Методическая статья

Одноместный Synapse Показатели глюкамата релиз и поглощение в острый мозг фрагменты из нормальных и Хантингтон мышей

DOI:

10.3791/60113

⸱

11 марта 2020 г.

 , 
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для оценки баланса между высвобождение глутамата и очистки при одном кортикостриатических глутаматергических синапсах в острых ломтиках от взрослых мышей. Этот протокол использует флуоресцентный датчик iGluu для обнаружения глутамата, камеру sCMOS для получения сигнала и устройство для фокусного лазерного освещения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синапсы являются высокоразрозненные функциональные единицы, которые работают независимо друг от друга. В болезни Гентингтона (HD) и других нейродегенеративных расстройств, эта независимость может быть поставлена под угрозу из-за недостаточного просвета глутамата и в результате разлива и разлива эффектов. Измененное астроцитарное покрытие пресинаптических терминалов и/или дендритных шипов, а также уменьшенный размер кластеров глутамата на участках высвобождения глутамата были вовлечены в патогенез заболеваний, приводящий к симптомам дис-/гиперкинезии. Тем не менее, механизмы, ведущие к дисфункции глутамерных синапсов в БГ не очень хорошо изучены. Улучшение и применение синапсов изображений мы получили данные, проливающие новый свет на механизмы, препятствующие инициированию движений. Здесь мы описываем основные элементы относительно недорогого подхода для достижения одного синапса резолюции с помощью нового генетически закодированного ультрабыстрого датчика глутамата iGluu, широкоугольной оптики, научной камеры CMOS (sCMOS), лазера 473 нм и лазерной системы позиционирования для оценки состояния кортикостриатальных синапсов в острых отрезков здорового возраста. Глютамат переходных были построены из одного или нескольких пикселей для получения оценок i) глутамата релиз на основе максимальной высоты концентрации глутамата (Глю) рядом с активной зоной и ii) поглощение глутамата, как отражено во времени постоянного распада (TauD) перисинаптического «Glu». Различия в размере покоя и контрастные модели краткосрочной пластичности служили критериями для идентификации кортикостриатальных терминалов как принадлежащих к интрателенцефалическому (ИТ) или пирамидальному тракту (PT). Используя эти методы, мы обнаружили, что в симптоматическом HD мышей 40% PT-типа кортикостриатических синапсов выставлены недостаточно глутамата зазор, предполагая, что эти синапсы могут быть подвержены риску excitotoxic повреждения. Результаты подчеркивают полезность TauD как биомаркера дисфункциональных синапсов у мышей Хантингтона с гипотинетическим фенотипом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Относительное влияние каждого синаптического терминала, принадлежащего к "унитарному соединению" (т.е. связь между 2 нервными клетками), как правило, оценивается по его влиянию на начальный сегмент постсинаптического нейрона1,2. Соматические и/или дендритные записи из постсинаптических нейронов представляют собой наиболее распространенные и, до сих пор, также наиболее продуктивные средства для уточнения обработки информации в сверху вниз или вертикальной точки зрения3,4,5. Однако наличие астроцитов с их дискретными и (у грызунов) неперекрывающихся территорий может способствовать горизонтальной перспективе, основанной на локальных механизмах обмена сигналами, интеграции и синхронизации на синапических участках66,77,88,10.10

Потому что известно, что астроглия играть, в общем, важную роль в патогенезе нейродегенеративного заболевания11,12 и, в частности, роль в поддержании и пластичности глутамерных синапсов13,14,15 ,16,16Можно себе представить, что изменения в синаптической производительности развиваться в соответствии с состоянием астроцитов в общей области. Для дальнейшего изучения целевых /астроглии, полученных местными механизмами регулирования в области здравоохранения и болезней, необходимо оценить отдельные синапсы. Нынешний подход был разработан для оценки диапазона функциональных показателей высвобождения и очистки глутамата и определения критериев, которые могут быть использованы для выявления дисфункциональных (или восстановленных) синапсов в областях мозга, наиболее тесно связанных с инициацией движения (т.е. в первую очередь в моторной коре и стриатуме).

