Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение химерных актолотлов с мутантными гаплоидными конечностями через эмбриональную прививку

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60156

⸱

29 января 2020 г.

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

В этой статье

Краткое содержание

Эта цель этого протокола состоит в том, чтобы производить химерные акколоты с гаплоидными передними конечностями, полученными из Cas9-мутагенизированной донорской ткани с использованием методов прививки эмбриональной ткани.

Аннотация

Растущий набор генетических методов и ресурсов позволяет исследователям исследовать молекулярное происхождение способности некоторых видов саламандры, таких как аксолотлы, регенерировать целые конечности во взрослом возрасте. Здесь мы намечаем методы, используемые для генерации химерных актолотлов с Cas9-мутагенизированными гаплоидными передними конечностями, которые могут быть использованы для изучения функции гена и верности регенерации конечностей. Мы объединяем несколько эмбриологических и генетических методов, включая гаплоидное поколение с помощью активации in vitro, мутагенеза CRISPR/Cas9 и прививание тканей в один протокол для создания уникальной системы гаплоидного генетического скрининга в модельном организме регенерации. Эта стратегия сокращает количество животных, пространство и время, необходимое для функционального анализа генов в регенерации конечностей. Это также позволяет исследует регенерационные функции генов, которые могут потребоваться для других важных процессов, таких как органогенез, морфогенез тканей и другие важные эмбриональные процессы. Описанный здесь метод является уникальной платформой для проведения гаплоидного генетического скрининга в системе позвоночных.

Введение

Исторически сложилось так, что прививка эмбриональной ткани амфибий была важным методом для изучения фундаментальных механизмов биологии развития и регенерации. Аксолотль, вид саламандры, обладает впечатляющей способностью к регенерации тканей и сложных структур, таких как конечности и органы после травмы или ампутации. Аналогичным образом впечатляюще, они могут получать, без отторжения, ткани трансплантатов от других лиц на эмбриональных, юношеских и взрослых стадиях1,2,3. Регионы эмбрионов, которые производят целые структуры, такие как конечности, хвосты, глаза и головы, и более конкретные ткани, такие как нейроэктодерм и сомиты, могут быть привиты между эмбрионами для производства химерных животных1,2,4,6. На протяжении почти столетия, исследования таких химерных животных предоставили решающее понимание регенерации, дифференциации тканей, контроля размера, и узор1,7,8.

В последнее десятилетие, многочисленные транскрипционные исследования регенерирующих тканей дали понимание генетических программ, лежащих в основе регенерации саламандры9,10,11,12,13. Эти исследования добавили к расширяющемуся списку генов-кандидатов, которые на сегодняшний день в значительной степени не характерны в контексте регенерации. Целевые методы мутагенеза, такие как CRISPR/ Cas, теперь позволяют исследуют такие гены, и такие генетические подходы в значительной степени облегчаются недавним секвенированием и сборкой большого аксолотла генома14,15,16.

Мы стремились разработать методы, которые соединяли классическую биологию развития с новой генетической технологией с целью вскрытия механизмов регенерации. Методы генерации гаплоидных эмбрионов аксолотлов и других саламандр были созданы на протяжениидесятилетий 17. Хотя эти методы уже давно отмечается, что преимущества саламандры, как генетическая модель организмов18, несколько последующих генетических исследований включили гаплоидных животных. Мы используем интроактивации в аксолотле для производства гаплоидных эмбрионов, которые служат донорами тканей для прививки19. Используя эмбрионы, несущие флуоресцентные генетические маркеры, мы разработали надежные методы генерации конечностей, полученных почти полностью из донорских тканей(рисунок 1А). Объединив эти два метода, мы обошли поздней эмбриональной летальности, связанной с гаплоидией, что позволяет для производства полностью развитых, привитых гаплоидных конечностей(Рисунок 1B, Рисунок 1B', и Рисунок 2).

