Светиндуцированная молекулярная адсорбция белков с использованием системы PRIMO для микро-паттернинга для изучения реакции клеток на внеклеточные матричные белки

Краткое содержание

Наша общая цель состоит в том, чтобы понять, как клетки чувствуют внеклеточные сигналы, которые приводят к направленного аксонального роста. Здесь мы описываем методологию светоиндуточной молекулярной адсорбции белков, используемую для производства определенных микрошаблонов внеклеточных матричных компонентов для изучения конкретных событий, которые регулируют аксон ный рост и поиск пути.

Аннотация

Клетки ощущают различные внеклеточные сигналы, включая состав и геометрию внеклеточной матрицы, которая синтезируется и перестраиваются самими клетками. Здесь мы представляем метод светоиндутового молекулярной адсорбции белков (LIMAP) с использованием системы PRIMO в качестве метода шаблона для производства микро-узорчатых внеклеточных матриц (ECM) субстратов с использованием одного или комбинации белков. Метод позволяет печатать eCM шаблоны в разрешении микрона с отличной воспроизводимости. Мы предоставляем пошаговой протокол и демонстрируем, как это может быть применено для изучения процессов поиска нейронов. LIMAP имеет значительные преимущества перед существующими методами микропечати с точки зрения простоты шаблонирования более одного компонента и способности генерировать шаблон с любой геометрией или градиентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения вклада практически любого химического компонента в судьбу клеток и поведение клеток. Наконец, мы обсуждаем общие вопросы, которые могут возникнуть и как их можно избежать.

Введение

В последние годы биологические науки все шире используют достижения, достигнутые в области материаловедения. Одним из ярких примеров является микро-патира субстратов, которые могут быть использованы для изучения клеточных реакций, таких как пролиферация клеток^1,2Дифференциации^3,4,5,6, миграция ячеек^7,8,9и поиск путей^10,11. Существует ряд методов, позволяющих микрошаблонировать субстраты, такие как мультифотонная фотохимия¹², AFM dip-pen нанолитографии¹³, контактный и струйный прямой печати¹⁴, литография электронного луча¹⁵или микрофлюики¹⁶. Тем не менее, два метода, которые широко используются в биологической области являются микроконтактной печати^17,18,19или лазерная помощь узор³(Рисунок 1). Считается, что лазерная модель обеспечивает более надежные результаты с точки зрения стабильности белка и ПЭГ и клеточной изоляции моделей, по сравнению с микроконтактной печатью²⁰. Более новым подходом к микро-шаблону, описанного здесь, является использование светоиндуцированной молекулярной адсорбции белков²¹(ЛИМАП,Рисунок 1 D) с использованием коммерчески доступной системы (PRIMO,Таблица материалов). Каждый из методов имеет преимущества и ограничения, которые кратко описаны ниже. Микроконтактная печать использует формы PDMS (штампы) с желаемыми микрофункциями, которые генерируются литографией мастеров. Марки инкубируются выбранным белком, который затем передается (штамп) на субстрат клеточной культуры¹⁸(Рисунок 1 A). Лазерная помощь узор использует уф-излучение, чтобы расщеплять анти-загрязнения пленки^22,23,24,25, подвергая регионам, которые впоследствии могут быть покрыты белком интереса (Рисунок 1 B). В то время как разрешение, достигнутое с помощью подходов к фотошаблонизуя, находится в диапазоне микронов^25,26, большинство из этих методов требуют фото-маски, либо в контакте с образцом, или расположен в плоскости объекта цели микроскопа^23,27,28. Требования к маскам как в микроконтактной печати, так и в фотошаблонинге могут быть ограничением; для каждого геометрического рисунка и размера требуются специальные маски, которые могут быть дорогими и отнимающими много времени. В отличие от этих методов, LIMAP не требует маски (Рисунок 1 D). Использование системы PRIMO для LIMAP может быть затратным в начале, поскольку она требует покупки оборудования. Тем не менее, программное обеспечение с открытым исходным кодом используется для разработки моделей любой желаемой геометрии, давая гораздо больше свободы и позволяет более сложные эксперименты, включая использование градиентов концентрации белка. Лазер PRIMO управляется и направляется цифровым микрозеркальным устройством (DMD) для создания шаблонов в любом количестве геометрий, определяемых пользователем. LIMAP требует, чтобы поверхность культуры была покрыта молекулами, которые препятствуют вложению клеток. Полиэтиленгликоль (PEG) чаще всего используется в качестве такого "антифулингового" реагента; она образует плотную антиклеяную пленку на стеклянной или пластиковой поверхности²⁹. Впоследствии добавляется фото-инициатор, который позволяет снимать пленку PEG с высокой точностью с помощью механизма фотоциссии³⁰локальным воздействием УФ-излучения под контролем DMD. Эти области, свободные от ПЭГ, могут быть покрыты белками, которые адсорбируются на поверхность с лазерной травкой, создавая микрошаблон. Изменяя мощность лазера, различные количества ПЭГ могут быть удалены с поверхности, что позволяет пользователю генерировать градиенты белка. Удаление ПЭГ и процедура покрытия могут быть повторены для создания узоров с двумя или более различными белками в одном микроколодце²¹. Сгенерированные микрошаблоны обеспечивают клеевые поверхности для клеток, что позволяет изучать поведение клеток. В наших исследованиях мы используем микро-паттернинг для изучения нейрита или аксона по поиску нейронной клеточной линии (CAD (Cathecholaminergic-a дифференцированных) клеток³¹) или первичных крыс дорсал-корень ганглия (DRG) нейронов, соответственно. Здесь мы намечаем пошаговой протокол для LIMAP (Рисунок 2) с использованием коммерчески доступной системы PRIMO и сопровождающих Леонардо программного обеспечения. Мы демонстрируем, как его можно использовать для генерации узоров с определенными геометриями и несколькими белками, которые мы используем для изучения аксонального поиска путей. Мы обсуждаем общие вопросы, которые могут возникнуть и как их можно избежать.

Протокол

1. Дизайн шаблонов шаблонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны для шаблонирования генерируются с помощью программного обеспечения для цифрового рисования(Таблица материалов). Рисунок в различных серых уровнях будет определять интенсивность лазера. Использование программного обеспечения для разработки шаблонов позволяет быстрое поколение шаблонов с любой желаемой геометрией и градиентами(рисунок 3).

1. Цифровой рисунок желаемого шаблона шаблона с помощью программного обеспечения для рисования. Выберите размер изображения длиной 1824 пикселя и шириной 1140 пикселей (что в данном исследовании соответствует длине 415 мкм и ширине 260 мкм). Сохранить шаблон шаблона в виде 8-битного файла Tiff.
   ПРИМЕЧАНИЕ: пошаговый протокол для генерации шаблонов доступен по запросу бренду, который коммерциализирует оборудование для микрошаблонов(Таблица материалов).

2. Плазменная очистка

ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные результаты требуют плазменной очистки поверхностей до узора, который удалит все органические вещества и активирует поверхность. В данном случае окружающего воздуха достаточно для активации поверхности. Плазменный очиститель(Таблица материалов) был использован с технологическим давлением 1000-1300 мТорр и мощностью 29,6 Вт в течение 1-5 мин.

1. Используйте стеклянную нижнюю тарелку/эс с 20 мм внутренним размером скважины и толщиной стекла 0,16-0,19 мм. Для тестирования нескольких условий используйте 6-ну колодую нижнюю тарелку. В противном случае, используйте одну хорошо стеклянную нижнюю тарелку(Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговый протокол для очистки плазмы доступен по запросу бренда, который коммерциализирует оборудование для очистки плазмы(Таблица материалов).

3. Пассивация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг генерирует антифолитную пленку, которая предотвращает адсорбцию белка на стеклянную поверхность. PEG предлагает высокую устойчивость к протеиновый адсорбция²⁹ в качестве антифолирующего агента. LIMAP использует фото-инициатора для локального удаления PEG с помощью УФ-фотоциссии. Белок / с интерес будет затем адсорб этих PEG-свободных поверхностей²¹, генерации микро-шаблонов.

