Методическая статья

Поколение химерных актолотлов с мутантными гаплоидными конечностями через эмбриональную прививку

DOI:

10.3791/60156

⸱

29 января 2020 г.

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта цель этого протокола состоит в том, чтобы производить химерные акколоты с гаплоидными передними конечностями, полученными из Cas9-мутагенизированной донорской ткани с использованием методов прививки эмбриональной ткани.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущий набор генетических методов и ресурсов позволяет исследователям исследовать молекулярное происхождение способности некоторых видов саламандры, таких как аксолотлы, регенерировать целые конечности во взрослом возрасте. Здесь мы намечаем методы, используемые для генерации химерных актолотлов с Cas9-мутагенизированными гаплоидными передними конечностями, которые могут быть использованы для изучения функции гена и верности регенерации конечностей. Мы объединяем несколько эмбриологических и генетических методов, включая гаплоидное поколение с помощью активации in vitro, мутагенеза CRISPR/Cas9 и прививание тканей в один протокол для создания уникальной системы гаплоидного генетического скрининга в модельном организме регенерации. Эта стратегия сокращает количество животных, пространство и время, необходимое для функционального анализа генов в регенерации конечностей. Это также позволяет исследует регенерационные функции генов, которые могут потребоваться для других важных процессов, таких как органогенез, морфогенез тканей и другие важные эмбриональные процессы. Описанный здесь метод является уникальной платформой для проведения гаплоидного генетического скрининга в системе позвоночных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исторически сложилось так, что прививка эмбриональной ткани амфибий была важным методом для изучения фундаментальных механизмов биологии развития и регенерации. Аксолотль, вид саламандры, обладает впечатляющей способностью к регенерации тканей и сложных структур, таких как конечности и органы после травмы или ампутации. Аналогичным образом впечатляюще, они могут получать, без отторжения, ткани трансплантатов от других лиц на эмбриональных, юношеских и взрослых стадиях1,2,3. Регионы эмбрионов, которые производят целые структуры, такие как конечности, хвосты, глаза и головы, и ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные процедуры, используемые в этом протоколе, были утверждены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных йельского университета (IACUC, 2017-10557) и соответствовали всем федеральным правилам и руководящим принципам, регулирующим использование позвоночных животных. Все эксперименты на животных были проведены на Ambystoma mexicanum (аксолотлы) в помещениях в йельском университете.

1. Поколение диплоидных эмбрионов

  1. Получите диплоидные эмбрионы GFP, чтобы служить в качестве трансплантата хостов через естественное спаривание с помощью одного или двух родителей gfp 2....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие гаплоидных эмбрионов можно отличить от диплоидных эмбрионов по их фенотипу «гаплоидного синдрома»29. На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней задней оси и неполным корпусом желтоковой вилки(рисунок 3А). Флуоресцентный микроскоп может быть использован для обеспечения того, чтобы гаплоидные эмбрионы были свободны от патернатно производных экспрессии GFP

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько важных шагов в нашем протоколе для генерации гаплоидно-диплоидных химер, что операционный техник должен рассмотреть для последовательных результатов прививки.

Наиболее вероятной причиной неудачи гаплоидного поколения является плохое состояние активации in vitro. Надлежащее количество подвижной спермы должны быть использованы для активации яйцеклеток. Чтобы продлить подвижность, образцы спермы всегда должны поддерживаться при 4 градусах Цельсия. Перед нанесением любого образца сп.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Кэтрин Робертс за ее заботу о колонии аксолот. Финансирование этой работы было предоставлено Коннектикут Инновации Регенеративной медицины научно-исследовательский фонд (15RMA-YALE-09 и 15-RMB-YALE-01) и Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и человеческого развития (Индивидуальный постдокторской Стипендия F32HD086942).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#55 Пинцет DumontFine Science Tools11295-1Используйте только материал Dumostar (можно автоклавировать)
Амфотерицин BSigma AldrichA2942-20ML20 мл
Антибиотик-антимикотик 100xThermo Fisher15240062
ципрофлоксацинSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (полисукроза 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
ГентамицинСигма ОлдричG1914-250MG
Инкубатор для нагрева/охлажденияRevSciRS-IF-233
Хорионический гонадотропин человекаMerk Chorulon
Megascript T7 Набор для транскрипцииThermo FisherAM133440 реакций
Охлаждение мироскопа StageBrook IndustriesCustomCustom
NLS Cas9 ProteinPNAbioCP01-2004 флакона по 50 &; г белка
каждый PlasmocinInvivogenant-mpt-1Уровень обработки
<сильный>Рецепты
1,0x Модифицированный раствор Рингера (MMR) Марка)0,1 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO<суб>4, 2 мМ CaCl<суб>2, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ ГЕПЕС (рН 7,8), ph 7,4
40% раствор20 мМ NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,8 мМ NaHCO3, 0,2 мМ CaCl2, 4 мМ MgSO4, pH до 7,4
Хольтфретера

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. <....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9fertiliz in vitroGFP

Похожие статьи