Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Summary

Этот протокол предоставляет метод для облегчения генерации определенных гетерозиготных или гомозиготных изменений ядра с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека.

Abstract

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки предлагают мощную систему для изучения функции генов и моделирования конкретных мутаций, имеющих отношение к болезни. Генерация точных гетерозиготных генетических модификаций является сложной задачей из-за CRISPR-CAS9 опосредованного индель образования во втором аллеле. Здесь мы демонстрируем протокол, помогающий преодолеть эту трудность, используя два шаблона ремонта, в которых только один выражает желаемое изменение последовательности, в то время как оба шаблона содержат молчаливые мутации, чтобы предотвратить повторное вырезание и образование indel. Эта методология является наиболее выгодным для редактирования генов кодирования регионов ДНК для создания изогенного контроля и мутантных линий стволовых клеток человека для изучения болезней человека и биологии. Кроме того, была проведена оптимизация методологий трансфекции и скрининга для снижения рабочей силы и затрат на эксперимент по редактированию генов. В целом, этот протокол широко применим ко многим проектам редактирования генома, используя модель стволовых клеток человека.

Introduction

Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются ценными инструментами для моделирования болезни человека из-за их способности к обновлению, сохраняя при этом способность генерировать типы клеток различных линий^{1,2 ,3,4}. Эти модели открывают возможность изыскнуть функцию генов и понять, как специфические мутации и фенотипы связаны с различными заболеваниями^5,6. Однако, чтобы понять, как конкретное изменение связано с определенным фенотипом, использование парного изогенного контроля и мутантных клеточных линий важно контролировать для линии к линии изменчивости^7,8. Транскрипционный активатор- как эффектиор нуклеазы (TALENs) и цинк палец нуклеазы были использованы для создания вставки или удаления (indels) мутации в различных генетических моделей, в том числе первичных клеток; но эти нуклеазы могут быть громоздкими в использовании и дорогими^{9,10,11,12,13,14}. Открытие кластерных регулярно межпространственный короткий палиндромический повтор (CRISPR)-CAS9 нуклеаза произвела революцию в этой области из-за эффективности в формировании indel практически в любой области генома, простота использования, и снижение стоимости^{15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19}.

Проблема в использовании технологии редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 заключается в генерации или коррекции конкретных мутаций в одном аллеле без создания indel мутации во втором аллеле²⁰. Основная цель этого протокола заключается в преодолении этой проблемы с помощью двух одноцепочечных шаблонов ремонта олигонуклеотида (ssODN) для уменьшения образования indel во втором аллеле. Оба ssODNs предназначены для сдерживания молчаливых мутаций, чтобы предотвратить повторное сокращение нуклеазой CAS9, но только один содержит изменение интереса. Этот метод повышает эффективность генерации специфической гетерозиготной генетической модификации без индуцирования во втором аллеле. Используя этот протокол, эксперименты по редактированию генов в шести независимых геномных местах демонстрируют точное введение желаемого геномного изменения в одном аллеле без образования indel во втором аллеле и происходит с общей эффективностью в 10%. Описанный протокол был адаптирован из Магуайр и др.²¹.

Protocol

1. Проектирование и строительство направляющей РНК (gRNA)

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая gRNA состоит из двух 60 базовых пар (bp) олигонуклеотидов, которые annealed для создания 100 bp двойной мель (ds) олигонуклеотид (Рисунок 1A-C). Сроки разработки, генерации и тестирования эффективности работы gRNA составляют примерно 2 недели(рисунок 2).

