформационные изменения в C-терминубелков, что приводит к воздействию гидрофобного патча на каждом мономере и образует димеризации интерфейса. Таким образом, в физиологических условиях наименьшая четырехкратная структура, образованная S100A12, является нековалентным dimer (примерно 21 kDa), в котором отдельные мономеры находятся в антипараллельной ориентации. При расположении в качестве димера, S100A12, как сообщается, секвестр »n2", а также другие divalent ионов металла, например, Cu2 "с высоким сродством7. Эти ионы координируются в интерфейсе S100A12 dimer аминокислотами H15 и D25 одного подразделения и H85, а также H89 антипараллельного другого подразделения8,9,10. В то время как более ранние исследования предполагают, что «n2»- загруженный S100A12 может вызвать организацию белка в гомо-тетрамеры (44 kDa) и привести к увеличению Ca2 "сродство11,12, недавняя металлическая титровка исследования6 показывают, Ca 2 "-связывание s100A12, чтобы увеличить сродство белка к »n2 ". После того, как S100A12 EF-руки полностью заняты Ca2 ",дополнительные Ca2 ", как полагают, связывать между димерами, вызывая образование гексемеров (примерно 63 kDa). Архитектура хексамерной квартальной структуры явно отличается от тетрамерной. Предлагается, что интерфейс тетрамера нарушается, чтобы привести к новым димер-димер интерфейсы, которые выгоды hexamer формирования10. S100A12 почти исключительно выражается человеческими гранулоцитами, где она составляет около 5% всего цитосолильного белка13. В своей функции DAMP S100A12 исторически был описан как агонист рецептора мульти-лиганд для передовых конечных продуктов гликации (RAGE), а затем назвал внеклеточной вновь выявленных RAGE-связывающий белок (EN-RAGE)14. Хотя мы ранее сообщили биохимических S100A12-связывания как RAGE и TLR415, мы недавно продемонстрировали человеческие моноциты реагировать на S100A12 стимуляции в TLR4-зависимым образом16. Это требует расположения S100A12 в его Ca2 "/n2"-индуцированной hexameric quarternary структуры16.

Здесь мы описываем процедуру очистки для рекомбинантного человека S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток16,17. Это основано на двухступенчатой стратегии хроматографии, которая первоначально включает в себя колонку обмена анионов для изоляции и концентрации белка и удаления объемных загрязнений (например, эндотоксины/липополисахариды)18. Ионно-обменная хроматография мели с разъединяет белки на основе различных чистых поверхностных зарядов. Для кислых белков, таких как S100A12 (изоэлектрическая точка 5,81), буферная система с рН 8,5 и сильной анион-обменной мисиной приводит к хорошему разделению. Связанные белки были eluted с высоким содержанием соли буферград градиента. С увеличением ионной силы отрицательные ионы в элютионном буфере конкурируют с белками за заряды на поверхности мисинки. Белки индивидуально elute в зависимости от их чистого заряда и в результате этого, буферы, описанные в настоящим, позволяют изолировать и сконцентрировать переэкспрессии S100A12 белка. Из-за отрицательно заряженных групп в липополисахаридах, эти молекулы также связываются с анион-обменом мишенями. Однако их более высокий чистый заряд приводит к более позднему выращению приприменении высокосолевого градиента. Для полировки введен второй этап процедуры очистки. Это делает использование кальция связывающей способности S100A12 и удаляет оставшиеся примеси на гидрофобных взаимодействия колонки. Связывание кальция S100A12 приводит к конформационным изменениям и воздействию гидрофобных пятен на поверхность белка. При этом условии S100A12 взаимодействует с гидрофобной поверхностью мисы. После кальция-chelating ЭДТА, это взаимодействие вспять. При наличии ионов, особенно кальция и цинка, S100A12 устраивается в гомомерные олигомеры. Для изучения структурно-функциональных отношений различных олигомеров мы стабилизировали димерические, тетрамерные и гексамерные рекомбинантные S100A12 с химическим кросслинкером и разделили комплексы на столбец хроматографии размеров исключения. Наконец, для анализа функциональности и биологической активности очищенного белка и его ионно-индуцированных олигомеров можно сравнить высвобождение цитокинов S100A12 и LPS стимулируемых моноцитов.