Стриатум не хватает внутренних глутаматергических нейронов. Таким образом, относительно легко определить глутамерные афференты экстрастриатального происхождения. Последние в основном происходят в медиальной таламус и в коре головного мозга (см.17,,18,,19,,20 для более). Кортикостриатальные синапсы образуются аксонами пирамидальных нейронов, локализованных в корковых слоях 2/3 и 5. Соответствующие аксоны образуют двусторонние внутрителецефалические (ИТ) соединения или ipsilateral соединения через волоконную систему, которая более caudally представляет собой пирамидальный тракт (PT). Кроме того, было высказано предположение, что IT- и PT-типа терминалов отличаются по характеристикам выпуска и размер21,22. С учетом этих данных можно также ожидать некоторых различий в обращении с глутаматом.

Стриатум является наиболее пострадавших области мозга в болезни Гентингтона (HD)5. HD человека является тяжелым генетически наследственных нейродегенеративных расстройств. Модель мыши No175 дает возможность исследовать клеточную основу гипокинетико-жесткой формы БГ, состояния, которое имеет много общего с паркинсонизмом. Начиная с возраста около 1 года, гомозигота No 175 мышей (HOM) проявляют признаки гипокинезии, как показали путем измерения времени, проведенного без движения в открытом поле23. Нынешние эксперименты с гетерозиготными мышами No175 (HET) подтвердили предыдущий дефицит мотора, наблюдаемый в HOM, и, кроме того, показали, что наблюдаемый дефицит мотора сопровождался снижением уровня астроцитарной аминокислоты транспортера 2 белка (EAAT2) в непосредственной близости от кортикостриатических синапических терминалов24. Поэтому было предслоужно, что дефицит в астроцитарный глутамат поглощения может привести к дисфункции или даже потери соответствующих синапсов25,26.

Здесь мы описываем новый подход, который позволяет оценить один синапсный глутамат зазор по отношению к количеству выпущенного нейромедиатора. Новый датчик глутамата iGluu был выражен в кортикостриатических пирамидальных нейронов. Он был разработан Каталин Торек27 и представляет собой модификацию ранее введенного высокой сродства, но медленного датчика глутамата iGluSnFR28. Оба датчика являются производными улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Для спектральных и кинетические характеристики, см Helassa и др.27. Кратко, iGluu является низким сродством датчик с быстрой деактивации кинетики и, следовательно, особенно хорошо подходит для изучения глутамата зазор на глутамат-релизы синаптических терминалов. Время диссоциации iGluu было определено в устройстве с останавливаетися потока, что оказало Тауот значения 2.1 ms при 20 градусах По Цельсия, но 0.68 ms при экстраполировании до температуры 34 c27. Одноместные терминалы обеспечения Schaffer исследовали на 34 градуса с спиральным лазерным сканированием в регионе CA1 органотипических гиппокампа культур под 2-фотонным микроскопом выставлены среднее время константы распада 2,7 мс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все работы были выполнены в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных и были зарегистрированы в Берлинском управлении по охране здоровья и технической безопасности (G0233/14 и G0218/17).

ПРИМЕЧАНИЕ: Записи из no 175 дикого типа (WT) и гетерозиготы (HETs) могут быть выполнены в любом возрасте и сексе. Здесь мы изучали мужчин и женщин в возрасте от 51 до 76 недель.