1. Пассивация с PLL-PEG
   1. В стерильных условиях, вырезать ТРАФАРеты PDMS (см. Рисунок 4A, B и таблица материалов), чтобы убедиться, что они вписываются во внутреннее дно стекла хорошо, и удалить внутренние микроколодцы пломбы со стерильными щипцы. Палка трафареты на стекле хорошо с помощью щипцы.
   2. Убедитесь, что трафареты плотно прилипают к стеклу, предотвращая образование пузырьков воздуха, которые могут вызвать утечки в процессе пассивации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ТРАфареты PDMS также могут быть изготовлены в доме с использованием опубликованных протоколов^18,32.
   3. Приготовьте раствор PLL-PEG(Таблица материалов,0,1 мг/мл) в фосфатно-буферном сольном (PBS). Добавьте 20 зл и сто сто юрлой раствор PLL-PEG к каждому микроколодцу и инкубируйте при комнатной температуре, по 1 ч.
   4. Удалите 15 Зл Л PLL-PEG из микроколодцев и промойте их пять раз с 20 Зл PbS(Таблица материалов), не давая им высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда оставляйте около 5 Л PBS между стихает. Учитывая их небольшой объем, микроколодцы особенно восприимчивы к сушке. Сушка приведет к микрошаблоны низкого качества.
   5. Либо держать блюдо культуры в PBS (3 мл на скважину) при 4 градусах по Цельсию в течение 3 дней или продолжить следующий шаг (шаг 3.1.5).
   6. Удалите 18 ЗЛ PBS из одного микроколодца (например, верхний левый микро-хорошо, см. Рисунок 4D), добавьте 5 зл фото-инициатора (PLPP, Таблица материалов)и оставьте 20 Л PBS в оставшихся микроскважинах. Этот микро-колодец с PLPP будет использоваться для создания эталонного шаблона (см. Рисунок 4D,E) на этапе калибровки системы (шаг 4). Держите PLPP защищенным от света.
2. Пассивация с длительным PEG-SVA
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания антиклеезивной поверхности можно использовать: 1) ПЭГ, связанный с Поли-Л-Лизином (PLL-PEG, шаг 3.1) или 2) PEG-succinate N-гидроксисинимид (PEG-SVA). Решение о выборе того или иного варианта пассивации зависит от вариантов хранения (см. шаг 10). Культурные блюда, инкубированные PEG-SVA, требуют двойного количества пассивации и времени фотопаттернинга.
   1. Подготовка трафаретов, описанных в шаге 3.1.1.
   2. Добавьте 20 кл. 0,01% Поли-Л-лизин (PLL, Таблица материалов)к каждому микроколодцу и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут до предварительного покрытия с PLL.
   3. Удалите 15 Л PLL из микроколодцев и промойте их три раза с 20 зл 1 M HEPES буфера (Таблица материалов), не давая скважин высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда оставляйте около 5 зл HEPES или PBS между стихами. Учитывая их небольшой объем, микроколодцы особенно восприимчивы к сушке. Сушка приведет к микрошаблоны низкого качества.
   4. Подготовьте решение PEG-SVA. Раствор PEG-SVA (50 мг/мл в буфере HEPES 1M) следует готовить свежим каждый раз непосредственно перед использованием. Подготовьте 20 Зл ПЭГ-СВА на микроскважину.
   5. Буфер HEPES должен иметь рН между 8-8.5. ТестHE PH перед подготовкой решения PEG-SVA с бумагой pH. Взвешивание PEG-SVA в центрифуговой трубке с помощью точной шкалы. Добавьте буфер HEPES и вихрь 30 с до растворения. PEG-SVA полностью растворяется, когда раствор прозрачный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SVA является эфир, который позволяет связывания ПЭГ к ранее покрытием PLL. Как только буфер HEPES добавляется в PEG-SVA, SVA имеет период полураспада 15 минут и должен быть использован немедленно.
   6. Добавьте 20 зЛ раствора PEG-SVA к каждому микроколодцу и инкубировать при комнатной температуре, по 1 ч. Удалить 15 л PEG-SVA из микроколодцев и промыть пять раз с 20 ЗЛ PBS(Таблица материалов),не давая скважины высохнуть.
   7. Либо подготовить блюдо культуры для длительного хранения (до 1 месяца, см. шаг 10.2) или перейти к следующему шагу (шаг 3.2.8).
   8. Удалите 18 Л PBS из одного микроколодца (например, верхний левый микро-хорошо, см. Рисунок 4D), добавьте 5 Зл ПЛПП(Таблица материалов)и оставьте 20 Л ПБС в остальных микроскважинах. Этот микро-колодец будет использоваться для создания эталонного шаблона (см. Fi gure 4D, E). Убедитесь, что PLPP однороден на всей поверхности микроколодца. Держите PLPP защищенным от света.

4. Калибровка системы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этих шагах, фокус лазера будет отрегулирован к определенному типу тарелки культуры (шаг 4.1). Эталонный шаблон будет создан только в одном микроколодце (шаг 4.2), за которым последует инкубация с белковым раствором (шаг 4.3) для обеспечения оптимальных условий фокусировки лазера (шаг 4.4), необходимых для получения острых и определенных закономерностей.

1. Лазерная калибровка
   ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе калибровки, калибровочное лазерное изображение будет проецироваться на флуоресцентно выделенную стеклянную поверхность (калибровка хорошо, отмеченная флуоресцентным маркером, Рисунок 4C), который должен быть помещен в фокус на Микроскоп.
   1. Используйте флуоресцентный маркер(Таблица материалов), чтобы отметить пустое внутреннее стекло хорошо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка скважины должна иметь ту же толщину стекла (0,16-0,19 мм), что и культурное блюдо, на котором будут создаваться микрошаблоны. Если используется 6-колодец со дном, пустой колодец может быть использован для калибровки и должен быть отмечен флуоресцентным подсветкой в стерильных условиях.
   2. Включите микроскоп, сцену и компьютер. Включите оборудование для микрошаблонов PRIMO, открытое программное обеспечение Micro-manager и Leonardo. Программное обеспечение Leonardo управляется через Micro-manager под Plugins. Проверьте бренды / каталог номера оборудования и программного обеспечения в таблице материалов.
   3. В первоначальном меню Леонардо выберите Калибр. Убедитесь, что выделенный кубфильтра PRIMO находится в правильном положении (оптический путь) в фильтре башни; выберите цель 20X (0.75 DIC S Plan Fluor, без фазового кольца) как на микроскопе, так и на программном обеспечении Леонардо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол корректируется в версию Леонардо 4.4. Протокол может потребоваться корректировка для других версий.
   4. Позиция ранее выделенной калибровки хорошо(Рисунок 4C) выше цели. Выберите траекторию камеры. Отрегулируйте объективную направленность до тех пор, пока лазерная проекция логотипа PRIMO и линии тегов Позаботьтесь о ваших клетках в фокусе.
   5. Оставьте время экспозиции камеры по умолчанию на 25 ms. Отрегулируйте интенсивность лазера, чтобы увидеть букву I из проекции логотипа PRIMO в сером цвете, а остальные буквы белым цветом.
   6. Запись положения фокусного плана (высота цели к выборке), которую позже называют положением калибровки. Это будет приближение к оптимальному фокусу, полученному после генерации эталонного шаблона (см. шаг 4.2-4.4).
2. Шаблон ссылки
   1. Расположите блюдо культуры с микро-хорошо, содержащий фото-инициатора (ссылка шаблон микро-хорошо, Рисунок 4D) выше цели и выбрать шаблон в настоящее время в программном обеспечении Леонардо.
   2. Визуализируйте край микроколодца с передаваемым светом через камеру и выберите символ рентабельности инвестиций из правого меню. Установите диаметр круга рентабельности инвестиций до 4000 мкм и выровнять край цифровой рентабельности инвестиций с краем текущего микроколодца.
   3. Убедитесь, что существует точное совпадение между цифровой рентабельностью инвестиций и текущим микроскважиной, перемещая сцену по краям микроколодца. Позиция рентабельности инвестиций будет соединена с сценическими движениями.
   4. Выберите Lock в программном обеспечении Leonardo, чтобы заблокировать рентабельность инвестиций в нужном положении. Выключите передаваемый свет.
   5. Выберите PRIMO, чтобы загрузить желаемый шаблон шаблона, который будет проецироваться на рентабельность инвестиций в качестве единицы дизайна (см. рисунок 5). Шаблоны будут отображаться в списке выпадающих, именуемых Действиями и отображаемых в меню Действий в программном обеспечении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны шаблоны должны быть разработаны ранее (см. шаг 1) и сохранены в виде 8-битного файла Tiff перед загрузкой шаблона в программное обеспечение.
   6. Для эталонного шаблона необходим лишь небольшой шаблон; например, 3 строки, 1 столбец (см. Рисунок 4E и рисунок 5B). В меню Репликации установите нужное количество столбцов и строк(Линии в программном обеспечении Леонардо). Нажмите Refresh, чтобы понаблюдать за цифровым предварительным просмотром дизайна шаблона.
   7. Установите дозу лазера в меню репликации. Оптимальная доза лазера в этой обстановке и с использованием PLL-PEG составляет 1390 мДж/мм².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная мощность может варьироваться от 5-7,5 мВт/мм². В этом случае, это 7,5 мВт / мм², который занимает около 30 с шаблоном каждого блока конструкции, используя лазерную дозу 1390 мДж /мм². Более высокие дозы лазера могут быть необходимы если поверхность тарелки культуры passivated с PEG-SVA (приблизительно двойная доза лазера сравненная к PLL-PEG). Это должно быть проверено заранее.
   8. Перейдите к периферийной области микроскважины(например, верхней части) от основного региона, интересуемого для генерации шаблонов (центральный регион) микроскважины (см. Рисунок 4E)и выберите Lock. Подождите, пока шаблон не будет отображен.
   9. Отрегулируйте фокус к позиции калибровки (см. шаг 4.1.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сделать дополнительный шаг калибровки системы, если другой пользователь использует тот же микроскоп между патронами для фотопаттернинга.
   10. Выберите символ воспроизведения, чтобы начать узор. Убедитесь, что лазер на в программном обеспечении. Подождите, пока процесс шаблонирования не будет завершен. Длительность шаблонов будет отображаться в панели Сметное время. На программном обеспечении Leonardo версия 4.4 завершается, когда все действия отображаются синим цветом в меню визуализации.
3. Инкубация белка по эталонной схеме
   1. При стерильных условиях, мыть ссылку шаблон микро-хорошо три раза с 20 Зл ПБС, чтобы удалить PLPP.
   2. Добавьте 20 кЛ флуоресцентно маркированного белка ECM (10 мкг/мл ламинина, фибронектина или фибриногена в PBS, см. Таблица Материалов и шаг 6) к эталонному шаблону микроколодца. Инкубировать при комнатной температуре 10-20 мин (в зависимости от белка), защищенного от света (заверните блюдо в алюминиевую фольгу).
   3. После инкубации удалите 18 л белкового раствора и промойте три раза с 20 Зл ПБС; сохранить микроскважины, которые не используются для создания эталонного шаблона (см. Рисунок 4D,E) в 20 Л ПБС.
4. Визуализация и настройка оптимального лазерного фокуса
   1. Визуализируйте эталонный шаблон с помощью микроскопа эпифлюоресценции, 20X объективного и подходящего программного обеспечения (проверить программное обеспечение, используемое в этом исследованиив таблице материалов ). Шаблон отсчета должен быть виден в периферийной области (например, в верхней области скважины), в которой был создан эталонный шаблон (см. рисунок 4E).
   2. Отрегулируйте фокус на краях шаблона через траекторию камеры. Запишите положение в соответствии с лучшим фокусом на шаблоне ссылки. Эта скорректированная позиция будет оптимальным лазерным фокусом, используемым для последующего узора.