До сих пор описаны различные методы очистки S100A12. Джексон и др.19, например, опубликовал протокол с очищением через колонку обмена анионом и последующего размера исключения хроматографии. Полировка очистки на столбце исключения размера приводит к хорошим результатам, но, например, из-за ограниченных объемов загрузки, менее гибкая по масштабируемости. Другой подход, опубликованный Kiss et al.20, описывает очищение помеченного белка через колонку сродства Ni2 в качестве первого шага очистки, а затем ферментативного расщепления для удаления тега и дальнейших шагов по очистке. В отличие от вышеупомянутых исследований19,20, производится белка, как описано в этом протоколе определяется для экспериментов на иммунных клетках. Таким образом, остатки эндотоксина загрязнения от бактериальной культуры является проблемой. Хотя различные подходы для удаления эндотоксинов были описаны до сих пор, нет единого метода, который работает одинаково хорошо для любого данного белковогораствора 21,22.

Таким образом, наш протокол сочетает в себе преимущества безметного выражения в бактериальной системе с эффективным удалением эндотоксинов и высокой урожайностью чистого белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к дополнительной таблице 1 для подготовки буферов и фондовых решений.

1. Выражение белка в кишечной палочке

  1. Клонирование
    1. Клон тегов без человека S100A12 (NCBI Справочная последовательность: NP-005612.1) в бактериальной экспрессии вектор pET11b. Чтобы выразить белок, преобразуйте конструкцию в E. coli BL21 (DE3).
  2. Культуры
    1. Подготовьте стартер культуры путем прививки одной колонии в 5 мл среды роста (LB бульон с 100 мкг /мл ампициллин) в 14 мл круглого дна трубки. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 220 об/мин. Перенесите 2-4 мл ночной культуры в 400 мл среды роста в 2 L колбе Erlenmayer и инкубировать культуру при 37 градусах Цельсия с тряской при 220 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная плотность основной культуры должна быть оптической плотностью в 600 нм (OD600) и 0,1.
    2. Мониторинг OD600 во время роста. Индуцировать выражение белка путем добавления 1 M изопропил-Д-Thiogalactopyranosid (IPTG) к конечной концентрации 1 мМ при OD600 и 0,5-0,6. Инкубировать при 37 градусах и 220 об/мин дополнительно 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, OD600 из 0.6 будет достигнут после 1,5-2,5 ч при 37 градусах Цельсия.
    3. Приготовьте 50 мл звукового буфера, растворив 50 мМ Tris, 50 мМ NaCl и 1 мМ этиленденамин тетраацетическая кислота (ЭДТА) в 40 мл деионированной воды. Отрегулируйте pH с HCl до 8.0 и сделайте до 50 mL. Добавьте ингибитор протеазы (1 таблетка на 50 мл раствора) и уравновесите буфер до 4 градусов по Цельсию.
    4. Перенесите бактериальную культуру в подходящие центрифуги и собираем клетки при 3200 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и отрепетите гранулы в 25 мл ледяного звукового буфера. Отныне держите клетки на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перепровимые ячейки могут храниться при -20 градусов по Цельсию в краткосрочной перспективе и при -80 градусов по Цельсию в долгосрочной перспективе.
  3. Соникация/лиза
    1. Сножайте клетки в течение 6 циклов по 30 с на льду. После каждого цикла, остальные клетки на 30-60 с, чтобы защитить клетки от перегрева.
    2. Перенесите суспензию ячейки на предварительно охлажденную 50 мл высокоскоростной центрифугии и центрифугу в стационарном угловом роторе при 15 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Декант очищенный лизат, который содержит растворимые цитозолические белки в свежую трубку 50 мл и отбрасывает гранулы.