1. Выберите область ДНК, представляющий интерес, чтобы быть отредактированным геномом и определите 3-4 23 bp последовательности, которые соответствуют формату, 5'-G (N₁₉)NGG-3'. Эти последовательности должны быть расположены в пределах 20 bp от региона интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация может быть выполнена на смысле или анти-чувство прядь.
2. Оцените последовательности gRNA для геномной избыточности и вероятности вне цели с помощью такого ресурса, как CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Включите 20 BP целевой последовательности (за исключением протосказер смежных мотив или PAM) в два 60-мер олигонуклеотидов, как показано (последовательности 5 'до 3' и красный и зеленый являются обратными дополнениями, как показано на рисунке 1C).
4. Закажите два 60 bp олигонуклеотидов от поставщика выбора. После получения олигонуклеотидов, повторной каждой до конечной концентрации 100 мкм в ddH₂O. Сделать рабочий запас 10 мкм.
5. Аннал два олигонуклеотидов и генерировать 100 bp dsDNA фрагмент с помощью ПОЛимеразы ДНК (Таблица материалов). Смешайте 5 qL из 10 мкм вперед олигонуклеотида и 5 qL из 10 ММ обратного олигонуклеотида в полимеразовой цепной реакции (ПЦР) полоски трубки и инкубировать при 95 кв КС в течение 5 мин. Охладите реакцию в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
6. Настройка ПЦР, как описано в таблице 1. Выполните усиливание ПЦР в тепловом циклическом цикле, используя параметры, изложенные в таблице 2.
7. Визуализируйте продукты ПЦР на 1,5% (w/v) бромистого этидия (EtBr) агарозии гель электрофорезируется при 80-100 V в течение 40 мин. Акциз 100 bp band (Рисунок 3A), визуализированный на светодиодной световой коробке, от геля с помощью бритвы лезвие и очистить с помощью геля комплект извлечения(Таблица материалов).

2. Дизайн праймеров ПЦР для скрининга

1. Выполните скрининг отредактированной ДНК с помощью передних и обратных праймеров ПЦР, которые специально разработаны для усиления области 400-500 bp гена интереса (Таблица 2). Используйте ДНК, изолированную от любой контрольной линии iPSC, чтобы подтвердить чистую ампликон при выполнении скрининга ПЦР.
2. Визуализируйте пЦР-продукты на 1,5% (w/v) геле после электрофореза при 80-100 В на 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование отредактированных клонов выполняется с помощью вложенного грунтовки, которая разработана после подтверждения набора грунтовки скрининга. Образцы отправляются в коммерческий источник для секвенирования.

3. Приготовление гРНЗА-клонирования векторной плазмиды

1. Для линейной девициционирования вектора, возьмите 1,5 мл центрифуги трубки и добавить 1-5 мкг ДНК вектора gRNA'cloning вместе с 4 Зл из буфера ограничения AflII и 1,5 л фермента ограничения AflII. Подведите реакцию на 24 л ddH₂O. Смешайте реакцию, подав трубку вверх и вниз. Инкубировать при 37 градусах Цельсия на ночь (O/N).
2. Электрофорес на 1% агарозный гель на 80-100 В на 1 ч и акцизных полос (ожидаемый размер полосы составляет 3519 евро).
3. Извлекайте и очищайте как в шаге 1.6.

4. Сборка вектора gRNA

1. Настройка реакций и собрать фрагменты ДНК с помощью комплекта сборки (Таблица материалов) в 1:5 соотношения AflII переваренный вектор клонирования gRNA к 100 bp гель очищенной вставки, как описано в таблице 3.
2. Инкубировать реакцию при 50 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Разбавьте реакцию 1:3 в ddH₂O и используйте 3 ЗЛ для бактериальной трансформации, в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов). Плиты на канамицинл LB / агар пластин.
3. Выберите 3-5 колоний на гРНК. Прививать каждую колонию в 4 мл Lb и расти O / N на 37 градусов по Цельсию в орбитальном встряхивания инкубатора.
4. Очистка плазмидной ДНК с помощью комплекта изоляции минопов и последовательности каждого gRNA с использованием следующих грунтовок для обеспечения успешного клонирования: Forward: GTACAAAAAGCAGGCTTAAAGG; Обратный: TGCCAACTTGTACAAAAGCT.

