Этот протокол описывает новый колористетрический метод для обнаружения противомалярийных примахин (ПМЗ) в синтетических мочах и сыворотках человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизированная реакция Griess для UV-Vis и Голый глаз Определение противомалярийных Primaquine
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Primaquine (ПМЗ), важный противомалярийный препарат, был рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для лечения опасных для жизни инфекций, вызванных P. vivax и ovale. Тем не менее, ПМЗ имеет нежелательные побочные эффекты, которые приводят к острому гемолизу у пациентов с дефицитом глюкозы-6-фосфат дегидрогеназы (G6PD). Существует необходимость в разработке простых и надежных методов определения ПМЗ с целью мониторинга дозировки. В начале 2019 года мы сообщили о УФ-Вис и невооруженным глазом подход для PM' колористельной количественной оценки. Обнаружение было основано на Griess-подобной реакции между ПМЗ и анилинами, которые могут генерировать цветные продукты азо. Предел обнаружения для прямого измерения ПМЗ в синтетической моче находится в наномолярном диапазоне. Кроме того, этот метод показал большой потенциал для количественной оценки ПМЗ из образцов сыворотки человека в клинически значимых концентрациях. В этом протоколе мы опишите технические детали, касающиеся синтеза и характеристики цветных продуктов азо, подготовки реагента, а также процедур определения ПМЗ.
Введение
ПМЗ является одним из наиболее важных противомалярийных препаратов, он работает не только как шизонтоцид тканей для предотвращения рецидива, но и как геймтоцитоцид, чтобы прервать передачу болезни1,2,3,4. Внутрисосудистый гемолизявляется является одним из связанных побочных эффектов ПМЗ, который становится чрезвычайно серьезным в тех, дефицит G6PD. Известно, что генетическое заболевание G6PD распространяется по всему миру с частотой генов между 3-30% в эндемичных по малярии районах. Тяжесть слабости ПМЗ зависит от степени дефицита G6PD, а также дозы и продолжительности воздействия ПМЗ5,6. Для снижения риска ВОЗ рекомендовала для лечения малярии одну низкую дозу (0,25 мг базы/кг) ПМЗ. Тем не менее, это по-прежнему оспаривается изменения в чувствительности пациента наркотиков5,7. Мониторинг дозы необходим для оценки фармакокинетики после введения ПМЗ, что может повлиять на корректировку дозировки для успешного лечения с ограниченной токсичностью.
Высокопроизводительная жидкая хроматография (HPLC) является наиболее широко используемым методом клинического определения ПМЗ. Эндох и др. сообщили о системе HPLC с УФ-детектором для количественной оценки сыворотки с помощью колонки полимерного геля C-188. В их системе белки сыворотки сначала осаждались ацетонитрилом, а затем ПМЗ в супернатанте был отделен для HPLC. Кривая калибровки была линейной над диапазоном концентрации от 0,01-1,0 мкг/мл8. Другой метод, основанный на обратной фазе HPLC с УФ-обнаружением на уровне 254 нм, был зарегистрирован для количественной оценки ПМЗ и его основных метаболитов9. Кривая калибровки для ПМЗ была линейной в диапазоне от 0,025-100 мкг/мл. Дополнительная жидко-жидкая экстракция со смешанным гексаном и этиловым ацетатом в качестве органической фазы использовалась для разделения ПМЗ с процентным восстановлением, достигаемым до 89%9. Совсем недавно, Миранда и др. разработали метод UPLC с УФ-обнаружения на 260 нм для анализа ПМЗ в таблетках формулировки с пределом обнаружения на 3 мкг /мл10.
Хотя методы HPLC демонстрируют многообещающую чувствительность в определении наркотиков и чувствительность может быть дополнительно улучшена, если HPLC оснащен масс-спектрометр, Есть еще некоторые недостатки. Прямые измерения лекарственных средств в биологических жидкостях, как правило, недоступны HPLC, так как многие биомолекулы могут значительно влиять на анализ. Дополнительные экстракции необходимы для удаления эндогенных молекул до анализа HPLC11,12. Кроме того, обнаружение ПМЗ с помощью детектора HPLC-UV обычно выполняется на максимальной длине волны поглощения (260 нм); однако в биологических жидкостях много эндогенных молекул с сильным абсорбцией на уровне 260 нм (например, аминокислоты, витамины, нуклеиновые кислоты и урохромные пигменты), что мешает обнаружению УФ-излучения ПМЗ. Необходимо разработать простые и экономически эффективные методы определения ПМЗ с разумной чувствительностью и избирательностью.