2. Очистка белка

  1. Хроматография анион-обмен
    1. Диализ
      1. Подготовка анион-обмен хроматографии (AIEX) буфер А путем растворения 20 мМ Трис, 1 мМ EDTA и 1 мМ этилен гликоль-бис (2-аминоэтилет)-N, N,N',N'-тетраацетической кислоты (EGTA) в деионизированной воде и настроить pH до 8,5 с HCl. Для диализа приготовьтесь 2 x 5 л и для хроматографии 2x 1 l буфера AIEX A.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Объем диализата должен быть примерно в 100 раз больше объема образца. Все буферы, используемые для хроматографии, должны быть отфильтрованы (0,45 мкм или меньше) и дегазированы (например, ультразвуковой ванной или вакуумной дегазованием).
      2. Вырежьте диализные трубки (молекулярное отсечение веса (MWCO) (MWCO) в соответствующую длину с дополнительным пространством для воздуха, чтобы обеспечить плавучесть образца над вращающейся панелью перемешивания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерол сохраняет мембрану и должен быть удален перед использованием.
      3. Чтобы уменьшить вязкость очищенного белкового раствора со ступени 1.3.2, разбавьте раствор 25 мл буфера AIEX A, чтобы облегчить последующее применение в столбец хроматографии. Прикрепите первое замыкание на трубу, загрузите образец в мембрану и прикрепите вторую замыкание не менее чем на 1 см от верхнего конца трубки.
      4. Поместите контейнер 5 l с буфером AIEX A на тарелку перемешать, добавьте бар перемешания и мембрану, наполненную белковым раствором. Отрегулируйте скорость, чтобы повернуть образец, избегая помех с вращающейся панелью. Диализ для 12-24 ч при 4 градусах Цельсия, затем замените диализный буфер (буфер AIEX A) свежим предварительно охлажденный препарат и продолжайте, по крайней мере, 4 дополнительных часа. Перенесите диализированный белковый раствор в трубку 50 мл и процедите через фильтр 0,45 мкм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение возможно.
    2. Хроматографии
    3. Запустите систему жидкой хроматографии (FPLC) с общим обслуживанием, подключите буферы столбцов AIEX A и AIEX B (буфер AIEX A с 1 M NaCl) и анион-обменную мизину, содержащую столбец. Обратитесь к таблице 1 для общих хроматографических параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы, колонки и fPLC оборудование должно быть уравновешена до той же температуры перед началом запуска (обратитесь к хроматографическим параметрам в таблице 1, Таблица 2, Таблица 3, Таблица 4, и таблица 5).
    4. Уравновесите столбец буфером AIEX A, затем загрузите образец на столбец и удалите белки линейным градиентом от 0% до 100% буфера высокой соли (AIEX B). Обратитесь к таблице 2 для детального протокола метода.
    5. Соберите 2 мл фракций во время elution и проанализировать 10 л каждую фракцию на Coomassie окрашенных 15% натрия dodecyl сульфат полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE). Объедините фракции, содержащие белок S100A12 для диализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулярный вес S100A12 составляет 10 575 Da.
  2. Кальциева-зависимая гидрофобно-взаимодействия хроматографии (HIC)
    1. Диализ
      1. Диализ ирует сярприза белкового раствора против 20 мМ Трис, 140 мМ NaCl, pH 7.5 после процедуры, описанной в разделе 2.1.1.
    2. Хроматографии
      1. Подготовьте 1 л хроматографического буфера HIC A путем растворения 20 мМ Tris, 140 mM NaCl и 25 мМ CaCl2 в деионизированной воде и отрегулируйте рН до 7,5. Для буфера HIC B растворите 20 мМ Трис, 140 мм NaCl и 50 мМ EDTA. Отрегулируйте pH до 7.0 и отфильтруйте и дегазируйте буферы. Добавьте CaCl2 к образцу до конечной концентрации 25 мМ и процедите через 0,45 мкм. Equilibrate HIC буферов и образец до 4 градусов по Цельсию (температура колонки).
      2. Запустите систему жидкой хроматографии с общим обслуживанием, подключите буферы столбцов HIC A и B и колонку. Обратитесь к таблице 3 для дальнейших хроматографических параметров.
      3. Равновесие столбца, загрузите образец и расширьте блок «мыть несвязанный образец» до тех пор, пока УФ-сигнал не достигнет базового уровня снова. Затем начните элуциацию с кальциевым хелатором, содержащим буфер (EDTA). Обратитесь к таблице 4 для детального протокола метода.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие эксперименты показали, что избыток кальция, кажется, полезен для связывания S100A12 с хроматографией.
      4. Соберите пиковые фракции 2 мл и проанализируйте 10 л каждой фракции на окрашенных в Coomassie 15% SDS-PAGE. Бассейн чистый S100A12 фракций и диализ против hepes-буферный солевой раствор (HBS; 20 мм hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0), как описано в разделе 2.1.1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент вымирания мономерного S100A12 составляет 2980 М-1 см-1.