5. Настройка программного обеспечения и фотопаттернирование

ПРИМЕЧАНИЕ: После калибровки системы была достигнута (шаг 4), пользователь будет загружать желаемые шаблоны шаблонов (конфигурация шаблона, Рисунок 5) для фотопаттеринга, с возможностью создания шаблонов для одного или нескольких белков в каждом микро-хорошо. Процесс микрошаблонирования включает в себя фотопаттернирование и шаги инкубации белка (см. рисунок 2).

1. При стерильных условиях удалите 18 Л ПБС со всех микроскважин и добавьте 5 л ПЛПП к каждому микроколодцу. Убедитесь, что PLPP однороден на всей поверхности микроскважин.
2. Позиция культуры блюдо с эталонным шаблоном микро-хорошо (Рисунок 4D, E) выше цели и выбрать шаблон в настоящее время в программном обеспечении Леонардо.
3. Визуализируйте микро-колодец с передаваемым светом через траекторию камеры и выберите символ рентабельности инвестиций. Установите диаметр рентабельности инвестиций до 4000 мкм и перекрывай край цифровой рентабельности инвестиций к краю текущего микроколодца. Выберите блокировку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: форма и диаметр рентабельности инвестиций зависит от конструкции и размера используемого трафарета PDMS. Например, при использовании 5000 х 5000 мкм PDMS квадратных трафаретов, используйте 5000 х 5000 мкм в квадрате рентабельности инвестиций.
4. Повторите перекрывающийся шаг (шаг 5.3) для каждого микроколодца блюда. После завершения выключите передаваемый свет.
5. Перейдите к центру микро-ну эталонного шаблона, подальше от области эталонного шаблона, и выберите PRIMO, чтобы загрузить желаемый шаблон шаблона, который будет проецироваться на рентабельность инвестиций в качестве единицы дизайна (см. рисунок 5). Шаблоны будут отображаться в списке выпадающих, именуемых Действиями и отображаемых в меню Действий в программном обеспечении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны должны быть разработаны перед экспериментом и сохранены в виде 8-битного файла Tiff перед загрузкой шаблона в программное обеспечение.
6. Для того, чтобы создать шаблон по всему микро-хорошо, дизайн блока должны быть воспроизведены. Конструкционный блок занимает около 0,1 мм² микроколодца. В меню Репликации установите нужное количество столбцов и строк(линии в программном обеспечении) (см. рисунок 5).
7. Для создания непрерывного шаблона отрегулируйте расстояние между столбиками и линиями; в этом исследовании, модели непрерывных полос получаются с помощью от -20 до -35 мкм интервал (отрицательный интервал) между столбиками. Это отрицательное расстояние создает перекрытие между единицами дизайна(Рисунок 5B,C).
8. Установите дозу лазера в меню репликации. Оптимальная доза лазера в этой обстановке и с использованием PLL-PEG составляет 1390 мДж/мм². Длительность шаблона будет отображаться в панели Сметное время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае мощность лазера составляет 7,5 мВт/мм², принимая примерно 30 с шаблоном каждого блока конструкции, используя дозу 1390 мДж/мм². Например, проектная единица (0,1 мм^2),реплицированная в 4 колонны и 4 линии (около 1,6 мм^2),займет 8 минут для узора. Более высокие дозы лазера могут быть необходимы если поверхность тарелки культуры passivated с PEG-SVA (приблизительно двойная доза лазера сравненная к PLL-PEG).
9. Выберите блокировку и подождите, пока шаблон будет практически отображен.
10. Чтобы обновить параметры шаблона, нажмите на соответствующее действие,затем разблокировать и обновить параметры. Выберите блокировку снова, когда обновление шаблона завершено.
11. Узорство нескольких белков в одном микроколодце (последовательные микроузорные раунды) требует точного выравнивания шаблонов. Для достижения такого выравнивания загрузите все наборы желаемых шаблонов шаблонов одновременно (шаблоны первого и второго раундов фотопаттернинга).
12. Установите параметры репликации и дозы шаблонов шаблонов. После установки параметров шаблоны будут отображаться как Действия в списке действий. Сохранить эту конфигурацию шаблона в качестве файла в программном обеспечении (см. Рисунок 5D).
13. В списке действий выберите только конкретные действия, которые должны быть шаблонизированы в ходе первого раунда шаблонирования, и отоберите действия, которые будут узоризированы во время второго раунда шаблонирования (см. рисунок 5D).
14. Перейдите в область, где эталонный шаблон был создан в шаге 4.2 (например, верхняя область микро-наилучшим образом эталонного шаблона, см. Рисунок 4E). Отрегулируйте фокус к оптимальной позиции (получено в шаге 4.4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется выбрать идеальную систему фокусировки на используемом микроскопе (при наличии), что гарантирует, что оптимальное положение для шаблонирования будет поддерживаться на протяжении всего процесса фотопаттернинга.
15. Выберите символ воспроизведения, чтобы начать узор. Длительность шаблонов будет отображаться в панели Сметное время. На программном обеспечении Leonardo версия 4.4 завершается, когда все действия отображаются синим цветом в меню визуализации.

6. Инкубация белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроколодцы инкубируются белками ECM (желательно флуоресцентно помечены). Они будут связываться только с областями, где ПЭГ была расщеплена через процесс фотопаттернинга, описанный в шаге 5. Каждый из скважин содержит трафарет PDMS с 4 микроскважинами, что позволит одновременно тестировать 4 различных состояния, например, инкубацию разного белка в каждом микроскважине (см. рисунок 4D).