1. Инъекция датчика глутамата iGluu для выражения в Кортикостриатальных аксонах

  1. Используйте выдвижной пипетки (режим одного шага) для подготовки боризиликатных стеклянных пипетков для инъекций вируса. После вытягивания, ломаем пипетку вручную, чтобы получить диаметр наконечника 30-50 мкм. Автоклав пипетку и хирургические инструменты, включая сверло для открытия черепа.
  2. Храните вирус AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 х 1013gc/mL) при -80 градусах По цельсию в 10 айквотах. Если инъекции выполняются вскоре после производства вируса (в течение 6 месяцев), держите при 5 градусах Цельсия. Перед операцией выньните флакон и поддерживайте его при комнатной температуре.
  3. Заполните стеклянную пипетку и удалите любые пузырьки.
  4. Анестезия животного с интраперитонеальной инъекции раствора, содержащего 87,5 мг/кг кетамина и 12,5 мг/кг ксилазина. Подкожно вводят 0,25% бупивакаин (8 мг/кг) для дополнительного обезболивания. Проверьте глубину анестезии, контролируя мышечный тонус и наблюдая отсутствие болевые рефлексы.
  5. Побрить кожу на голове и стерилизовать его с 70% алкоголя. Приготовь мышь в стереотаксичную раму.
  6. Используйте скальпель, чтобы удалить кожу и высокой скорости (38000 об/мин) сверло, чтобы сделать 1,2 мм отверстие в кости выше моторной коры.
  7. Смонтируйте шприц с прикрепленной инъекционной пипеткой в держатель точного манипулятора. Вставьте вертикально ориентированный пипетку в кору на 4 различных участках. Координаты инъекций, в отношении брегма (в мм): передние 1,5, боковые 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Глубина по отношению к dura mater составляет (в мм): 1,5-1,7.
  8. Используя систему инъекций, вводят 0,3 л л на участок неразбавленного вирусного раствора со скоростью 0,05 л/мин. После каждой инъекции оставьте пипетку на месте в течение 1 мин, прежде чем медленно снять ее (1 мм/мин).
  9. Закончить, закрыв хирургическую рану нейлоновым швом.
  10. Оставьте мышь на 0,5-1 ч на грелке в чистой клетке, прежде чем вернуть ее в исходную клетку.
  11. Поддерживайте мышь на 12 ч дневной/ночной цикл в течение 6 до 8 недель до подготовки острых ломтиков мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать иммунных реакций, приводящих к повреждению клеток и потере синапса, инъекция нескольких вирусных конструкций должна быть выполнена одновременно или в течение 2-3 часов после первичной инъекции. Координаты для инъекций iGluu были выбраны в соответствии с атласом мозга Paxinos и Franklin29. Они соответствуют моторной коре М1. Иммуностогирование инъекционных мозгов визуализировало многочисленные, но в основном хорошо изолированные аксоны и аксоновываряества в ипси- и контралатеральной стриатума и в контралатеральных кортиках M1 и S1.