3. Обнаружение и удаление эндотоксина

  1. Обнаружение эндотоксина
    1. Для определения эндотоксинного загрязнения измеряйте концентрации разбавленного белка со ступени 2.2.2.4. (например, 1:10 и 1:100 в HBS) с использованием фермента связанных иммуносорбент анализа (ELISA) основе, флуоресцентные эндотоксин обнаружения анализа (Таблица материалов). Выполните этот ассс, следуя протоколу производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежеприготовленные растворы HBS, растворенные в ультрачистой деионизированной воде, чтобы избежать (нового) эндотоксинного загрязнения буфером.
  2. Удаление эндотоксина и концентрация белка
    1. Загрузите 15 мл образца на центробежный фильтр 50 кДа и центрифугу на 3200 х г и 10 градусов по Цельсию в течение примерно 10 мин. Перенесите проточение в свежий сосуд (на льду) и пополнить и центрифугу фильтровальной трубки 50 kDa по мере необходимости. Вымойте мембрану фильтра дважды с HBS, чтобы восстановить как можно больше белка, как это возможно после каждого шага.
    2. Сосредоточьтесь на S100A12-содержащий поток через с помощью 3 kDa центробежный фильтр, пока объем уменьшается до одной пятой до одной десятой первоначального объема нагрузки (центрифугирование при 3200 х г, 10 градусов по Цельсию в течение примерно 30 мин). Пополнить фильтр так часто, как это необходимо, промыть мембрану и передать концентрированный раствор в новую трубку после каждого пополнения. Откажитесь от потока через. Фильтр снова через 50 kDa, как описано выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры, потеря белка замечательна (до 50%), но оставшийся препарат белка полностью исчерпан из LPS. Этот метод дает около 10-15 мг белка из культуры 400 мл.
    3. Отрегулируйте белковый раствор до 1 мг/мл с помощью HBS без эндотоксина и измерьте содержание LPS, как описано в шаге 3.1.1. В случае, если белковый раствор все еще не протестирован как LPS-бесплатно (Злт;0.1 EU/mL), устраните остатки загрязнений с помощью эндотоксина удаления мизени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При концентрации белка 1 мг/мл, загрязнение 0,1 EU/mL LPS составляет примерно 0,01 пг LPS/мкг белка.