1. Используйте флуоресцентно помеченные белки (например, ламинин, фибронектин или фибриноген, спряженные с красными или зелеными флюорофорами), чтобы визуализировать микрошаблоны (см. шаг 6.7 и 9.4). Кроме того, адсорбированные немаркированные белки могут быть визуализированы на более поздних стадиях с помощью иммунофлуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белки ECM (например, фибронектин) могут быть помечены с помощью существующих протоколов³³ и коммерчески доступных комплектов флуоресценции маркировки (т.е. Alexa 488 маркировки комплект), или приобреллегко помечены (например, сопряженный фибриноген-488 или ламинин-красный флуоресцентный родамин, см. Таблица материалов).
2. При стерильных условиях подготовьте желаемую концентрацию белков ECM (10 мкг/мл ламинина, фибронектина или фибриногена в PBS, см. Таблицу Материалов и шаг 4.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентно помеченные белки ECM светочувствительны и должны быть защищены от света (оберните блюдо в алюминиевую фольгу) и должны храниться на льду во все времена.
3. При стерильных условиях, мыть микроскважины три раза с 20 Л Л PBS для удаления PLPP.
4. Удалить 18 Л PBS из всех микроскважин и добавить 20 зл и l раствора белка ECM к каждому микро-хорошо. Инкубировать при комнатной температуре, в течение 20-30 минут и защитить от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации покрытия может варьироваться в зависимости от типа и концентрации белков.
5. После инкубации удалите 15 л раствора белка ECM и трижды промойте микроколодцы 20 Л.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда оставляйте около 5 Л PBS между стихает.
6. Если узор с одним белком (один раунд микро-паттернинга), перейти либо к хранению культуры блюдо (шаг 10) или клеточное покрытие (шаг 11, и см. Рисунок 2). При выполнении второго раунда микро-паттернинга с другим белком в том же микро-колодце, перейдите либо к хранению блюда культуры (шаг 10) или к блокированию неспецифических связывающих сайтов (шаг 7, и см. Рисунок 2).
7. Дополнительный шаг контроля качества: визуализация и изображение печатных моделей с помощью эпифлюоресцентного микроскопа до покрытия клеток. Выберите подходящие флуоресцентные каналы и соответствующим образом отрегулируйте время экспозиции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сравнить интенсивность флуоресценции моделей между экспериментами, важно использовать то же время воздействия для тех же белков.

7. Блокирование неспецифических связывающих сайтов (только для нескольких белковых моделей)

ПРИМЕЧАНИЕ: Микро-узор с несколькими белками в одном микроколодце включает в себя последовательные шаги шаблонирования (см. рисунок 2). Блокирующий агент (PLL-PEG или BSA) добавляется в микроколодцы для предотвращения перекрестного связывания, что происходит, когда второй инкубированный белок (шаг 9) связывается с первым инкубированным белком (шаг 6), тем самым избегая смеси белков в рамках шаблонов.

1. При стерильных условиях добавьте 20 л PLL-PEG (0,1 мг/мл в PBS) или BSA (1% BSA в PBS) в качестве блокирующего шага для предотвращения перекрестного связывания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность блокирования может варьироваться в зависимости от характера используемых белков и сродства между ними. Рекомендуется проверить как PLL-PEG и BSA в качестве блокирующих агентов заранее(рисунок 10D-I).
2. Инкубировать блокирующий агент при комнатной температуре 1 ч и защищать от света. Удалите 15 зл блокирующего агента и промойте все микроколодцы три раза с 20 Зл PBS. Всегда оставляйте около 5 л PBS между стихами.
3. Удалите 18 Л PbS из всех микроскважин и добавьте 5 л ПЛПП к каждому микроколодцу, гарантируя, что ПЛПП однородна на всей поверхности микроскважин.

8. Второй раунд фотопаттернинга (только для нескольких белковых моделей)

ПРИМЕЧАНИЕ: После первого раунда фотопаттернинга и инкубации белка генерируется микрошаблон. Во время второго раунда фотопаттернинга, узор для второго белка будет генерироваться в том же микро-хорошо (см. Рисунок 2C и рисунок 5D). В программном обеспечении выберите правильные шаблоны шаблонов (действия), которые будут узорчатыми во время этого раунда (см. рисунок 5D).

1. Перейдите к первому микроколодцу(рисунок 4D). Обеспечить надлежащее перекрытие между цифровой рентабельностью инвестиций и микроскважиной.
2. Загрузите конфигурацию шаблона, сохраненную ранее (шаг 5.12) и выберите действия, которые будут узорчаты во время второго раунда фотопаттернинга (отбрасывание действий из первого раунда, см. Рисунок 5D).
3. Выберите символ воспроизведения, чтобы начать узор. Убедитесь, что лазер на в программном обеспечении.

9. Второй раунд инкубации белка (только для нескольких белковых моделей)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части протокола, флуоресцентно помечены белка / с будут инкубированы на блюдо культуры после второго раунда фотопаттернинга.

1. При стерильных условиях, мыть микро-хорошо три раза с 20 Л ПБС, чтобы удалить PLPP. Удалите 18 л PBS и добавьте 20 л раствора белка ECM к каждому микроколодцу. Инкубировать при комнатной температуре 20-30 мин и защищать от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации покрытия может варьироваться в зависимости от типа и концентрации белков.
2. После инкубации удалите 15 л раствора белка ECM и трижды промойте микроколодцы 20 Л. Всегда оставляйте около 5 л PBS между стихами.
3. Либо перейти к хранению культуры блюдо (шаг 10) или клеточное покрытие (шаг 11, и см. Рисунок 2).
4. Дополнительный шаг контроля качества: использование эпифлюоресцентного микроскопа, визуализация и изображение печатных моделей перед покрытием клеток. Выберите подходящие флуоресцентные каналы и отрегулируйте время экспозиции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сравнить интенсивность флуоресценции моделей между экспериментами, важно использовать то же время воздействия для тех же белков.

10. Хранение микрошаблонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Микро-шаблоны с адсорбемыми белками могут храниться во время различных этапов протокола (см. рисунок 2). Если микро-паттернирование с несколькими белками, микро-шаблоны могут храниться после первого раунда микро-паттернирования или после двух последовательных раундов микро-паттернинга были завершены (см. Рисунок 2B).

1. При пассивировании с PLL-PEG, храните микро-шаблоны в PBS (3 мл на скважину) при 4 градусах Цельсия в течение 3 дней.
2. Если блюдо из культуры было просажено PEG-SVA, микрошаблоны могут храниться до 1 месяца. Для этого интенсивно промыть микрошаблоны с двойной дистиллированной деионированной водой и высушить стерильной пневматикой из аргона или азота, хотя также можно использовать нормальный воздух. После сушки микрошаблоны могут храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 1 месяца (группа поддержки системы PRIMO, личное общение).

11. Покрытие ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время следующих шагов, клетки будут покрыты на подготовленных микро-узором культуры блюдо / эс. В этих исследованиях используется нейрональная клеточная линия (клетки CAD)^31. Однако этот протокол может быть скорректирован для изучения других типов клеток интереса (отрегулировать протокол попокрытию ячейки по мере необходимости).

1. Дифференцированные клетки CAD для 48 h используя средство дифференциации (DMEM дополнено с 1% Глютамин, без сыворотки, и с 1% ручкой/Strep, см. Таблица материалов).
2. Плита 1 мл среды с клетками во внутреннем стекле хорошо, охватывающих все микроколодцы и поместить блюдо культуры в 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ инкубатора.

Результаты

После вышеупомянутого протокола приводит к микро-узорчатые поверхности, покрытые ECM белка / s интереса. Мы используем эти шаблоны для отслеживания поиска нейронов.

Генерируемые шаблоны должны быть точным представлением шаблона. Пример показан на рисунке 6, где цифровой шаблон шаблона(рисунок 6A),представляющий одну единицу дизайна(рисунок 5B), привел к определенным микрошаблонам, в диапазоне от 20 до 2 мкм шириной, покрытой помеченной Фибриноген(рисунок 6B). С помощью ImageJ, измерения интенсивности флуоресценции были получены как вертикально(рисунок 6C),так и горизонтально(рисунок 6E) вдоль полосы и из соответствующей фоновой области 15 мкм выше каждой полосы. Измерения фона были вычтены из измерений шаблона для каждой ширины полосы.