2. Поиск Глутаматергических Терминалов, выражающих датчик глутамата iGluu

  1. Режим калибровки
    1. Подготовьте камеру sCMOS и программное обеспечение для управления камерой со следующими настройками. На странице чтения набор Pixel считывания скорость: 560 МГц (я пьедеем), Чувствительность / Динамический диапазон: бит, ложный шум фильтр: Да, Перекрытие Readout: Да. На странице Binning/ROI выберите полный экран.
    2. Подготовьте стеклянную горку, содержащую каплю 5 мг/мл Lucifer Yellow (LY) под крышкой скольжения.
    3. Поместите LY слайд под 63x цели, открыть лазерного затвора и выполнить серийное приобретение с использованием следующих настроек: Pixel Binning: 1x1, Триггер режим: Внутренний, Время экспозиции: Минимальное (будет определено).
    4. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы создать пятно флуоресценции диаметром 4 мкм (изображение не должно содержать насыщенных пикселей).
    5. Для выполнения калибровки лазерной системы позиционирования, выберите следующие настройки в программном обеспечении лазерного позиционирования: Диаметр точек: 10, скорость сканирования: 43.200 кГц. Нажмите кнопку приобретения изображения «Пуск» на правой панели. Набор запусков: 0, Задержка выполнения: 0 и выберите опцию Run на странице TTL на странице последовательности. Нажмите кнопку калибровки на странице калибровки и откалибруйте программное обеспечение лазерного управления в соответствии с инструкциями, показанным в верхнем левом углу экрана приобретения.
    6. Если установка использует независимое программное обеспечение для управления камерой и лазером, приобрести скриншоты из окна приобретения камеры и отправить его в программное обеспечение лазерного управления для перерасчета координат XY. Если программное обеспечение установлено на разных компьютерах, а затем использовать видео grabber импортировать изображение в программное обеспечение лазерного управления. Программное обеспечение лазерного управления будет нуждаться в информации о факторах масштабирования XY и смещениях. Для этого определите координаты верхнего левого, нижнего и нижнего и нижнего верхних углов изображения в окне приобретения программы лазерного управления. Рассчитайте факторы масштабирования в соответствии со следующими уравнениями: X-фактор - (X внизу справа - X внизу слева)/2048, X смещение и X снизу слева, Y-фактор (Y top-left - Y внизу-левый) /2048, Y смещение y внизу-left.
    7. В конце процедуры калибровки создайте прямоугольную область интереса (ROI) в 267х460 пикселей, переместите ее в центр экрана и нажмите кнопку «Пуск».
    8. Возврат к следующим настройкам программного обеспечения управления камерой: Binning: 2x2, режим триггера: Внешняя экспозиция, время экспозиции: Минимальное (будет определено).
  2. Режим коррекции автофлюоресценции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень покоя «Glu» в среде активных синаптических терминалов, как правило, ниже 100 нМ14,,30,,31,32,33,34. Соответственно, любой датчик глутамата, особенно датчик низкой сродства, как iGluu будет довольно тусклым в отсутствие синаптической глутамата релиз. Тем не менее, некоторые iGluу флуоресценции можно даже обнаружить в покое, но должны быть отличаться от ткани аутофлуоресценции. 473 нм освещения вызывает как iGluу флуоресценции и автофлюоресценции (Рисунок 1A-C). Последний занимает широкий диапазон длин волн, в то время как iGluu флуоресценция ограничена 480-580 нм (с максимальной на 510 нм). Коррекция для автофлюоресценции основана на приобретении двух изображений с различными фильтрами высокого прохода.
    1. Подготовка мозг ломтики заранее, как описано в другом месте35. Держите ломтики отрубей готовыми.
    2. Перенесите ломтики в камеру звукозаписи, погрузив их в окисленную искусственную спинномозговую жидкость (ACSF), содержащую 125 мМ NaCl, 3 мМ КЛ, 1,25 мМ2PO4,25 мМ NaHCO3, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы (pH 7.3, 303 mOsm/L), дополнены 0,5 мм натрия пируват, 2,8 мМ натрия аскорбат и 0,005 мм клейт. Используйте скорость потока 1-2 м/мин. Держите температуру ванны на уровне 28-30 градусов по Цельсию.
    3. Найдите стриатум в дорсаль-ветки под 20-x целью погружения воды. Исправьте ломтики нейлоновой сеткой на платиновой арфе, чтобы свести к минимуму движение тканей. Переключитесь на цель погружения воды 63x /NA 1.0. Выберите фильтры, отражающие свет на 473 нм (дихроическое зеркало) и проходящий свет с длинами волн .gt;510 нм (фильтр выбросов).