Проводя CRISPR/Cas-опосредованный мутагенез в гаплоидных эмбрионах до прививки для создания химерных аксолотлов с мутантными гаплоидными конечностями, мы можем исследовать функцию генов конкретно в контексте развития конечностей и регенерации. Это позволяет спасать конечности от потенциально эмбрионально-смертельных фенотипов мутантов. Хотя CRISPR / Cas микроинъекции может генерировать животных, которые являются весьма мутант, такие животные, как правило, очень мозаики, с некоторой степенью удержания аллелей дикого типа и различные различные мутации в целевых местах14,20. Мутагенез на основе CRISPR в гаплоидных клетках увеличивает пенетранс одного аллеля потери функции мутаций, так как они не могут быть замаскированы сохраненными аллелями дикого типа. По этой причине скрининг на основе CRISPR в гаплоидных клеточных линиях все чаще используется для исследования генетической основы многих клеточных процессов21,22,23. Объединив CRISPR основе линии отслеживания с нашими гаплоидных протоколов прививки конечностей, подход, описанный здесь может служить платформой для гаплоидных генетических экранов у живых животных20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные процедуры, используемые в этом протоколе, были утверждены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных йельского университета (IACUC, 2017-10557) и соответствовали всем федеральным правилам и руководящим принципам, регулирующим использование позвоночных животных. Все эксперименты на животных были проведены на Ambystoma mexicanum (аксолотлы) в помещениях в йельском университете.

1. Поколение диплоидных эмбрионов

  1. Получите диплоидные эмбрионы GFP, чтобы служить в качестве трансплантата хостов через естественное спаривание с помощью одного или двух родителей gfp 24.
  2. Соберите свежеотложенные диплоидные яйца и поместите их в металлическое сито.
  3. Тщательно промыть яйца 40% раствором Holtfreter (20 мм NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,8 мМ NaHCO3,0,2 мм CaCl2, 4 мМ MgSO4, рН до 7,4).
  4. Поместите яйца в свежий 40% раствор Holtfreter и хранить при 12 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диплоидные эмбрионы всегда должны быть получены, прежде чем перейти к поколению гаплоидных эмбрионов.

2. Поколение гаплоидных эмбрионов

  1. Подготовка донора женского гамета
    1. 48 ч перед проведением инактивации in vitro, обезболизовать сексуально зрелый белый или белый/RFP женский аксолотль путем погружения в 1 г/L HEPES-буферизированный MS-222 в 40% растворе Holtfreter25.
    2. Убедитесь, что животное полностью обезглавлена примерно через 30 минут погружения, крепко щипая хвост между большим и указательным пальцами. Полностью обезопаденные животные физически не реагируют на любую щепотку.
    3. Подготовьте раствор человеческого хорионического гонадотропина (HCG), содержащего 10 000 U/mL в стерильном сольнике.
    4. Использование 30 G инсулина шприц, вводить 0,15 CC ХГЧ (1500 единиц) в мускулатуру спинной к задней конечности обезболной женщины под углом 45 "к средней линии, чтобы избежать контакта со спинным мозгом.
    5. Верните самку на свежий 40% раствор Holtfreter и поместите в холодильник на 8-12 градусов по Цельсию.
    6. После 48 ч верните самку к комнатной температуре. Поместите несколько камней или пластиковых растений в контейнер в качестве поверхностей для откладки яиц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самки вводят с HCG часто депозит пустые желе случаях в течение нескольких часов, прежде чем откладывать яйца.
    7. Удалите камни или пластиковые растения после того, как самка начала последовательно откладывать яйца.
    8. Разрешить самке сидеть в пустом баке в течение 30 мин до 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удержание материалов для животного, чтобы отложить яйца на позволит более жесткий контроль сбора яйцеклеток.
  2. Мужская коллекция гамет
    1. В то время как откладка яйцеклеток самки застопорилась, анестезируйте сексуально зрелый мужской аксолотл GFP, чтобы служить донором спермы, как и в шаге 2.1.1.
    2. Поместите полностью обезожженного самца на спину на влажные бумажные полотенца под рассекающимся микроскопом.
    3. Если экспериментатор прав, положение кончик пипетки P1000 в основании клоака с правой рукой.
    4. Поместите левый указательный палец и большой палец левой руки 2'3 см рострала к тазу. Аккуратно сжать животное при перемещении пальцев к задним ногам, чтобы избавиться от спермических образцов мочи.
    5. Соберите каждый, который сбрасывается из клоаки в отдельную микроцентрифугую трубку. Повторите этот процесс, чтобы собрать от 6 до 10 образцов.
    6. Пипетка 5,0 л от каждого образца на чашку Петри, чтобы проверить качество спермы с помощью перевернутого микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированные образцы спермы молочно-белого цвета, как правило, варьируются от 5 до 20 Л, и, как правило, извлекаются после нескольких, более высокий объем сперматозоидов образцов мочи извлекаются. Сперма будет собирать в нижней части труб в более высоких образцах объема, когда оставили спокойно. Концентрированные образцы здоровой спермы очень подвижно и теряют активность по мере снижения их концентрации. Здоровые самцы могут производить до 50 л концентрированной спермы.
  3. Коллекция женских гамет
    1. После получения и подтверждения здорового образца спермы, анестезирует HCG-инъекционные женские аксолотлы, как в шаге 2.1.1.
    2. Поместите полностью обезопадинированную самку на влажные бумажные полотенца на спине.
    3. Извлеките неоплодотворенные яйцеклетки у самки, используя движение рук, аналогичное тому, что было в шаге 2.2.4.
    4. Соберите яйца с помощью мокрых щипц и перенесите их в 10 см чашку Петри. Лечить яйца с облученной спермы в течение 15 минут сбора.
  4. Мужская подготовка гамет и активация in vitro
    1. Используйте пипетку P10 или P20, чтобы пипетку спермы вверх и вниз, разбивая комки, чтобы сформировать однородную подвеску.
    2. Ориентирующий процент подвижной спермы, поместив 0,5 л капли неразбавленной сперматозоиды на крышку чашки Петри или стеклянный слайд и рассматривая с перевернутым микроскопом.
    3. Добавьте 9,5 л из модифицированного раствора Ringer Марка (MMR; Таблица материалов) к этому образцу, чтобы сделать 20x разбавления спермы. Аккуратно пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
    4. С перевернутым микроскопом, подсчитайте сперму в трех 1,0 капли l 20x разбавленного aliquot на крышке чашки Петри или гемоцитометр для оценки концентрации спермы неразбавленной подвески.
    5. Подготовка спермы для облучения путем разбавления аликвот оригинального образца спермы около 80000 motile клеток / мл в стерильных 0,1x MMR.
    6. Подсчитайте количество яиц, полученных в течение последних 15 мин. Добавить 0,5 л свежеразбавленной спермы от шага 2,4,5 за яйцо в чашку Петри. Используйте кончик пипетки, чтобы распространить эту подвеску в слой толщиной 1 мм.
    7. Используя пластиковый лифт, поместите образец 4 см от луковиц 254 нм кросслинкера. Генетически инактивировать сперму путем облучения образца с 800000 uJ/mm2.
    8. Используя пипетку P10, пипетка подвески на неоплодотворенных яйца, покрытие каждое яйцо с 0,25 -0,5 л облученных сперматозоидов. Разрешить яйца сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут.
    9. После 30 мин, затопить яйца с 0,1x MMR. Немедленно поместите яйца в инкубатор 8'10 градусов для инъекций на следующий день или при 18 градусах Цельсия для инъекций в течение 7 часов после активации (hpa).
    10. Деджузы гаплоиды с помощью острых щипцы 30 мин после гидратации. Немедленно поместите яйца в инкубатор 8-10 градусов по Цельсию для инъекций на следующий день или при 18 градусах По Цельсию для инъекций в тот же день.