Одним из ограничений системы является то, что эффект края может наблюдаться(Рисунок 6B, верхняя полоса) при печати особенностей 20 мкм, с более высокой интенсивностью сигнала на краях шаблона по сравнению с центром (Рисунок 6D, первый пик флуоресцентный профиль интенсивности). В наших экспериментах предел разрешения составлял примерно 2 мкм; при такой ширине мы наблюдали значительное снижение (примерно на 50%) в интенсивности фибриногенной флуоресценции по сравнению с интенсивностью более широких полос(рисунок 6F, G). Шаблоны с использованием системы PRIMO и протокола, изложенного здесь, произвели воспроизводимые закономерности, с самым высоким стандартным отклонением средней флуоресцентной интенсивности, измеренной для ширины 2 мкм от четырех отдельных реплицированных блоков конструкции (Рисунок 6 G). Вариации в узорчатых полостакжектакже также было установлено, что низкий; коэффициент вариации варьировался от 3 до 10%, при этом 20 мкм и 2 мкм полосы имели наибольший внутренний виразийный эффект. Это, вероятно, является результатом эффекта края и предел разрешения системы, соответственно. Обратите внимание, что для этих измерений мы только измерили интенсивность в центре полос, чтобы избежать неравномерного освещения в результате цели, используемой для приобретения этих изображений (виньетирование, Рисунок 6E).

Некоторые эксперименты могут включать вопросы, которые требуют определенных концентраций белка, которые могут быть достигнуты двумя способами: 1) изменяя концентрацию белка(рисунок 7A,B). Инкубация с различными концентрациями ламинина приводит к значительной разной интенсивности флуоресценции, увеличиваясь с более высокими концентрациями белка(рисунок 7В). 2) Лазерная доза, которая используется для расщепления анти-клейкой пленки (PEG) может быть разнообразным. Более высокие дозы лазера удалит antifouling пленку к большой степени, создавая больше связывая мест для протеинов интереса (Рисунок 7C.D) приводящ к в значительно по-разному интенсивности флуоресценции, увеличивая с более высоким лазером дозы(рисунок 7D).

Изменение дозы лазера позволяет образовать градиенты белка в рамках той же схемы. Это отображается на рисунке 8A, где шаблон градиента был разработан с использованием различных уровней серой шкалы, от черного (без лазерной мощности) до белого (максимальная мощность лазера).

Интенсивность лазера пропорциональна серому уровню шаблона (от 0 до 255 на 8-битном изображении), генерируя градиенты УФ-освещения. Измерение профиля интенсивности флуоресценции вдоль градиентной полосы является линейным в шаблоне шаблона(рисунок 8B) и в сгенерированном шаблоне градиента(рисунок 8C,D). Это воспроизводимо среди всех градиентных полос в рамках одного шаблона и шаблона градиента(рисунок 8B,D). Поколение таких градиентов чрезвычайно полезно и помогает имитировать среду in vivo, где клетки часто реагируют на градиенты биологически активных белков^34,35,36,37.

Клетки чувствуют изменение внеклеточной среды, но анализы, которые позволяют изучать поведение клеток, когда клетки сталкиваются с такими изменениями ограничены. LIMAP может быть использован для микро-паттерн с несколькими белками в том же микро-колодец. Примеры показаны на рисунке 9, где поперечные шаблоны были созданы с полосами фибронектина (горизонтальный) и ламинина (вертикальный). При создании шаблонов с несколькими белками, важно использовать блокирующий шаг между первой и второй инкубации белка, чтобы предотвратить перекрестную связывание белков (см. шаг 7). Эффективность блокирования может варьироваться в зависимости от биохимических характеристик белков, которые используются для покрытия, и мы советуем тестирование нескольких блокирующих буферов, включая PLL-PEG (0,1 мг/мл) и BSA (1%). Чтобы оценить этот кросс-обязательный эффект, мы выполнили измерения интенсивности флуоресценции с помощью ImageJ(рисунок 9)и показали, что перекрестная связывание может быть резко уменьшено, используя буфер PLL-PEG (0,1 мг/мл) для фибронектина и ламинина кросс-шаблоны(рисунок 9D, H).

Сгенерированные кросс-шаблоны были использованы для клеточных анализов с клетками CAD(Рисунок 10A,B) или крысиный корня ганглия (DRG) нейронов (Рисунок 10C). Их нейриты (CAD) и аксоны (DRG) растут по разным линиям. CAD клетки используются в качестве нейрональной модели, поскольку они показывают аналогичный профиль экспрессии integrin по сравнению с первичными нейронами, и они по-прежнему отображать актин богатых конусов роста после 48 ч в культуре (Рисунок 10B), что делает их пригодными для поиска путей Исследования.

Для того, чтобы исследовать возможные цитотоксические эффекты генерируемых микро-шаблонов к первичным нейронам, DRG нейроны были изолированы и культивированы на микро-шаблоны после ранее опубликованного протокола³⁸. Результаты показывают, что первичные нейроны переносят микрошаблоны окружающей среды(рисунок 10C). В настоящее время мы изучаем, как различные белки ECM влияют на аксональный (нейрит) поиск пути. Предварительное доказательство концепций, найденных в клетках CAD, будет дополнительно исследовано с помощью нейронов DRG. Для того, чтобы проверить качество генерируемых микрошаблонов, желательно изображения моделей флуоресценции микроскопии для обеспечения края шаблона четко определены, прежде чем приступить к клеточному покрытию. В процессе визуализации важно обеспечить оптическую регулировку между микроскопом и камерой, чтобы избежать эффекта периферического затемнения (виньеттирования), который влияет на задний анализ и интерпретацию данных. Кроме того, приобретите изображение области, свободной от шаблонов, используя то же время экспозиции, которое будет использоваться для изображения шаблонов и вычесть это изображение из изображения шаблона.

Таким образом, для хорошего качества микро-шаблон поколения, желательно оценить концентрацию белка (Рисунок 7A, B), лазерные дозы (Рисунок 7C, D), уровень белка фона(Рисунок 6E, F, H) и эффективный блокирующий шаг(рисунок 9)при использовании нескольких белков. Окончательно, качество микрошаблонов, генерируемых с помощью LIMAP, имеет важное значение для получения надежных и воспроизводимых данных из клеточных анализов.