    4. Синхронизируйте освещение, стимуляцию и приобретение изображения с помощью доски AD/DA с соответствующим программным обеспечением управления. Установите триггерную программу для управления приобретением с лазерным временем экспозиции 180 мс и временем приобретения изображения 160 мс. Используйте лазерное позиционирование устройства для отправки лазерного луча в заранее определенное количество точек и определить параметры для скорости сканирования и размера пятна.
    5. Приобретите изображение как автофлюоресценции, так и iGluu-положительныхструктур с помощью фильтра высокого прохода на 510 нм ("желтое изображение").
    6. Приобрести изображение с автофлюоресценции только с помощью фильтра высокого прохода на 600 нм ("красное изображение").
    7. Масштабируйте красные и желтые изображения, используя средние интенсивности 10 самых ярких и 10 самых темных пикселей для определения диапазона. Выполните вычитание "желтый минус красное изображение" и перемасштабировать вычитается изображение для создания стандартного 8-битного файла tif для удобной визуализации bouton интерес (Рисунок 1D). Он содержит яркие пикселиuот iGlu u-положительных структур, серые пиксели от фона и темные пиксели от структур с автофлюоресценцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С учетом оборудования средняя флуоресценция (F) будет ниже 700 U.
  3. Режим поиска Бутона
    ПРИМЕЧАНИЕ: iGluu-положительныепиксели могут принадлежать к функционально по-разному элементам аксонального вала, как ветви аксона по-разному заказа, места bifurcation, варикозы после истощения везики или полно активного варикозного расширения. Однако определить функциональные синаптические терминалы практически невозможно только путем визуального осмотра. Поэтому каждый глутаматергический синаптический терминал нуждается в идентификации по своей отзывчивости к электрической деполяризации. Сайты, которые не реагируют на стимуляцию должны быть отброшены. Физиологические средства, чтобы вызвать глутамат релиз из кортикостриатических аксонов является вызвать потенциал действия. Это может быть достигнуто либо с помощью канала родопсин соответствующих спектральных характеристик или электрической стимуляции аксона, визуализированного iGluu себя. Чтобы избежать случайной активации опсина, мы предпочли последний approastep
    1. Используйте выдвижной микропипет (в четырехступенчатом режиме) для производства стимуляционных пипетков из боризикатных стеклянных капилляров. Внутренний диаметр наконечника должен быть около 1 мкм. При заполнении ACSF, сопротивление электрода должно быть около 10 МЗ.
    2. Чтобы вызвать действие потенциально зависимого высвобождения глутамата из набора синаптичных бутонов, прикрепленных к тому же аксону, используйте 63x увеличение, фильтр излучения 510 нм и вычитаемое изображение, чтобы поместить электрод стеклянной стимуляции рядом с флуоресцентным варикозом . Избегайте близости дополнительных аксонов.
    3. Включите стимулятор, чтобы доставить деполяризующих импульсов тока для стимуляции пипетки. Используйте текущую интенсивность около 2 КА (не более 10 КА).
    4. Включите многоканную систему применения ванны, где один канал обеспечивает стандартное решение ванны, а другие каналы доставляют необходимые блокаторы ионных каналов, транспортеров или мембранных рецепторов. Контролируйте поток в месте записи, а затем переключитесь на канал тетродотоксина (TTX) (решение для ванны плюс 1 ММ TTX). После 2-3 мин, стимулировать бутон интерес снова, но теперь в отсутствие действия потенциального поколения. Высвобождение непосредственно связано с притоком кальция через напряжение зависит кальциевых каналов.
    5. Путем поворачивать ключ интенсивности на стимуляторе, отрегулируйте ток стимуляции для того чтобы получить реакции подобные к тем, котор нужно через потенциалы действия. Как правило, ток стимуляции будет около 6 ЗА для 0,5 мс деполяризации.
    6. Для базового тестирования препарата, применить 0,5 мМ CdCl2. Наличие этого блокирующего канала кальция глутамата релиз полностью предотвращает синаптическое глутамата релиз тем самым проверки кальция зависимость непосредственно вызвал глутамат сигнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая общая рекомендация может помочь увеличить показатель успеха одного эксперимента синапса в стриатуме. Чтобы выбрать глутамергические синаптические терминалы с нетронутыми механизмами выпуска, варикоз: (i) иметь гладкую форму шпинделя; ii) не связанс с бифуркцией аксона; iii) быть ярче, чем другие структуры на "желтом изображении"; (iv) Проживать в стриатальном нейропиле, а не в волоконных трактах; v) проживание на очень тонкой аксоновой ветви; vi) Не проживайте в более глубоких частях среза.