4. Химическое перекрестное соединение и олигомерное разделение

  1. Химическое перекрестное соединение
    1. Подготовка очень чистых (эндотоксинов) фондовых решений 1 M CaCl2 и 100 мМ NCl2 в ультрачистой деионизированной воды (Таблица материалов). Используйте этот буфер, только что сделанный, для следующего шага.
    2. Инкубировать 10 мл очищенного эндотоксина без S100A12 (концентрация 1 мг/мл в HBS) в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) либо с 25 мм CaCl2 для dimeric/tetrameric, или 25 мм CaCl2 и 1 мМ nCl2 для гксамерик/тетрамерия S100A12 Олигомеров.
    3. Подготовка crosslinker путем растворения 8 мг BS3 в 500 л без эндотоксина воды непосредственно перед использованием (8 мг кросслинкера для 10 мл ионно-spiked белковый раствор равна конечной концентрации 1,4 мм). Смешайте кросслинкер и образец путем pipetting и инкубировать в течение дополнительных 30 минут на RT. Утолить реакцию, добавив 1 M Tris-HCl, рН 7,5 до конечной концентрации 50 мм и фильтр через 0,45 мкм.
  2. Хроматография исключения размера
    1. Уравновесите перекрестный образец до 12-15 градусов по Цельсию (температура колонны) и запустите систему жидкой хроматографии с общим обслуживанием. Подключите буфер столбца (HBS) и столбец исключения размера. Для получения подробной информации обратитесь к таблице 5.
    2. Равновесие столбца в HBS, загрузите образец и соберите пиковые фракции (1'2 мл) во время выполнения. Проанализируйте эти фракции на градиенте SDS-PAGE 4'20% и фракциях пула с основными полосами желаемого белкового комплекса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидролиз эфирных реагентов NHS, таких как BS3 в aqueous решениях, приводит к сильному абсорбции на уровне 280 нм. Несвязанный кросслинкер (молекулярный вес: 572 г/мол) высечен в конце пробега и приводит к сильному пику.
    3. Сосредоточьтесь на решениях с помощью центробежных фильтров с MWCOs 10 kDa (димер), 30 kDa (тетрамер) или 50 kDa (hexamer). Определите эндотоксинное загрязнение, описанное в разделе 3.1. При необходимости удалите оставшиеся LPS с помощью эндотоксинной удаления мизины в соответствии с рекомендациями производителя(Таблица материалов).