3. Гаплоид мутагенез и техническое обслуживание

  1. Микроинъекции CRISPR/Cas9
    1. Дизайн sgRNAs с использованием CRISPRscan и синтезировать26,27.
    2. Для мультиплексного мутагенеза подготовьте запас в 5 сгРН (10 нг/л для каждого сгРНК) и белка Cas9 (1 мкг/кЛ). Подготовьте 100-кратное разбавление этого запаса (0,1 нг/Л на сгРНН, 10 нг/Л Cas9) для инъекций. Для одного гена, высокой частоты мутации мутагенеза, следуйте протоколу, изложенному ранее28.
    3. Вводят гаплоидные эмбрионы на одноклеточном этапе 7 л.с., если они хранятся при 18 градусах Цельсия, или впрысните эмбрионы на следующий день на стадии 2х8 клеток, если они хранятся при 8–10 градусах Цельсия.
    4. Перенос эмбрионов на 1,0x MMR с 20% полисахарозом 400.
    5. Если одна клетка, вводить каждый эмбрион с 5 nL капли инъекционного раствора (примерно 1/4 радиуса яйцеклетки), содержащие общую массу 0,5 пг/сгРНК и 50 пг Cas9 белка. Если многоклеточный, распределить эту массу путем введения меньших объемов в несколько клеток.
    6. Разрешить эмбрионам заживать в полисахарозе 400 не менее 4 ч и максимум 18 ч при 18 градусах Цельсия.
  2. Хаплоидный эмбрион жилья
    1. Перенос эмбрионов в 0,1x MMR с антибиотиком-антимикоттик.
    2. Дом каждого эмбриона в отдельных хорошо 24-хорошо пластины, а некоторые умрут или развиваться ненормально. Поддерживайте при 16–18 градусах По Цельсию. Более низкие температуры могут быть использованы для продления развития, если это необходимо.
    3. Замените средства массовой информации свежим 0,1x MMR с антибиотиком-антимикоттик через день.