Рисунок 1: Схема методов микрошаблонирования: микроконтактная печать и лазерная узор. (A) Microcontact печать использует литографии мастера с определенными микро-функций для создания марки PDMS, которая инкубируется с белком интереса. Этот белок затем передается (штамп) на стеклянную поверхность, генерируя белковые микрошаблоны. (B) Лазерные методы моделирования включают фотопаттернинг и прямой лазерный узор. (C) Большинство подходов фотопаттернинга используют источник ультрафиолетового света и фотомаску (либо при контакте с поверхностью субстрата, либо в фокусной плоскости цели) с желаемой геометрией для того, чтобы расщеплять антифолинную поверхность ПЭГ в определенных положениях, создание определенного шаблона. Последующий шаг инкубации белка приводит к адсорбции белка только в лазерно-расщепляемых регионах. (D) LIMAP является методом фотопаттернинга, который не требует фотомаски в контакте с субстратом (т.е. без маски и бесконтактного подхода). LIMAP использует фото-инициатора, который активируется низкими дозами лазера, расщепляя свето-экспонированные области ПЭГ. Это создает места вложения для последовательного адсорбции белка. (E) Прямой лазерный узор использует высокий энергетический свет, чтобы непосредственно травить пленку PEG, позволяя связывания белка в этих травленных регионах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Схема, показывающая резюме шагов в протоколе микрошаблонирования. (A) Микро-узор с одним протеином включает только один круг микро-паттернинга (фотопаттернирование и инкубация протеина) и может быть выполненв в под 8 h. (B) Микро-паттернирование с множественными протеином требует 2 последовательных кругов микро-паттернинга и может быть завершена в течение 1-2 дней, в зависимости от количества микро-шаблонов готовится. Пройти B-версию протокола можно за 1 день работы. Непрерывные стрелки указывают прямой поток шагов в протоколе. Непрекращающиеся стрелки указывают на то, что между одним шагом и другим существует значительный промежуток времени (см. шаг 6.6 и 9.3). (C) Схематический вид примера моделей, полученных после одного раунда микро-патеринг (красные полосы) или два последовательных раундов микро-узора (красные и зеленые полосы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Генерация шаблонов шаблонов является универсальной с LIMAP. (A, B) Примеры шаблонов шаблонов, разработанных с помощью ImageJ (арбалеты, буквы B). Формы, нарисованные белым цветом, проецировались с максимальной мощностью лазера, а формы, нарисованные черным цветом, не проецировались. (C,D) Микро-шаблоны, полученные с помощью LIMAP из шаблонов после инкубации с 10 мкг/мл фибриногена (зеленый). (C) Арбалеты 50 мкм шириной и 50 мкм высотой, расположенных на 75 мкм горизонтально и 50 мкм вертикально. (D) Буквы 80 мкм шириной и 85 мкм высотой. Шкала баров в C и D представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Основные материалы для протокола LIMAP. (A) Трафареты, используемые в этом протоколе, имеют диаметр 20 мм, тонкие круглую форму PDMS (толщина 250 мкм), содержащие 4 микроколодцы (по 4 мм в диаметре). Объемы, используемые в микроскважинах, варьируются от 5 до 20 кВ, что значительно сокращает количество реагентов и белков, необходимых для каждого эксперимента. (B) 6 хорошо стеклянное дно блюдо, где трафареты уже были помещены в каждом колодце. Микроколодцы содержат 20 Л PBS, чтобы сделать их видимыми. (C) Калибрионная тарелка, в которой внутреннее стекло хорошо был отмечен зеленый маркер, который будет использоваться для калибровки лазерного фокуса. (D) Схематический вид верхней левой хорошо от 6-ну хорошо стеклянное нижнее блюдо в B (очертено с пунктирной красный круг). Внутреннее дно стекла хорошо представлено в белом цвете, а трафарет - в сером цвете. Трафарет содержит 4 микроскважины (число 1-4), для тестирования 4 различных экспериментальных условий (например, различных концентраций белка, геометрии шаблона, комбинаций белков и т.д.). Звездочка представляет собой микро-хорошо, содержащее эталонный шаблон. (E) Схематический вид микро-колодца, где эталонный шаблон был создан в верхней части (стрелка с заполненной наконечником стрелы). Этот эталонный шаблон необходим для получения оптимального лазерного фокуса для шаблонирования (см. шаг 4). Стрелка с пустой наконечником стрелы указывает на центральную область микроколодца, которая будет использоваться для последующего узора после калибровки системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Настройка программного обеспечения для микрошаблонирования. (A) Шаблон шаблона с параллельными полосами, разработанными с ImageJ и сохраненными как 8-битный файл Tiff. (B-D) Схематическое представление цифровых ROIs (регионов, представляющих интерес), которые будут пересекаться с текущими микроскважинами, где будут создаваться микрошаблоны. (B) Шаблон шаблона, который будет использоваться (длина 1824 пикселей 415 мкм, ширина 1140 пикселей 260 мкм) выбран на Леонардо и прогнозируется на рентабельность инвестиций в качестве единицы дизайна (красные полосы в черном пунктирной прямоугольник), который будет охватывать примерно 0,1 мм² микроколодцы. Проектное устройство реплицируется в 4 столбца и 4 строки в меню репликации (конфигурация шаблона), создавая шаблон в микроколодце. ПРИМЕЧАНИЕ пространство среди столбцов. (C) Чтобы узор непрерывных полос, расстояние между столбцов должна быть скорректирована. В этом случае для достижения перекрытия между блоками проектирования расстояние между столбиками устанавливается в меню репликации как отрицательное расстояние, -20 мкм. (D) Для того, чтобы узор несколько белков в том же микро-хорошо, точное выравнивание моделей Обязательно. Во время шага настройки программного обеспечения (шаг 5) загружайте все желаемые шаблоны шаблонов одновременно. В списке действий выберите только конкретные действия, которые должны быть шаблонизированы во время каждого раунда шаблона, и отойдите остальные действия (шаг 5.12, 5.13 и 8.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Анализ изменчивости шаблона с использованием LIMAP. (A) Шаблон шаблона, разработанный с ImageJ используется для микро-шаблон четыре полосы различной ширины (20, 10, 5, 2 мкм, сверху вниз). (B) Микро-шаблон, полученный после инкубации с 10 мкг/мл флуоресцентно-маркированного фибриногена (зеленый). (C) Измерения интенсивности вдоль вертикальной линии, пересекающих полосы микрошаблона. (D) Вертикальный профиль интенсивности флуоресценции, полученный в измерении в (C). ПРИМЕЧАНИЕ что на более больших ширинах (20 мкм) есть изменение в вертикальном профиле, вызванное накоплением белка по краям полосы, в результате чего два различных пика интенсивности флуоресценции (эффект края). Этот эффект виден только в ширине полосы 20 мкм. (E) Измерения интенсивности вдоль изображенных горизонтальных линий (флуоресценция и фон). (F) Горизонтальные профили интенсивности флуоресценции, полученные в соответствии с измерениями в (E). (G) График, показывающий среднее интенсивность для каждой ширины полосы, измеренный из четырех отдельных реплицированных блоков дизайна (межшаблонная вариация). ПРИМЕЧАНИЕ снижение адсорбции белка к шаблонам 2 мкм шириной полосы. (H) Вариация в пределах узорчатых полос (коэффициент вариации) была низкой для всех ширин полос, в диапазоне от 3 до 10%. Данные в G и H, показанные как средние SD. Статистический анализ в G и H был выполнен с использованием одностороннего непараметрического теста ANOVA (Kruskal-Wallis) с несколькими сравнениями. Значение P составляет 0,001 евро для значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Эффект вариаций в лазерной мощности и концентрации белка для эффективности адсорбции белка. (A) Поверхность PLL-PEG была лазерной расщеплена с постоянной лазерной дозой (1390 мДж/мм²⁾и инкубирована с указанными концентрациями флуоресцентно помеченного ламина (пурпурного). (B) Количественная оценка интенсивности флуоресценции полос ламинина в (A). (C) Различные указанные лазерные дозы были применены с последующим инкубации с той же концентрацией (10 мкг/мл) флуоресцентно помечены фибронектин (зеленый). (D) Количественная интенсивность флуоресценции полос ыфбронектина в (C), показывающие, что более высокие дозы лазера коррелируют с более высокими уровнями адсорбированных белков. Все измерения вычитаются фоновыми. Номера образцов указаны в нижней части столбцов; данные отображаются как средние - SEM. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического теста Манн-Уитни с двуххвостым расчетом. P-значение составляет 0,0001 евро по значимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 8: Поколение градиента концентрации белка в микрошаблоне. (A) Шаблон шаблона градиента в сером масштабе. (B) Профиль интенсивности флуоресценции измеряется из (A). (C) Шаблон, полученный с LIMAP из шаблона шаблона в (A) после инкубации с 10 мкг/мл флуоресцентно помечены фибронектин (зеленый). (D) Флуоресценция интенсивность профиля n и 3 полосы и фон представлены как среднее SEM, показывая линейное увеличение интенсивности градиента белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 9: Кросс-связывающий эффект при последовательном узоре нескольких белков. (A-C, E-G) Кросс-паттерны с 10 мкм полосами флуоресцентно-маркированного фибронектина (циана, горизонтального) и флуоресцентно маркированного ламинина (пурпурный, вертикальный). (A-C) Образцы, обработанные блокирующим буфером BSA. (E-F) Образцы, обработанные PLL-PEG для блокировки неспецифических связывающих сайтов (шаг 7). (A, E) Слияние каналов флуоресценции, показывающее как фибронектин, так и ламинин. (B,F) Изображение, показывающее только фибронектин. (C,G) Изображение, показывающее только ламинин. Для C, обратите внимание на наличие ламинина также на горизонтальных фибронектин положительных полос, что связано с неэффективной блокировки незанятых связывающих сайтов с BSA. Для G, обратите внимание, что блокирование с PLL-PEG предотвращает эффективное привязывание ламинина к полосам фибронектина. (D,H) Профили интенсивности флуоресценции, полученные из указанных измерений (диагональная желтая линия) в A и E, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 10: Кросс-шаблоны для исследования нейрита/аксона поиска путей. (A-C) Кросс-паттерны с 10 мкм полосами флуоресцентно-маркированного фибронектина (циана, горизонтального) и флуоресцентно маркированного ламинина (пурпурный, вертикальный). (A, B) Флуоресцентные изображения клеток CAD с невритами, растущими вдоль микрошаблонов. Для визуализации невритов, клетки были культивированы в течение 48 ч, фиксированной с 4% PFA и окрашенных для тубулина (A) или тубулин и актин (B). (C) Крыса дорсал-корень ганглия (DRG) нейронов с аксонами, растущие вдоль микро-шаблонов. Чтобы визуализировать аксоны, DRG нейроны были культивированы для 72 ч, фиксированной с 4% PFA и окрашенных для тубулина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 11: Примеры общих отрицательных результатов, полученных при генерации микрошаблонов с LIMAP. (A-C) Субоптимальные узорчатые полоски 10 мкг/мл флуоресцентно маркированного фибриногена (зеленого цвета), полученные при различных обстоятельствах. ( A ) микро-хорошо высохли во время генерациишаблона. Обратите внимание на высокий уровень флуоресценции в фоновом режиме (стрелка) и наличие кристаллов PBS (звездочек). (B) Сшивание между полосами не было должным образом отрегулировано во время настройки программного обеспечения, что привело к разрывным полосам с зазорами (стрелка) среди конструкторских блоков (см. шаг 3.4.7). (C) Лазерный фокус был субоптимальным вызывая рассеянные полосы (стрелки), которые не представляют фактические ширины полосы шаблона шаблона, который должен быть 20, 10, 5, 2 мкм сверху вниз, как в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Преимущества микрошаблонирования LIMAP (PRIMO) и сравнение с микроконтактной печатью
В то время как микроконтактная печать, возможно, является наиболее часто используемым методом микрошаблонирования в биологической области³⁹, кажется, что все большее число исследователей, использующих технологию LIMAP^{40,41,42 ,43,44}. Здесь мы представили протокол с использованием PRIMO, коммерчески доступной системы для LIMAP. Ниже мы кратко ообсуждаем потенциальные преимущества и ограничения микроконтактной печати и фотоузоринга LIMAP.

