Здесь мы представляем протокол иммуногистохимического теста для обнаружения антигена вируса бешенства в качестве альтернативного диагностического теста для тканей, фиксированных формалином.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуногистохимический тест для обнаружения лиссавирусного антигена из формалин-фиксированных тканей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Одним из основных диагностических методов борьбы с бешенством является обнаружение вирусного рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса (антигена) в инфицированных образцах тканей. В то время как тест на прямые флуоресцентные антитела (DFA) или прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT) чаще всего используются для обнаружения антигена, оба теста требуют свежих и / или замороженных тканей для отпечатков на слайдах до обнаружения антигена с использованием антител. Если образцы собраны и зафиксированы в формалине, ни один из тестов не является оптимальным для обнаружения антигена, однако тестирование может быть выполнено с помощью обычной иммуногистохимии (IHC) после встраивания в парафиновые блоки и секционирования. При этом методе IHC ткани окрашивают антирабильскими антителами, срезы депарафинизируют, антиген извлекают частичным протеолизом или другими методами и инкубируют с первичными и вторичными антителами. Антигены окрашивают пероксидазой хрена/аминоэтилкарбазолом и контрапятнистами гематоксилином для визуализации с помощью светового микроскопа. В дополнение к обнаружению специфического антигена, фиксация формалина предлагает другие преимущества, такие как определение гистологических изменений, расслабленные условия хранения и транспортировки образцов (при температуре окружающей среды), возможность тестирования ретроспективных случаев и повышение биологической безопасности за счет инактивации инфекционных агентов.
Введение
Бешенство – острый прогрессирующий энцефалит, вызываемый отрицательным чувством РНК-вирусов, относящихся к роду lyssavirus1. Почти 99% всех человеческих смертей, вызванных инфекцией вирусом бешенства (RABV), типовым членом рода, передается собаками2. Диагностика бешенства подозреваемых животных основывается на обнаружении антигена (в первую очередь вируснокодируемого нуклеопротеина, N-белка) в комплексе с геномной РНК (рибонуклеопротеиновый комплекс, RNP) в ткани головного мозга3. Обнаружение антигена с помощью теста на прямые флуоресцентные антитела (DFA) считается золотым стандартом для диагност....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В то время как протокол IHC был выполнен на формалин-фиксированных тканях, которые инактивируют RABV, если они присутствуют, соответствующие протоколы биобезопасности должны соблюдаться должным образом. Все процедуры биобезопасности описаны в 5-м издании (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) «Биобезопасность в микробиологических и биомедицинских лабораториях» (BMBL), включая ношение надлежащих средств индивидуальной защиты (СИЗ) и требования к вакцинации, как описано12. Кроме того, следует соблюдать надлежащую локализацию и обращение с опасными химическими веществами (такими как формалин, AEC и ксилол) (например, вытяжные....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 2 демонстрирует репрезентативные результаты окрашивания IHC положительных и отрицательных контрольных образцов в различных протестированных тканях мозга. Рисунки 2A,D,G представляют положительные образцы в 200x, в то время как Рисунок 2B,E,H соответствует 400-кратному увеличению, соответственно. Рисунок 2А-С соот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Из-за высокого уровня смертности от бешенства после появления симптомов диагностика подозреваемых животных на инфекцию RABV чрезвычайно важна для соответствующего постэкспозиционного профилактического лечения. Диагностика бешенства в первую очередь зависит от методов DFA, DRIT и ПЦР с использованием свежих или замороженных тканей. Для тестирования закрепленных формалином тканей тест IHC предоставляет альтернативный метод чувствительного и специфического обнаружения антигена RABV. В то время как ткани, зафиксированные в ф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим лаборантов, эпидемиологов и филиалы департаментов общественного здравоохранения за представление образцов в Центры по контролю и профилактике заболеваний. Выводы и заключения в этом докладе являются выводами авторов и не обязательно отражают официальную позицию Центров по контролю и профилактике заболеваний. Использование фирменных наименований и коммерческих источников предназначено только для идентификации и не подразумевает одобрения со стороны Центров по контролю и профилактике заболеваний.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3% перекись водорода | Pharamacy | Готовые 3% H2O2 | |
| 3-амино-9-этилкарбазол (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Ацетатный буфер pH 5.2 | Poly Scientific R& D Corp. | s140 | |
| Буферизованный формалин 10% фосфат буферизованный | Fisher | Scientific SF100-4 | Сертифицированные |
| покровные стекла Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 мм |
| Этанол 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Этанол 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Гематоксилин Гилла #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Мышиное первичное антитело |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Монтажная среда |
| N,N, диметилформамид GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Фосфат буферизованный физиологический раствор | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Цель | Несколько поставщиков | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Цель | Несколько поставщиков | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R& D Corp. | s1887 | |
| Набор морилок для слайдов Tissue-Tek | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Гистологический класс |
| Zeiss Axioplan 2 визуализация - микроскоп | Несколько поставщиков |
Ссылки
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