4. Подготовка эмбриона хозяина-диплоида

  1. Поддерживайте эмбрионы в желе покрытие на 12 до 16 градусов по Цельсию, пока они не достигнут стадии 22 до 26.
  2. Соберите эмбрионы, которые готовы к прививке, поместите их в сито (размер сетки 4 мм) и аккуратно промойте их 40% раствором Holtfreter.
  3. Перенесите эмбрионы в фильтр-стерилизованный 0.1x MMR, содержащий 1,5% отбеливателя на срок до 2 мин. Полностью погрузите эмбрионы в раствор отбеливателя и аккуратно закружите их, чтобы желе покрывало в полной мере контактировало с раствором отбеливателя, чтобы убить микробов на эмбрионах.
  4. Через 2 мин разбавьте отбеливатель, содержащий эмбрионы, с равным объемом фильтростеризованного 0,1x MMR.
  5. Аккуратно вылейте эмбрионы в сито, освященное отбеливателем (размер сетки 4 мм) и промыть эмбрионы пять раз фильтром-стерилизованным 0,1x MMR.
  6. Поместите эмбрионы в стерильные 10 см петри блюда с 0,1x MMR с антибиотиками для dejellying (пенициллин 100 единиц /мл, стрептомицин 100 мкг /Л, 0,25 мкг/мл, gentamicin 25 мкг/мл).
  7. Под флуоресцентным стереомикроскопом удалите желе и вителлинные мембраны с эмбрионов ГФПЗ с помощью острых щипц (размеры наконечника 0,05 х 0,01 мм2).
  8. Перенесите эмбрионы GFP в новое блюдо Петри. Свести к минимуму количество жидкости, передаваемых из чашки Петри, где они были dejellied.
  9. Промыть эмбрионы гФПЗ стерильными 0,1x MMR антибиотиками в четыре-шесть раз для удаления загрязняющих веществ.
  10. Поместите чистые эмбрионы на 4 градуса Цельсия на ночь перед прививкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охлаждение эмбрионов делает их более жесткими и чистыми отделения мезодерма от эндодерма возможно.

5. Поколение хаплоид-диплоида Химеры

  1. Хирургическое блюдо и подготовка СМИ
    1. Подготовка стерильных хирургических операционных блюд, залива autoclaved 2% агарозы в 0,1x MMR в стерильные 35 мм легкосцепление петри блюда. Заполните блюда Петри на полпути агарозой.
    2. После того, как агарозо остынет, используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать 25 мм в длину наклонного корыта в агарозе, чтобы удерживать эмбрионы на месте.
    3. Заполните блюдо стерильными хирургическими носителями (0,1x MMR с анти-микоплазмой 2,5 мкг/мл, амфотерицином B 0,25 мкг/мл и ципрофлоксацином 10,0 мкг/мл) и поставьте в холодильник при 4 градусах Цельсия.
  2. Процедура прививки эмбрионов
    1. Поместите одного здорового гаплоидного донора с одним или двумя этапами, соответствующими эмбрионам диплоидного хозяина внутри корыта прехосленного операционного блюда, содержащего хирургические носители(рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру на стадии охлаждения (10 градусов по Цельсию или ниже), если это возможно.
    2. Используйте два ультра-тонких, автоклавированных щипцы (прямой наконечник, наконечник размеры 0,05 х 0,02 мм2), чтобы удалить эктодерм и мезодерм слоев от хозяина с бутоном конечности вблизи центра (Рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прямоугольная область трансплантата ткани охватывает бутон конечностей и простирается от девятого сомита до задней половины жаберного выпуклости, около 2 мм, вдоль передней задней оси. Вдоль оси дорсовентра, привитые области охватывает примерно 1,5 мм, в том числе сомиты только за брюшной край жаберного выпуклости. Привитые области включает в себя все боковые пластины мезодерма и боковые половинки сомитов, не нарушая основной эндодерм. Подробнее о рисунке 4 и сопроводительном видео.
    3. Отложите ткань хозяина и удалите эквивалентный размер листа ткани из гаплоидного донора с помощью тех же методов.
    4. Поместите гаплоидный лист донорской ткани на соответствующую область эмбриона донора.
    5. Закрепите ткань, покрывая ее аутоклавизированным, прямоугольным осколкостью стекла из измельченного микроскопа крышки стекла и мягко нажав его на тело эмбриона хозяина.
    6. Переверните гаплоидный эмбрион донора на другую сторону, чтобы собрать бутон конечностей для второго эмбриона хозяина. Повторите шаги 5.2.2 до 5.2.5.
    7. Тщательно удалите оставшиеся лишние ткани хозяина и эмбрион донора из тарелки.
    8. Оставьте трансплантаты со стеклянными осколками на месте в течение 60-75 минут, проверяя каждые 20 минут, чтобы убедиться, что стекло не соскользнуло.
    9. После того, как ткани трансплантатов полностью придерживаться, используйте щипцы медленно снимать стеклянные осколки якоря.
  3. Обслуживание химеры
    1. Перенесите привитые эмбрионы в свежие хирургические носители и поддерживайте их на уровне 8–12 градусов на ночь, чтобы исцелиться. Индивидуально размещается привяженный эмбрион в 12 или 24-колодцах пластин.
    2. После 36–48 ч перенесите привитые эмбрионы в стерильные 0,1x MMR антибиотик-антимикотик. Сильные антибиотики в хирургических носителях вызывают токсичность у привитых эмбрионов через 3 дня.
    3. Замените средства массовой информации свежими 0,1x MMR и антибиотиками каждые 2–3 дня.
    4. Поддерживайте привяженный эмбрион при 18 градусах Цельсия до тех пор, пока они не смогут прокормить28.
    5. После 1 до 2 месяцев развития и ухода, гаплоидные конечности могут быть забил для чистоты трансплантата с помощью флуоресцентного рассеивание микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие ненейронных или некровных хост-тканей в конечностях является показателем нечистой прививки и часто связано с ненормальным развитием конечностей. Эти животные должны быть исключены из дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Развитие гаплоидных эмбрионов можно отличить от диплоидных эмбрионов по их фенотипу «гаплоидного синдрома»29. На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней задней оси и неполным корпусом желтоковой вилки(рисунок 3А). Флуоресцентный микроскоп может быть использован для обеспечения того, чтобы гаплоидные эмбрионы были свободны от патернатно производных экспрессии GFP