Реакция Griess впервые была представлена в 1879 году в качестве колориметрического теста для обнаружения нитритов13,14,15,16. В последнее время эта реакция была широко изучена для обнаружения не только нитрита, но и других биологически значимых молекул17,18,19,20. Ранее мы сообщали о первом систематическом исследовании неожиданной реакции Грисса с ПМЗ(рисунок 1). В этой системе, ПМЗ способен образовывать цветные азо, когда в сочетании с заменой анилин в присутствии нитритов ионов в кислых условиях. Мы также обнаружили, что цвет азов варьировался от желтого до синего при увеличении эффекта пожертвований электрона на анилин21. Уф-виз поглощения на основе колористического метода для количественной оценки ПМЗ был разработан с помощью оптимизированной реакции между 4-метоксианилин и ПМЗ. Этот метод показал большой потенциал для чувствительного и селективного обнаружения ПМЗ в биосоответствующих жидкостях. Здесь мы стремимся описать подробные процедуры определения ПМЗ, основанные на этой колористельной стратегии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Синтез цветного азоса
- В 25 мл круглой нижней колбы (RBF), растворить анилин (0,1 ммоль) и примахин бисфосфат (45,5 мг, 0,1 ммоль) в 10 мл H3PO4 раствор (5% v/v). Положите RBF на ледяную ванну, добавить перемешать бар с соответствующим размером в раствор, и положить RBF на перемешать пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза азо 3г (рисунок 2),используйте 0,2 ммоль примакина бисфосфата. - Растворите NaNO2 (6,9 мг, 0,1 ммоль) в 1 мл охлажденной воды, а затем добавьте в реакционную смесь dropwise. Удалите ледяную ванну и держите реакционную смесь перемешивание при комнатной температуре.
- Мониторинг реакции с кремнезема гель покрытием тонкослойной хроматографии (TLC) пластины. Используйте смесь дихлорметана (DCM)/метанола (MeOH) (vol/vol 5:1) в качестве eluent для TLC. Продукт азо имеет цветные пятна на пластине TLC, которую легко различить невооруженным глазом. Остановите реакцию, когда пятна PM' исчезают на TLC.
- Отрегулируйте реакционную смесь на рГ no10 на NaOH (2 M) на ледяной ванне. Используйте 50 мл разделения воронки для извлечения смеси 3 раза с 20 мл этилового ацетата для каждого, объединить и концентрировать органическую фазу под вакуумом с помощью роторного испарителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед извлечением отрегулируйте значение рН реакционных растворов более 10. Это может поддерживать первичный амин в качестве его неионизированной формы, тем самым облегчая добычу. - Очистите остатки с помощью флэш-хроматографии с обратной фазы кремнезема гель под нормальным давлением, используя MeOH/H2O как eluent. Сухие раствор продукта через лиофилизации, чтобы дать желаемые продукты азо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такая же реакция может быть выполнена и в разбавленных растворах HCl (0,2 м).
2. УФ-Вис измерения и теоретические расчеты
- Растворите чистый азо (50 мкм) в дистиллированной воде или в 5% H3PO4 раствор (pH 1.1), соответственно. Запись УФ-виз-спектра поглощения (250-700 нм) на спектрофотометре при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию). Экспорт данных как файлы .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
-
Выполняйте все теоретические расчеты для самого ПМЗ и продуктов азо с помощью программы Gaussian 16. Используйте функциональную теорию зависимости от времени плотности (TD-DFT) с базовым набором 6-31G. Включить эффекты растворителя с помощью поляризуемой модели континуума (PCM) с использованием воды.
- Используйте программное обеспечение (например, Chemdraw Office) для рисования структур, а затем сохраните структуру в качестве гаусского файла ввода (.gif).