5. Эффективность резки гРНК

1. Плита hESCs на облученных морин эмбриональных фибробластов (MEFs) в 6-хорошо пластины, как ранее описано²¹. Когда клетки достигают 70-80% всблонения, подготовить трансфекции мастер смесь, изложенные в таблице 4.
2. Смешайте путем pipetting и инкубировать на RT в течение 15 мин. Добавить dropwise к клеткам и инкубировать при 37 кс для 48 ч (с изменением носителя после 24 ч).
3. Урожайные ячейки для сортировки после 48 ч.
   1. Удалите MEFs ферментативно(Таблица материалов) с 3 мин RT инкубации.
   2. Промыть клетки 1x со средой hESC(Таблица 5) и скоблить в hESC среднего 10 МКм Y-27632 дигидрохлорид(Таблица материалов).
   3. Пеллетные клетки на 300 х г в течение 3 мин и повторно притяжаются в 0,5 мл среды hESC 10 мкм Y-27632 дигидрохлорида.
   4. Фильтр в трубку 5 мл через 35 мкм ячейки-ситечко крышка.
4. Используя флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), ворота на живые клетки и сортировать зеленый флуоресцентный белок (GFP) положительные клетки.
5. Передача максимум 1,5 х 10⁴ отсортированных клеток непосредственно в 10 см² блюдо покрытием с 1:3 подвал мембранной матрицы (Таблица материалов) и облученных MEFs в среде hESC (Таблица 5), содержащий Y-27632 дигидрохлорид.
6. Изменение среднего ежедневно с помощью среды hESC (Таблица 5) без Y-27632 дигидрохлорид и вручную выбрать клонов после 10-15 дней, когда колонии 1 мм в диаметре.
   1. Используя пипетку P200 и микроскоп, тщательно соскребите один клон и нарисовать клетки в пипетку.
   2. Разогнать клетки, аккуратно pipetting 3-4x в 96 хорошо пластины в среде составлен с колонией.
   3. Распределите в прокладки полоски ПЦР для скрининга и гранулы клетки центрифугирование мецентрирования при 10000 х г в течение 5 мин. Выберите 20 колоний на гРНК.

6. Скрининг клонов

1. Изолировать ДНК путем инкубации клеточных гранул в 20 qL буфера протеиназа K(Таблица 5) (1 ч при 55 градусах по Цельсию и 10 мин при 95 градусах Цельсия) и вихревом энергично. Центрифуга при 10 000 х г в течение 5 мин и соберите супернатант.
2. Выполните скрининг ПЦР (раздел 2) в общем объеме 20 зл, используя мастер-микс, включав в себя грунтовки, предназначенные для усиления интересуемой области и 5 зле циферей к дайджеста. Используйте геномную ДНК, изолированную от клеточной линии, которая редактировалась геном в качестве контроля.
3. Оцените изменения размера продуктов ПЦР после 1 л электрофореза при 70-90 В на 2,5% (w/v) агарозный гель(рисунок 3B, C). Любая разница в размерах свидетельствует о расщеплении.

7. Точное редактирование генома в плюрипотентных стволовых клетках с использованием одной нити олиго ДНК (ssODNs)

1. Дизайн 100 bp ssODNs сосредоточены вокруг наиболее эффективной последовательности gRNA определяется иметь лучшую эффективность резки.
2. Предотвращение повторного расщепления рекомбинуемого ODN путем введения молчаливых мутаций в последовательность gRNA. Одной молчаливой мутации в последовательности PAM достаточно, но если это невозможно, 3-4 тихих мутации будут работать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения скрининга целевых клонов, введение места ограничения в пределах 20 bp последовательности gRNA является идеальным.
3. Создайте одно ODN с пожеланным изменением основания (s) для того чтобы создать перегласовку интереса и одно ODN без изменения основания (s).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изменения должны быть не более чем на 20 евро за баррель от прогнозируемого участка сокращения CRISPR/CAS9, так как рекомбинация значительно падает на больших расстояниях.
4. Закажите два ssODNs от поставщика выбора и resuspend в воде, чтобы сделать 1 мкг / Л запасов. Храните запасы при -20 градусах по Цельсию.