3. Визуализация высвобождения и клиренса глютамата

  1. Режим записи
    ПРИМЕЧАНИЕ: После вычитания автофлюоресценции (шаг 2.2) и нескольких первоначальных тестов на отзывчивость интересующего бутона (Шаг 2.3) приобретение данных может начаться. Реакции на электрическую активацию глутамата, высвобождая из одного аксона терминалов, можно наблюдать на изображении непосредственно(рисунок 2),не применяя дополнительных инструментов анализа. Тем не менее, оказалось очень удобно сразу же извлечь некоторые основные показатели производительности синапса(рисунок 3). Эта информация необходима для принятия решений о последующем ходе эксперимента, таких как выбор конкретных типов терминалов, быстрая оценка связанных с HD изменениями, количества и частоты испытаний или препаратов, которые будут применяться с системой сверхфузии. Возможно также, необходимо иметь дело с в конечном итоге появляющихся артефактов. Во-первых, описаны стандартные параметры для записи данных.
    1. Используя микроскоп XY диски, местоuиспытания iGlu у-положительный бой близко к центру viewfield. Остановите приобретение изображения с помощью кнопки приобретения Abort. На последнем приобретенном изображении определите положение XY центра отдыха, нажав на него левой кнопкой мыши. Координаты XY набора курсора будут отображаться на нижней панели состояния окна приобретения.
    2. Используя данные калибровки (шаг 2.1.6), вычислите координаты участка, куда лазерный луч должен быть отправлен для возбуждения флуоресценции iGluu. Используйте следующие уравнения: X лазерная и Х-камера x- X-фактор x смещения, Y лазерная компенсация - Y-камера y - Y-фактор Y. Выполняя этот перерасчет, обратите внимание на вертикальные или горизонтальные настройки флип камеры.
    3. Создайте одноточечную последовательность в программном обеспечении лазерного управления с использованием расчетных координат. Для этого выберите точку в добавлении к коробке последовательности на странице Sequence программного обеспечения лазерного управления. Выберите 10 с для задержки, чтобы вызвать начало и 180 мс для времени лазерного импульса. Переместите мышь к расчетным координатам и нажмите левую кнопку.
    4. Выберите следующие настройки в программном обеспечении лазерного управления: Запускает: 0, Задержка выполнения: 0, Последовательность: Запуск на TTL. Затем нажмите Кнопка Начало последовательности.
    5. В программном обеспечении управления камерой, выберите следующие настройки: На странице Binning / ROI, набор Изображения Площадь: Пользовательские, Pixel Binning: 2x2, Высота Exposure Time: 20, Ширина: 20, Слева: X-координация отдыха iGluu-положительное пятно минус 10 px, Нижний: Y-координатор отдыха iGluu-положительное пятно минус 10 Kinetic Series Lengthpx, Acquisition Mode: 0.0003744s (минимальное значение). При таких настройках скорость приобретения составит 2,48 кГц.
    6. Выберите режим триггера: Внешний. Нажмите Возьмите сигнал в программное обеспечение управления камерой. Инициировать экспериментальный протокол, установленный для триггерного устройства.
    7. Реализация экспериментального протокола Испытание со следующей линии времени: 0 мс - начать испытания, 1 мс - начать лазерное освещение, 20 мс - начать приобретение изображения с камерой, 70 мс - начать электрическую стимуляцию 1, 120 - начать электрическую стимуляцию 2, 181 мс - конец суда (лазер и камера выключена). Таким образом, в ходе одного испытания камера приобретает 400 кадров с частотой 2,48 кГц. Смотрите шаги 2.3.3 и 2.3.5. для получения подробной информации о электрической стимуляции.
    8. Для обеспечения достаточного восстановления пресинаптических везикл бассейнов, примените протокол Trial с частотой повторения 0,1 Гц или ниже.
  2. Офф-лайн строительство глутамата переходных и быстрая оценка выброса глутамата и очистки для выявления патологических синапсов
    1. Включите процедуры оценки. Здесь мы используем программное обеспечение SynBout v. 3.2. (автор: Антон Дворжак). Следующие шаги необходимы для построения переходного от пикселей к ЕФз/F с повышенной флуоресценцией iGluu, как в видео на рисунке 2.
    2. Чтобы оконечно рассмотреть размер бутона, вычислите среднее и стандартное отклонение (SD) интенсивности флуоресценции ROI в состоянии покоя (F), до начала стимуляции. Определить и поле области, занимаемой пикселей с F'gt;средний No 3 SD(рисунок 3A). Определите виртуальный диаметр (в мкм) при условии круговой формы области супра-порога.
    3. Определите qF как разница между значением пиковой интенсивности и F. Участок стимулирующего тока и QF/F против времени (Рисунок 3B). Рассчитайте SD из ЗФ/F в состоянии покоя (до начала стимуляции) и "Пика амплитуды". Используйте пиксель с пиковой амплитудой более 3 SD из QF/F для выполнения моноэкспоненциальной установки для распада от пика. Определите время, постоянное распад ТауД из ЗФ/Ф.