- Откройте файл GIF с Гаусс Посмотреть и нажмите кнопку Рассчитать. Выберите гауссийский расчет настройки, Opt-Freq, и наземные государства-DFT-B3LYP-6-31G; затем нажмите Отправить. Оптимизация геометрии будет генерировать файл .log.
- Следуя вышеупомянутой процедуре, используйте Gauss View, чтобы открыть этот файл журнала. Нажмите Рассчитать-Gaussian Расчет настройки и выбрать энергию и TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet только. Затем отправить. Расчет энергии будет генерировать другой файл журнала и кубический файл.
- Используйте вид Gauss, чтобы открыть файл журнала из расчета энергии. Нажмите Результаты-УФ/Вис, чтобы увидеть прогнозируемое поглощение.
- Используйте вид Gauss, чтобы открыть файл куба. Нажмите Results и выберите поверхностные и контурные поверхностные действия и новую поверхность, чтобы увидеть орбиты.
-
Сравните результаты как экспериментального измерения, так и гауссовского расчета. Рассчитать процентную погрешность между рассчитанными и измеренными значениями, согласно следующему уравнению.
Ошибка в г. (Wmax cal.-Wmaxexper.) / WмаксExper. | 100%
где Wmax cal. представляет максимальную длину волны поглощения от теоретического расчета и Wmax exper. представляет длину волны от экспериментального результата.
3. Определение ПМЗ
- Измерение ПМЗ с использованием 96-колодецной пластины(рисунок 5)
- Растворите 4-метоксианилин в 0,2 М ЛЦ для анилина для 200 мМ, R1. Растворите нитрит натрия в дистиллированной воде, чтобы получить раствор 5 мМ, R2. Храните все растворы в холодильнике при 4 градусах Цельсия перед использованием.
- Добавьте 100 qL R1 в 96-колодую пластину и добавьте 50 л ПМЗ, содержащий образец, в тарелку, чтобы смешаться с R1. Затем добавьте в тарелку 50 л R2. Смешайте растворы путем повторного пипетки.
- Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем запишите уф-виз абсорбции на 504 нм. Повторите 3x для каждого теста. Продукт азо стабилен с воздействием света комнаты; не нужно держать тарелку в темноте.
- Экспорт данных как файлы .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
- Кривая калибровки для прямого измерения ПМЗ в образце мочи
- Подготовка растворов ПМЗ с использованием синтетической мочи с концентрациями ПМЗ в 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 мкм, соответственно.
- Добавьте 100 qL R1 в 96-колодую пластину и добавьте 50 л раствора мочи ПМЗ, чтобы смешать сястой с R1. Затем добавьте 50 зл R2 в вышеупомянутую смесь. Смешайте растворы путем повторного пипетки. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем запишите уф-виз абсорбции на 504 нм.
- Создайте кривую калибровки на основе концентраций абсорбции I504 и ПМЗ. Используйте значения из скважин без PM, как пробел, и вычесть пустые значения из всех тестов до обработки данных.
- Выполните линейную подгонку для создания линейных уравнений, как Y и aX'b, где Y является интенсивность поглощения на 504 нм, X является концентрация ПМЗ, является склон, и b является y-перехват линейной линии.
- Кривая калибровки для прямого измерения ПМЗ в образце сыворотки человека
- Подготовьте решения ПМЗ с использованием сыворотки человека с концентрациями ПМЗ по 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, ММ соответственно.
- Добавьте 100 qL R1 в 96-колодую пластину и добавьте 50 л раствора сыворотки PM, чтобы смешать с R1. Добавьте 50 кЛ R2 в приведенную выше смесь и смешайте растворы путем повторного пипетки. Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем запишите УФ-виз абсорбции на 504 нм. Экспорт данных как файл .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
- Создайте кривую калибровки на основе концентраций абсорбции I504 и ПМЗ. Используйте значения из скважин без PM, как пробел, и вычесть пустые значения из всех тестов до обработки данных.
- Выполните линейную подгонку для создания линейных уравнений, как Y и aX'b, где Y является интенсивность поглощения на 504 нм, X является концентрация ПМЗ, является склон, и b является y-перехват линейной линии.