5. Функциональное тестирование на моноцитах

  1. Приготовление моноцитов
    1. Изолировать моноциты из человека баффи пальто по плотности градиент центрифугирования и последующего обогащения моноцитов с помощью магнитного комплекта разделения бисера (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол приведет примерно к 5 х 7 107 моноцитов (один буйный слой) с чистотой 83-95%. Поскольку число, но и отзывчивость клеток сильно зависит от донора, протокол, возможно, придется расширить (в зависимости от необходимого количества клеток).
    2. Для центрифугации плотности уравновешиваем разделительный раствор (плотность 1,077 г/мл) на RT и перенесите 20 мл в центрифуги 50 мл (2 трубки на шубу). Разбавить кровь из человеческого шубного пальто буферным сосольным раствором Хэнка (HBSS) до общего объема 60 мл и слоя 30 мл этой смеси тщательно поверх среды разделения. Центрифуга при 550 х г в течение 35 мин на RT. Отлините центрифужный тормоз.
    3. После центрифугирования моноядерные периферических кровяных клеток (ПБМК) расположены непосредственно на верхней части среды разделения. Перенесите эти клетки в свежую центрифугу мощностью 50 мл, сделайте до 50 мл с HBSS и центрифугу при 170 х г в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант и переприостановите клетку гранулв в небольшом объеме HBSS путем пипеттинга.
    4. Заполните трубку до 50 мл и центрифугу при 290 х г в течение 10 мин. Снова приспособите супернатант, повторите работу клеток в HBSS (50 мл) и центрифуге при 170 х г в течение 10 мин. Сосчитайте клетки и отдохните их в буфере разделения клеток(Таблица материалов) /c9) до концентрации 5 x 107 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо HBSS, фосфат-буферированный солен (PBS) может быть использован для мытья клеток.
    5. Для моноцитной изоляции от ПБМК используйте магнитно-отрицательный комплект изоляции клеток и следуйте протоколу производителя. Подсчитайте моноциты и отдохните в моноцитной среде (RPMI 1640, 15% теплоинактивированной сыворотки плода, 4 мМ L-глютамина, 100 U/mL пенициллин/стрептомицин) до концентрации 2 х 106 клеток/мл.
    6. Для культуры моноцитов, блюда культуры пальто (например, 100 мм) с гидрофобной, газопроницаемой пленкой, подходящей для подвесных клеток(Таблица материалов). Стерилизовать пластины с помощью уф-излучения в течение примерно 30 мин. Перенесите клетки к этим культурным пластинам и дайте им отдохнуть на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 15-25 мл клеточной подвески на тарелку с покрытием.
  2. Стимуляция моноцитов
    1. Стимуляция с помощью S100A12 (дикий тип)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отличить необработанный S100A12 (конечный продукт из раздела 2.2.2) от перекрестного белка, S100A12 в следующем называется «дикий тип».
      1. Передача отдохнувшие клетки в 50 мл центробежной трубки и центрифуги на 350 х г в течение 10 мин. Аспирировать супернатант и resuspend клеточные гранулы в стимуляции среды (RPMI 1640, 5% тепло-инактивированных FCS, 4 мм L-глутамамин, 100 U/mL пенициллин/ стрептомицин) при концентрации 2 х 106 клеток/мл.
      2. Для стимуляции используйте 24 подвесные пластины и добавьте 250 qL клеточной подвески на скважину (0,5 х 106 клеток/хорошо). Добавьте 50 мкг/мл полимиксина В к предполагаемым скважинам, за которыми следует lpS в различных концентрациях (25, 50, 100 и 200 pg/mL) или дикий тип S100A12 (10, 20, 40, 60 мкг/мл). Кроме того, применять белок либо необработанных или теплоденатурированных (99 кв.к. 10 мин) в различных концентрациях клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Короткая термальная обработка денатурирует белок S100A12, но не оказывает меньшего влияния на LPS.
      3. Инкубировать пластины для 4 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. Урожай клетки путем передачи клеточной подвески каждой скважины в 1,5 мл реакционных труб. Центрифуга при 500 х г в течение 10 мин. Перенесите супернационты в свежие трубки и измерьте высвобождение ТНФЗ в различных разбавлениях (например, 1:2, 1:5, 1:10) с человеческим комплектом TNF' ELISA, следуя рекомендациям производителя.
    2. Стимулирование с помощью олигомеров S100A12
      1. Подготовка и семя из моноцитов в 24 хорошо подвесной пластины, как описано выше. Стимулировать клетки, добавляя олигомеры S100A12 со ступени 4.2.3. в различных моляровских концентрациях (125 нм, 250 нм, 500 нм, 1000 нм).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения способностей различных олигомеров стимулировать моноциты, к клеткам в сопоставимых молярах были применены олигомеры.
      2. Инкубировать в течение 4 ч при 37 и 5% CO2,собирать клетки и измерять высвобождение TNF в супернатантах, как описано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После предварительной очистки на колонке AIEX(Рисунок 1A-C) и последующих кальциевых зависимых HIC (Рисунок 2A,B), очень чистый белок был получен(рисунок 2C). Кроме того, измерения эндотоксина показали успешное удаление ЛПС. Содержание LPS после AIEX измерялось в 1:10 разбавления выше предела обнаружения ассеа, т.е. выше 500 EU/mL. После первой фильтрации через фильтр 50 kDa, содержание LPS было уме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем безметиваемую бактериальную экспрессию человека S100A12 и его очищение, а также разделение на различные ионные олигомеры для стимуляции иммунных клеток. По сравнению с опубликованной литературой по очистке белка S100A128,23,24, использование высокого CaCl2 (25 мМ) в гидрофобно-взаимодействии хроматографии, насколько нам известно, уникальным. Несколько протоколов, применяющих концентрации ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами от интрамуральной инновационной медицинской исследовательской программы медицинского факультета Университета Мюнстера (KE121201 до C.K.) и Немецкого исследовательского фонда (DFG, Fo354/3-1 до D.F.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pET11b вектор Novagen   