    4. Чтобы оценить "Максимальную амплитуду" в данном синапсе, выберите пиксель с самым высоким значением F/F. Он, как правило, расположен в пределах или рядом с границами отдыха bouton iGluу флуоресценции. "Максимальная амплитуда" будет лучшим показателем нагрузки глутамата, представленной механизму очистки одного синапса.
    5. Чтобы оценить пространственное расширение сигнала iGluu, определите диаметр области всех надпороговых пикселей, объединенных в виртуальный круг. Соответствующий диаметр называется "Распространение". Термин "Пик овый спред" затем относится к пиковому значению усредненного спреда переходного(рисунок 3C, разница между пунктирными красными линиями).
  3. Исправления для возможных артефактов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрическая деполяризация связана с внешним потоком внутрипипетийного раствора. Это может привести к небольшому смещению тканей. Чтобы различать изменения iGluu и внефокусированные сдвиги изображения, можно использовать следующий подход для выявления и устранения артефактов смещения(рисунок 4).
    1. Проанализируйте пространственные характеристики надпороговых пикселей, полученных из рентабельности инвестиций с признаками смещения(рисунок 4F-H).
    2. Найти пиксели за пределами первоначально определенных границ бутон в покое(Рисунок 4F-H, коробка в красном цвете).
    3. Определить в конечном итоге существующие отрицательные значения интенсивности пикселей(Рисунок 4I, J). Любой ФЗ/F в отрицательном направлении с амплитудой больше, чем средняя предстимуляция 3 SD, следует рассматривать как артефакт, и запись должна быть отброшена.
    4. Чтобы избежать вне фокуса артефактов, поместите электрод стимуляции на антеро-боковую сторону синаптической бутон, используйте двухфамную электрическую стимуляцию и свести к минимуму интенсивность стимуляции/длительность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вне фокуса артефакты также могут быть получены из камеры. Если последний не оптимально привязан к микроскопу, он может производить колебания, скорее всего, из-за небольших вибраций системы охлаждения камеры. Такие вибрации создают шаблон «инь и ян» на изображениях ЗФ/Ф, вращающихся с частотой 50 Гц. Вибрации могут быть математически вычтены из сигнала флуоресценции, но окончательное качество измерений будет критически зависеть от времени записи.
    5. Закрепите камеру под микроскопом таким образом, что вибрации отсутствуют. Если последние остаются, поместите резиновую прокладку между камерой и адаптером микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нельзя пренебрегать возможностью того, что полосатый нейропил вокруг синапса интерес содержит глутаматергические варикозы, которые не выражают iGluu и, следовательно, остаются невидимыми. В случае их совместной активации (скорее всего, в отсутствие TTX) переходные, полученные от boutons интереса могут быть затронуты разлива. То же самое относится и к iGluu-expressingтерминалов, которые были вне фокуса. Характерным явлением в данном случае было бы то, что переходные флуоресценции происходят из гораздо более широкой области. Поскольку этот ответ устраняется TTX, можно интерпретировать его как неспецифический ответ, вызванный необоснованной многоволоконной активацией.
    6. Чтобы исправить это неспецифические многоволоконные ответ, следуйте процедуре, изложенной в рисунке 5. Используйте флуоресценционный сигнал пикселей на границах поля зрения. Чтобы свести к минимуму фоновый отклик, минимизировать интенсивность и продолжительность стимуляции или использовать TTX.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выявление двух типов кортикостриатального глутаматергического варикозного расширения
ИТ и PT афференты происходят в слое 2/3 и 5, соответственно, и демонстрируют дифференциальные последствия и модели прекращения в ипсилатеральной и контрлатеральной (только ИТ-терминалы) striatum. Тем не менее мало известно о свойствах выброса глутамата и зазора при повторяющихся условиях активации, как это наблюдается во время начала движений, но это хорошо документировано, что соответствующие глутамата-высвобождая ва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты касаются вопроса общего интереса - синапсовой независимости и ее возможной потери в ходе нейродегенерации, и мы описываем новый подход к выявлению пораженных синапсов в острых ломтиках мозга от пожилых (зgt;1 год) мышей. Воспользовавшись улучшенными кинетической характеристикой недавно введенного датчика глутамата iGluu эксперименты освещают связь между синаптическим высвобожденным глутаматом и поглощением таким образом, что это было невозможно раньше.