8. Трансфекция установка

1. Чтобы переоборудовать ssODN и плазмиды CRISPR-CAS9, пластины целевой линии клеток в 6-ну хорошо блюдо на облученных MEFs достичь 70-80% выпуклость после Инкубации O / N.
2. Настройка реакции трансфекции, как описано в таблице 6. Смешайте реакцию путем pipetting и инкубировать в течение 15 минут на RT. Добавить трансфекционной реакции смеси dropwise к клеткам.
3. После 48 ч подготовьте клетки для сортировки клеток, как описано в разделе 5.3.
4. Выберите колонии 10 дней после покрытия одиночных клеток с помощью 200-й пипетки. Перенесите 100 л клеток в одну скважину из 24 или 48 хорошо пластины, ранее покрытые желатином и облученных МЭФов в среде hESC с дигидрохлоридом Y-27632. Используйте оставшиеся 100 л для изоляции ДНК, как описано в разделе 6.

9. Проверка на наличие мутаций в отдельных колониях

1. Чтобы проверить на успешную интеграцию ssODN, возьмите 5 зЛ ДНК, изолированной от каждой колонии, чтобы выполнить ПЦР с помощью скрининговых праймеров, разработанных в разделе 2. Очистите продукты ПЦР(Таблица материалов)и подготовьте переваривание фермента ограничения с помощью уникального фермента, созданного в ssODN.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это пищеварение также включает в себя буфер фермента ограничения и рекомендуемую производителем концентрацию фермента ограничения в объеме 40 зл.
2. Смешайте реакцию путем пипетки и инкубируйте при рекомендуемой температуре производителя 1-3 ч.
3. Визуализируйте переваренные продукты ПЦР на 1,5% (w/v) EtBr агарозный гель электрофоресированный при 80-100 В в течение 40 мин. Если произошла успешная интеграция ssODN, последовательность конкретных мутаций с помощью вложенного грунтовки.

Results

Генерация ГРНК и скрининг на инделы

Каждая gRNA будет клонирована в плазмидный вектор и выражена с помощью промоутера U6. Фермент ограничения AflII используется для линейной плазмиды (addgene #41824) и расположен после промоутера U6. Диапазон 100 bp, созданный после аннулирования двух олигосов 60 bp, клонируется в вектор экспрессии gRNA с помощью сборки ДНК. Как только плазмиды gRNA генерируются, они трансфицируются в hESCs или iPSCs вместе с плазмидом CRISPS-CAS9 GFP...

Discussion

В этом протоколе, использование CRISPR-CAS9 вместе с двумя шаблонами ремонта ssODN для создания конкретных гетерозиготных или гомозиготных изменений генома демонстрируется в стволовых клетках человека плюрипотентных. Этот метод привел к успешному генерации изогенных клеточных линий, выражающих гетерозиготные геномные изменения с эффективностью, близкой к 10%. Этот протокол был оптимизирован как для человека ESCs и iPSCs, выращенных на облученных MEFs, которые поддерживают рост клеток и выживание после культивирования кле...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-мл полистирольная трубка с круглым дном и крышкой для клеточного фильтра	Corning	352235
6-луночные чашки для культуры тканей из полистирола	Corning	353046
эндонуклеазой рестрикции AflII	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
			для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS)
Набор для экстракции геля	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB агаровые пластины, содержащие 50 мкм; г/мл канамицина
Липофектамин Стволовой реагент	ThermoFisher	(STEM00001)
Уменьшенный фактор роста Matrigel (GFR)	Corning	354230
Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)
Набор для экстракции и очистки ПЦР Nucleospin Gel	Macherey-Nagel	740609
Орбитальный встряхивающий инкубатор
pCas9_GFP вектор	Addgene	44719
ПЦР стрип пробирки	США Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase и 5× Буфер Phusion	England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM электрокомпетентные клетки Escherichia coli	Takara	636763
среда SOC New	England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzyme	ThermoFisher	12605036
Y-27632 дигидрохлорид/ингибитор ROCK (ROCKi)	Tocris	1254