Микроконтактная печать требует литографии мастеров, произведенных путем спин-покрытия фотомаски (как правило, SU-8) на стеклянную или кремниевую пластину, которая затем лазерная травления с желаемыми микро-функциями. Эти мастера используются в качестве шаблонов для создания штампа PDMS⁴⁵. Марка инкубируется с выбранным белком, который адсорбирует к нему, а затем передается (штамп) на блюдо клеточной культуры. Процесс адсации белка на печать PDMS зависит от концентрации белка, буфера и времени инкубации. Эти параметры должны быть проверены заранее для оптимальных результатов⁴⁶.

Мастера могут быть использованы в значительном количестве экспериментов, длящихся в течение нескольких месяцев или даже лет, если правильно сохранены. Однако ограничивающим фактором этой технологии является необходимость переоформления новых литографий мастеров для каждой желаемой модификации. Изменения в экспериментальных конструкциях могут привести к трудоемким производству новых мастеров (до нескольких недель), что приведет к задержке экспериментов. Для сравнения, фотопаттернирование LIMAP не требует физического мастера; он использует созданные программное обеспечение шаблоны шаблонов, которые могут быть использованы для гибкой адаптации желаемой геометрии микрошаблонов к меняющимся исследовательским вопросам. LIMAP также может быть использован для генерации градиентов белка в пределах одного и того же микрошаблона(рисунок 8),который труднее получить воспроизводимым образом с помощью микроконтактной печати^47.

Кроме того, разрешение микрошаблона, достигнутое с LIMAP, в нашем случае, составляет 2 мкм(рисунок 6B).

Подойдя к этому решению, повышается вариабельность внутри- и межшаблонов. Генерация узоров вокруг или выше 10 мкм шириной была высоко воспроизводимой(рисунок 6G,H). Напротив, при микроконтактной печати трудно последовательно получать разрешения ниже 10 мкм, и часто можно найти артефакты при штамповке небольших объектов (данные не показаны).

Мы показали, что LIMAP может быть использован для микро-шаблон аттек нескольких белков(Рисунок 9) в рамках одного и того же микро-хорошо, что позволяет дополнительные уровни сложности, которые будут добавлены к экспериментам. Хотя это может быть достигнуто с помощью микроконтактной печати, выравнивание различных белков с высокой точностью может быть технически довольно требовательным. В то время как узорство нескольких белков с помощью LIMAP кажется прямо вперед, важно отметить, что перекрестные связывания белков через последовательные процедуры покрытия могут быть уменьшены путем блокирования реагентов, но не полностью устранены(рисунок 9).

Что касается стоимости того или иного метода, LIMAP, как описано здесь, требует закупки микро-шаблонного оборудования (PRIMO), которое может быть установлено на различных флуоресцентных микроскопах и требует моторизованной стадии. Хотя эти инвестиции первоначально являются затратными, нет никаких дополнительных закупок, кроме расходных элементов (трафареты, PEG и PLPP) в долгосрочной перспективе, связанной с LIMAP. Кроме того, трафареты PDMS также могут быть произведены в лаборатории собственным экспериментатором после опубликованных протоколов^18,32. Самые большие затраты на микроконтактную печать могут быть связаны с производством новых мастеров, которые могут стать существенными, если эксперименты потребуют новых шаблонов.

Одним из недостатков LIMAP является относительно низкий пропускной подход этого метода. Микроконтактная печать может производить большое количество микрошаблонов быстро и эффективно в одновременной штамповки шаг, по сравнению с требуемой последовательной лазерной микро-шаблонов с LIMAP. Например, можно изготовить 6 штампованных стеклянных чехлов примерно за 2 ч с микроконтактной печатью с использованием штампов PDMS (за исключением подготовки штампов); узорство аналогичной области (6-хорошо блюдо) с LIMAP займет около 4 ч, за исключением процедуры поверхности passivation (учитывая конфигурацию шаблона шаблона, описанную в шаге 5.12 и см. Рисунок 5B).

Другим ограничивающим коэффициентом скорости технологии LIMAP является длительное время освещения, необходимое для узороплетения больших площадей (30 с на единицу конструкции с лазером 7,5 мВт/мм^2). В этих случаях предпочтительным вариантом может быть микроконтактная печать. Недавно доступный фото-инициатор (PLPP гель, Таблица материалов) должен значительно сократить время, заехающее для узора, что позволяет генерации сотен микро-шаблонов на больших площадях (до 8 мм²) всего за несколько минут.

Другим важным фактором, учитывающим, когда микрошаблоны поверхностей для клеточной культуры является воспроизводимость микрошаблонов между различными экспериментальными повторами, по сравнению с изменчивостью, полученной при микроконтактной печати. Например, графики, показанные на рисунке 7B,D, являются репрезентативными данными трех независимых экспериментальных повторов с очень похожими результатами (данные не показаны). Основываясь на нашем опыте и предыдущих публикациях, этот уровень воспроизводимости трудно достичь с микроконтактной печатью^{48,49,50,51,52}.

В отличие от других методов фотоузоринга, которые требуют либо выделенной химии для инженера фоточувствительных материалов, либо использования фоточувствительных материалов, которые, как правило, не очень биосовместимы³, фоточувствительный компонент LIMAP (PLPP ) является биосовместимым и хорошо переносится клетками^21; в наших руках мы не испытывали какой-либо цитотоксичности в различных клетках, в том числе CAD, DRG нейронов(рисунок 10), фибробласты, эпителиальные клетки, и клетки меланомы (данные не показаны). Еще одним преимуществом LIMAP с использованием PRIMO по сравнению с другими методами фотоузоринга является то, что фотомаска не требуется. Как и в случае с микроконтактной печатью, новые фотомаски должны быть разработаны и сгенерированы для каждого желаемого шаблона.

Все ограничения, упомянутые выше для микроконтактной печати, относятся к ручному подходу метода. Тем не менее, можно повысить пропускную мощность и воспроизводимость микроконтактной печати с помощью автоматизированного устройства с печатью нагрузки и контроля давления^53.

Основные этапы протокола и решения проблем для LIMAP с использованием PRIMO
Одна из наиболее распространенных проблем, обнаруженных во время этого протокола, имеет высокий уровень фоновой флуоресценции в микро-шаблонах. Это может быть связано с высыхать из микроскважин, которые часто происходит из-за их небольшого объема. Когда это происходит, кристаллы PBS часто появляются вокруг eCM моделей(рисунок 11A).

Недостаточное или неэффективное мытье после инкубации белка может также привести к высокому уровню фоновой флуоресценции. Это можно наблюдать, в частности, при использовании концентрации белка 10 мкг/мл(рисунок 11В) или выше. Избыток белка в фоновом режиме может быть уменьшен путем включения дополнительных шагов мытья с PBS.

Присутствие белкового фона должно быть измерено и охарактеризовано в каждом эксперименте, вычисляя интенсивность фоновой флуоресценции(рисунок 6E)и вычитая его из интенсивности микрошаблонов(рисунок 6F-H и рисунок 7B, D). Высокий фон белка может иметь влияние в вложении и прорастания клеток CAD, ставя под угрозу интерпретацию результатов.