Влияние глутамата...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана CHDI (A-12467), Немецким исследовательским фондом (Exc 257/1 и DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) и интрамуральными исследовательскими фондами Шарите. Мы благодарим К. Торека, Сент-Джордж, Лондонский университет, и Н. Хелассу, Ливерпульский университет, за плазмид iGluu и множество полезных дискуссий. Д. Бетанс и А. Шёнхерр оказали отличную техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерео микроскопWPIPZMIIIПрецизионный стерео зум Бинокулярный микроскоп
Стереотаксическая рамкаStoelting51500DDigital Lab Новая стандартная стереотаксическая рама
Высокоскоростное буровое оборудованиеStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Система впрыскаStoelting53311Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Шприц Hamilton 5 & микро; lHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Лазерная система позиционированияRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Blue лазер для возбуждения iGluuRapp OptoElectronicDL-473-020-S473 нм лазер
Дихроичное зеркало для 473 нмRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473Dichroic
1P вертикальный микроскопCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Объектив 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x объективCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Дихроичное зеркало для iGluuOmega оптическийXF2030
Фильтр излучения для iGluuOmega оптическийXF3086
Дихроичное зеркалоOmega оптический
Эмиссионный фильтр для автофлуоресцентного субтр.Омега оптическийQMAX EM600-650
sCMOS камераAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition softwareAndor4.30.30034.0Solis
AD/DA преобразовательHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Программное обеспечение для приобретенияHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Система позиционирования электродовSutter InstrumentMPC-200Микроманипулятор Электростимулятор
Мастерские ChariteSTIM-26
СлайсерLeicaVT1200 SВибротом
Коричневый/Огненный пуллерSutter InstrSU-P1000P-1000
Стеклянные трубки для инъекционных пипетокWPI1B100F3
Стеклянные трубки для стимуляции пипеткиWPIR100-F3
ТетродотоксинAbcamab120054TTX
iGluu плазмидаAddgene106122pCI-syn-iGluu
Q175 мышиJackson Lab27410Z-Q175-KI
QMAX_DI580LP

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56(2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554(2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239(2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451(2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142(2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154(2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19(2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634(2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414(2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

iGluTauDsCMOS

Похожие статьи