BL21(DE3) компетентный E. coliNew England BiolabsC2527 
<сильный>       
>100x Заменимые аминокислотыMerckK 0293
25% HClCarl RothX897.1
4− 20% Мини-ПРОТЕАН TGX Протеиновые гелиBioRad4561093
ампициллина натриевая сольCarl RothHP62.1
BS3 (бис(сульфосукцинимидил)суберат) - 50 мгThermoFisher Scientific21580
Дигидрат хлорида кальцияCarl Roth5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Раствор для удаления пятенBioRad1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Окрашивающий растворBioRad1610436
EasySep Набор для обогащения моноцитов человекаСтволовые клетки19059Набор для выделения магнитных отрицательных клеток
EDTA дигидрат динатриевой солиКарл Рот8043.1
EGTAКарл Рот3054.3
EndoLISAHyglos609033Обнаружение эндотоксинов
анализ Ультра чистая вода без эндотоксиновSigma-AldrichTMS-011-AУльтрачистая вода для приготовления буферов без эндотоксинов
EndoTrap красныйHyglos321063Смола для удаления эндотоксинов
FBS (термоинактивированная)Gibco10270
HBSS, без кальция, без магнияThermoFisher Scientific14175053
HepesCarl Roth9105
Hepes (высокое качество, эндотоксин testet)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alpha - OptEia ELISA SetBD555212
IPTG (изопропил-ß-D-тиогалактопиранизид)Carl RothCN08.1
L-глутамин (200 мМ)MerckK 0282
LB-MediumCarl RothX968.1
Липополисахариды из E. coli O55:B5MerckL6529
Pancoll, humanPAN BiotechP04-60500Разделительный раствор (центрифугирование с градиентом плотности)
Пенициллин/стрептомицин (10.000 Ед/мл)MerckA 2212
Фенилсефароза Высокая производительностьGE Healthcare17-1082-01Смола для гидрофобное взаимодействие хроматография
Polymyxin BInvivogentlrl-pmb
Таблетки ингибитора протеазыRoche11873580001
Q Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0510-01Смола для аниообменной хроматографии
RoboSep bufferStemcell20104Буфер для разделения клеток (раздел 5.1.4)
RPMI 1640 MediumMerck F 1215
Хлорид натрия (NaCl)Carl Roth3957.2
Гидроксид натрияCarl RothP031.1
Трис БазаCarl Roth4855.3
Хлорид цинкаCarl RothT887
Labware
0,45 & микро; m шприц фильтрMerckSLHA033SS
14 мл круглодонные трубкиBD352059
2 л колба ErlenmyerCarl RothLY98.1
24 луночные подвесные пластиныGreiner662102
5 л мерный стаканCarl RothCKN3.1
50 мл конические центрифужные пробиркиCorning430829
Высокоскоростные центрифужные пробирки объемом 50 млEppendorf3,01,22,178
Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-15 MWCO 3 кДаMerckUFC900324
Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-15 MWCO 50 кДаMerckUFC905024
чашка для культур (100 мм)Sarstedt83.3902
Закрытие диализных трубокСпектр132738
EasySep магнит 'The Big Easy'Stemcell18001
Фракционные коллекторные пробирки 5 млGreiner115101
пленка Lumox, 25 &; m, 305 мм x 40 мSarstedt94,60,77,316Пленка для моноцитарных культуральных планшетов
Spectra/Por Диализная мембрана (3,5 кДа)Spectrum132724
Steritop фильтрующая установкаMerckSCGPT01RE
Equipment
37 ° C Инкубатор (с встряхиванием)New Brunswick ScientificInnova 42
Ä Очиститель KTA UPC 10Система FPLCGE Healthcare
Сборник фракцийGE HealthcareFrac-920
Центрифуга (с ротором A-4-81)Eppendorf5810R Ротор
фиксированным углом наклонаEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDU
NanoPhotometerImplenP330
Ультразвуковой аппаратBrandelinUW2070
Флуоресцентный считывательTecanбесконечная M200PRO
pH-метрKnick765
с

Ссылки

  1. Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
  2. Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
  3. Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
  4. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
  5. Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
  6. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  7. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  8. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
  9. Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
  10. Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11(2009).
  11. Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
  12. Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
  13. Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
  14. Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
  15. Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
  16. Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
  17. Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
  18. GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
  19. Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  20. Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
  21. Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
  22. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
  23. Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
  24. Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
  25. Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
  26. Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
  27. Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
  28. Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка S100A12анионообменная хроматографиягидрофобная взаимодействующая хроматографияэксклюзионная хроматографияхимическое сшиваниеудаление эндотоксиноввыделение моноцитоввысвобождение ФНО-альфа
Очистка человека S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.