Наличие пробелов между блоками проектирования является общей проблемой, когда пользователи имеют ограниченный опыт(рисунок 11B), что происходит в результате недостаточного перекрытия между шаблонами. Два параметра в программном обеспечении Leonardo могут быть скорректированы для преодоления этого: 1) отрицательный интервал между столбцов может потребоваться, в зависимости от конструкции шаблона (шаг 5.7 и см. Рисунок 5B, C). Кроме того, 2) используйте вариант градиента в меню экспертов, чтобы сшить столбцы. Быстрый тест для определения оптимальных параметров интервала может быть выполнен с помощью УФ-клей (Таблица материалов). Небольшая капля этого клея наносится на стеклянную горку, которая затем покрывается стеклянным покрытием, делая пленку. Встроенный УФ-клей фотопаттернссс с шаблоном интерес с помощью низкой дозы лазера (30 мДж / мм²). УФ-открытые области встроенного клея будут излечены, становясь видимыми под ярко-поляной микроскопией. Результаты теста визуализированы для оценки полученного интервала внутри шаблона. В наших нейрональных экспериментах разрыв между полосами может негативно сказаться на поведении клеток, производя изменения в динамике роста (либо снижение скорости, либо оставление пути).

В последнем обновлении программного обеспечения Leonardo (на момент публикации, Leonardo 4.11), можно загрузить ранее разработанные большие шаблоны шаблонов, которые охватывают гораздо большую площадь (до 8 мм² с использованием 20X цель) поверхности микроколодца по сравнению с текущим 0,1 мм² на единицу конструкции, устраняя необходимость сшить вместе меньшие единицы конструкции. Неопределенные края могут возникнуть в результате отсутствия лазерной регулировки фокусировки во время генерации шаблона(рисунок 11C). Поэтому крайне важно откалибровать лазер и выполнить шаги эталонного шаблона (см. шаг 4) до узора. Плохо определенные полосы приводят к колебаниям ширины полосы, что затрудняет корреляцию между динамикой роста аксона и шириной полосы. Аксоны также склонны отказываться от полос, которые имеют рассеянные края. Кроме того, изменчивость в краях также может быть найдена при печати полос шириной 10-20 мкм или выше, что приводит к более высокому содержанию белка по краям по сравнению с центральными областями шаблона(рисунок 6B,D). Этот эффект края производится неоднородной диффузии фото-инициатора в процессе фотопаттернинга. Реакция фотоцисции зависит от кислорода, который больше рассеиваетпов по краям. Этот эффект края можно свести к минимуму гомогенизации фото-инициатора с пипеткой в микроколодце во время процесса фотопаттернинга. Кроме того, новый коммерциализированный фото-инициатор (plPP гель), также может уменьшить эффект края (группа поддержки системы PRIMO, личное общение).

Микропечать более одного белка может привести к перекрестному связыванию(рисунок 9A-D). Это может быть сведено к минимуму за счет повышения эффективности блокировки, которая используется для занятия неспецифических связывающих сайтов между инкубационными шагами для двух различных белков. Перекрестная связывание белков может возмущать воспроизводимость экспериментальных исходов и может привести к неправильной интерпретации данных, так как трудно определить вклад каждого белка в динамику роста аксона и в другие поведение клеток.

Заключение
Мы надеемся, что предоставленный протокол с использованием LIMAP облегчает генерацию белковых микрошаблонов за счет использования системы PRIMO. В то время как наш протокол фокусируется на том, как надежно производить микро-шаблоны в 2D стеклянных поверхностях, другие показали, что можно использовать LIMAP для микро-патиона мягких субстратов⁵⁴, и микроструктурированных поверхностей для 3D культур⁴². Эти микрошаблоны могут быть универсальным инструментом для изучения клеточных реакций на изменения в их микро-среде.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa 488 набор для мечения белка	Invitrogen	A10235	Рабочая концентрация: Н.А.
Alexa 647 набор для мечения белка	Invitrogen	A20173	Рабочая концентрация: Н.А.
Ячейки	САПР ECACC	8100805	Рабочая концентрация: Н.А.
Конъюгированный фибриноген-488	Молекулярные зонды	F13191	Рабочая концентрация: 10 мкм; г/мл
питательная среда DMEM	Gibco	11320033	Рабочая концентрация: N.A.
Эпифлуоресцентный микроскоп**	Nikon	Eclipse Ti инвертированная	рабочая концентрация: N.A.
Фибронектин	Sigma	F4759	Рабочая концентрация: 10 мкм; g/ml (после маркировки с помощью набора для маркировки белка Alexa 488, см. выше) (разбавленный в PBS)
Fiji-Image J	www.imagej.nih.gov	Version 2.0.0-rc-54/1.51f	Рабочая концентрация: N.A.
Флуоресцентный маркер	Stabilo	Stabilo Boss Оригинальная	рабочая концентрация: N.A.
HEPES	Gibco	15630080	Рабочая концентрация: 1M
Программное обеспечение Inkscape	Проверка	последнего обновления	Рабочая концентрация: N.A.
Ламинин-красный флуоресцентный родамин	Cytoskeleton, Inc.	LMN01	Рабочая концентрация: 10 μ г/мл<бр/> (разбавленный в PBS)
Программное обеспечение Leonardo Alv	é ole	версия 4.11	Рабочая концентрация: Н.А.
L-Glutamine	Sigma	G7513	Рабочая концентрация: 1%
Программное обеспечение Micro-manager Открыть	визуализацию	Проверить последнее обновление Рабочая	концентрация: N.A.
Моторизованная x/y ступень	PRIOR Scientific	Proscan II	Рабочая концентрация: н.а.
Программное обеспечение NIS Elements	Nikon	NIS Elements AR 4.60.00 64-бит (С заданиями Nikon)	Рабочая концентрация: Н.А.
PBS (без Ca2+, Mg2+)	Sigma	D8537	Рабочая концентрация: 1X
PDMS Трафареты	Alvé ole	visit www.alveolelab.comРабочая	концентрация: N.A.
PEG-SVA	Лайсан биография, Инк.	MPEG-SVA-5000-1g	Рабочая концентрация: 50 мг/мл
Фаллоидин 405	Abcam	ab176752	Рабочая концентрация: 1:1000
Фотоинициатор (PLPP)	Alvé ole	Classic PLPP	Рабочая концентрация: 14,5 мг/мл
Фотоинициатор (гель PLPP)	Alvé ole	PLPP гель	Рабочая концентрация: 4,76% разведенный в этаноле
Плазменный очиститель	Harrick Plasma	PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)Рабочая	концентрация: N.A.
PLL-PEG	SuSoS (также распространяется компанией Alvé ole)	www.alveolelab.com	Рабочая концентрация: 0,1 мг/мл (разбавленная в PBS)
Поли-L-лизин	сигма	P4707	Рабочая концентрация: 0,01%
Primo equipment	Alvé ole	www.alveolelab.com	Рабочая концентрация: N.A.
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Рабочая концентрация: 1%
Тубулин анти-альфа антитело	Abcam	DM1A	Рабочая концентрация: 1:1000 CAD-клетки
тубулин анти-бета 3 антитело	Sigma	T8660	Рабочая концентрация: 1:500 Нейроны
УФ-клей	Norland Products	NOA81	Рабочая концентрация: N.A.
1 лунка со стеклянным дном чашки	Cellvis	D35-20-1.5-N	Рабочая концентрация: Н.А.
6 лунок стеклянный донный тарелка	Cellvis	P06-20-1.5-N	Рабочая концентрация: Н.А.
20-кратный объектив**Nikon		без фазового кольца (см. обновленный каталог)Рабочая	концентрация: N.A. **Эпифлуоресцентный микроскоп: изображения были получены и шаблоны были получены на инвертированном микроскопе Eclipse Ti (Nikon), соединенном с оборудованием для микроструктурирования PRIMO (Alvé ole), используя объектив с 20x (0,75 S Plan Fluor (без фазирования, Nikon). Использовались специальные наборы фильтров Nikon для GFP, mCherry и Cy5, а источником флуоресцентного света был светодиодный (Lumencor), хотя можно использовать и другие флуоресцентные источники и наборы фильтров. Микроскоп оснащен автоматизированным столиком x/y (PRIOR Scientific) для печати многополевых узоров и технологией Nikon Perfect Focus для предотвращения смещения фокуса. Изображения были собраны с помощью камеры Retiga R6 (Q-Imaging).