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Есть несколько важных шагов в нашем протоколе для генерации гаплоидно-диплоидных химер, что операционный техник должен рассмотреть для последовательных результатов прививки.

Наиболее вероятной причиной неудачи гаплоидного поколения является плохое состояние активации in vitro. Надлежащее количество подвижной спермы должны быть использованы для активации яйцеклеток. Чтобы продлить подвижность, образцы спермы всегда должны поддерживаться при 4 градусах Цельсия. Перед нанесением любого образца сп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Кэтрин Робертс за ее заботу о колонии аксолот. Финансирование этой работы было предоставлено Коннектикут Инновации Регенеративной медицины научно-исследовательский фонд (15RMA-YALE-09 и 15-RMB-YALE-01) и Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и человеческого развития (Индивидуальный постдокторской Стипендия F32HD086942).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#55 Пинцет DumontFine Science Tools11295-1Используйте только материал Dumostar (можно автоклавировать)
Амфотерицин BSigma AldrichA2942-20ML20 мл
Антибиотик-антимикотик 100xThermo Fisher15240062
ципрофлоксацинSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (полисукроза 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
ГентамицинСигма ОлдричG1914-250MG
Инкубатор для нагрева/охлажденияRevSciRS-IF-233
Хорионический гонадотропин человекаMerk Chorulon
Megascript T7 Набор для транскрипцииThermo FisherAM133440 реакций
Охлаждение мироскопа StageBrook IndustriesCustomCustom
NLS Cas9 ProteinPNAbioCP01-2004 флакона по 50 &; г белка
каждый PlasmocinInvivogenant-mpt-1Уровень обработки
<сильный>Рецепты
1,0x Модифицированный раствор Рингера (MMR) Марка)0,1 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO<суб>4, 2 мМ CaCl<суб>2, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ ГЕПЕС (рН 7,8), ph 7,4
40% раствор20 мМ NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,8 мМ NaHCO3, 0,2 мМ CaCl2, 4 мМ MgSO4, pH до 7,4
Хольтфретера

Ссылки

  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352(2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548(2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Регенерация конечностей аксолотляполучение гаплоидных эмбрионовмутагенез CRISPR-Cas9трансплантация эмбриональных тканейгаплоидно-диплоидная химераfertilizация in vitroанализ экспрессии GFPтрансплантация зачатка конечностиплатформа генетического скринингамодельная система позвоночных
Поколение химерных актолотлов с мутантными гаплоидными конечностями через эмбриональную прививку
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.