- Извлечение ПМЗ из сыворотки
- Добавьте определенное количество ПМЗ в сыворотку человека, чтобы имитировать сыворотку, содержащую ПМЗ. Для извлечения ПМЗ добавьте 6 мл смеси этилового ацетата/гексана (7:1 v/v) в 2 мл сыворотки, содержащей ПМЗ, в 15 мл центрифуги в метро 15 мл.
- Добавьте в систему экстракции 100 л гидроксида натрия (2 М). Яростно встряхните трубку с помощью вихревого смесителя на 30 с. Соберите органический слой и сконцентрируйте его с помощью роторного испарителя под вакуумом.
- Растворите остатки с 200 л дистиллированной воды и удалите нерастворимые липидные компоненты путем фильтрации через дискообразную мембрану с размером 220 нм пор. Используйте окончательное решение для тестирования.
- Определить ПМЗ из сыворотки с экстракции
- Выполните шаги 3.2 или 3.3 для создания кривой калибровки для ПМЗ в дистиллированной воде. Извлекайте ПМЗ из сывороток, содержащих ПМЗ, в соответствии с шагом 3.4.
- Добавьте 100 л раствора R1 и 50 л раствора PM' в 96-колодую пластину. Добавьте 50 кЛ R2 выше смеси, и смешать растворы путем повторного пипетки.
- Держите пластину при комнатной температуре в течение 15 минут и запишите уф-виз абсорбции на 504 нм. Используйте скважины с R1 и R2, но без PM' в качестве элементов управления. Экспорт данных как файлы .xls/.xlsx для дальнейшего анализа.
- Вычесть значения управления из значений абсорбции I504 для каждого теста, а затем использовать результат для расчетов концентрации в соответствии с уравнением лайнера из кривой калибровки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предел обнаружения (LOD) для ПМЗ во всех случаях может быть рассчитан по стандартному методу22. Расчет был основан на функции калибровки: LOD 3.3 SD/b, где SD является стандартным отклонением пустой и b является наклоном регрессионной линии
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для оптимизации условий реакции(Рисунок 2), различные анилины были использованы для пары с ПМЗ через реакцию Griess. Мы достигли серии азо с разными цветами. Было установлено, что анилины с электронным заменяющим заменитель может вызвать красный сдвиг в УФ-виз абсорбции спектра. Теоретические расчеты проводились с помощью временной зависимости плотности функциональной теории (TD-DFT). Как уотчки 2A,результат расчета был в хорошем согласовании с оптическими измер...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описали колористетрический метод для удобной количественной оценки ПМЗ. Потенциально это самый простой и экономически эффективный текущий метод. Что еще более важно, этот метод предлагает позволяет невооруженным глазом измерения PM, без использования какого-либо оборудования.
Оптимизированная реакция Griess для обнаружения ПМЗ может генерировать красный цвет азо с максимальным поглощением на уровне 504 нм. Потенциальное влияние УФ-визпоглощения эндогенных биомолекул ограничено, что делает м...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего декларировать.
Благодарности
Авторы признают, что Грант стартапа от Университета китайской медицины Гуанчжоу и молодежный проект подготовки научных исследований ГЗУКМ (2019 г.н.). Мы также признаем Лингнан медицинский исследовательский центр Гуанчжоу Университета китайской медицины за поддержку на объектах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4-метоксианилин | Аладдин | K1709027 | |
| 2,4-диметоксианилин | Хеоуны | 10154207 | |
| 3,4-диметоксианилин | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-метиланилин | Адамас-бета | P1414526 | |
| 4-нитроанилин | Маклин | C10191447 | |
| 96 лунок, Flat Botton | Labserv | ||
| Gaussian@16 программное обеспечение | Gaussian, Inc | Версия:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Соляная кислота | GCRF | 20180902 | |
| эскиз Марвина (программное обеспечение) | CHEMAXON | бесплатная версия: 15.6.29 | |
| Фосфорная кислота | Маклин | C10112815 | |
| Примахин бизифосфат | 3A Химикаты | ||
| Нитрит натрия | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Сульфаниламиды | TCI (Шанхай) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Планшетный ридер | Thermo Fisher | Поставляется с программным обеспечением SkanIt 4.1 |
Ссылки
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351(2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418(2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29(2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
