Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Инкапсулированные технологии клеток для доставки биологических препаратов для мышиного глаза

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60162

⸱

30 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of South Carolina, 2Department of Ophthalmology, Division of Research, Medical University of South Carolina, 3Department of Neuroscience, Division of Research, Medical University of South Carolina, 4Division of Research, Ralph H. Johnson VA Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для использования альгината в качестве полимера в микроинкапсуляции увековеченных клеток для длительной доставки биопрепаратов на глаза грызунов.

Аннотация

Многие текущие терапии в стадии разработки для заболеваний заднего полюса глаза являются биопрепаратами. Эти препараты должны вводиться часто, как правило, через внутривитровтровые инъекции. Инкапсулированные клетки, выражающие биологический выбор, становятся инструментом для местного производства и высвобождения белка (например, с помощью долгосрочных лекарств). Кроме того, инкапсуляционные системы используют проницаемые материалы, которые позволяют диффузии питательных веществ, отходов и терапевтических факторов в и из клеток. Это происходит при маскировке клеток от иммунного ответа хозяина, избегая необходимости подавления иммунной системы хозяина. Этот протокол описывает использование альгината в качестве полимера в микроинкапсуляции в сочетании с электроспрепом метод в качестве метода микроинкапсуляции. Клетки ARPE-19, спонтанно возникающие линии клеток RPE человека, были использованы в долгосрочных экспериментах клеточной терапии из-за его функциональности жизни, и он используется здесь для инкапсуляции и доставки капсул для глаз мыши. Рукопись обобщает шаги для микроинкапсуляции клеток, контроля качества и глазной доставки.

Введение

Клеточная терапия представляет собой революционные биологические методы, которые широко применяются в медицине. В последнее время они успешно применяются в лечении нейродегенеративных заболеваний, глазных заболеваний и рака. Клеточная терапия охватывает широкий спектр полей от замены клеток до доставки лекарств, и этот протокол фокусируется на последнем. Биоразлагаемые альгинатные микрокапсулы (MC) показали эффективность в качестве системы доставки, и они становятся широко используемыми в биомедицинской области. Alginate был использован в микроинкапсуляции из-за его простой процесс гелеобразующего, биоразлагаемость, отличная биосовместимость, и стабильность в условиях in vivo1,2,3,4.

Метод электроспрея, как метод микроинкапсуляции, был успешно использован для инкапсулирования пептидов и белков с использованием альгината (базовый полимер) и поли-л-орнитин (вторичное покрытие полимера). Оба полимера естественным образом найдены и использованы для их биосовместимости5,,6,,7. Тем не менее, основной проблемой в клеточной терапии является подавление иммунной системы хозяина, чтобы избежать побочных эффектов, вызванных иммуносупрессивными препаратами. Проницаемость альгината микрокапсул считается подходящим свойством для инкапсуляции клеток, что позволяет диффузии питательных веществ, отходов и терапевтических факторов в и из клеток, маскируя их от иммунного ответа хозяина8,9,10.

В глазах, инкапсулированные клетки были использованы в клинических испытаниях для постоянной доставки биопрепаратов (т.е., факторы роста11,12 и фактор роста антагонистов13) для лечения пигментного ретинита или возрастной макулярной дегенерации. Другие цели, такие, как ингибиторы комплемента14, также в настоящее время изучаются в доклинических условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты были проведены в соответствии с заявлением ARVO об использовании животных в исследованиях офтальмологических заболеваний и зрения и были одобрены Медицинским университетом штата Северная Каролина по уходу за животными и использованию комитета в соответствии с протоколом ID 00399.

1. Культура клеток

  1. Создание пигмента пигмента в основе клетки клетки клетки человека (ARPE-19) клеточной линии, устойчиво выражающей ген выбора в соответствии с опубликованными протоколами14,15.
  2. Поддержание клеток в модифицированном орел-медиуме Dulbecco (DMEM) дополнено 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
  3. Инкубировать клетки при 37 градусах По кв. м и 5% CO2.
  4. Заменяйте среду каждые 2-3 дня.
  5. Прохождение клеток после достижения 70%-80% слияния с помощью стандартных процедур культуры тканей.

2. Инкапсуляция клеток

  1. Смешайте альгинат натрия с деионизированной (DI) водой для окончательной концентрации 2% w/v и очистите фильтрацией с 0,2 мкм стерильным фильтром шприца.
  2. Подготовьте клетки для смешивания с альгинатным раствором путем пробивания, центрифугации и мытья их буферным сольненым раствором 10 мМ HEPES (pH 7.4). Используя гемоцитометр, подсчитайте клетки и отрегулируйте конечную концентрацию клеток до 1 х 106 в альгинативном растворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс инкапсуляции должен проходить внутри стерилизованного капюшона.
  3. Загрузите 300-й аликот ы 300 л альгината и клеток смеси в 3 мл шприца и прикрепите его к шприцу насоса. Раствор будет перекачиваться через 30 G тупой кончик иглы стерильной желеванной ванной помещается в стерильный стакан 50 мл ниже наконечника шприца на 7 мм для иглы для ванны распыления расстояния.
  4. Гелеобразная ванна содержит объем 40 мл 10 мм hePES буферизированный солевой раствор, содержащий 100 мМ хлорида кальция (CaCl2) и 0,5% w/v поли-L-орнитин (PLO). ООП является вторичным полимерным покрытием, которое может быть опущено или изменено в соответствии с потребностями следователя.
  5. Отрегулируйте скорость напряжения и потока и держите их постоянными в процессе инкапсуляции при частоте потока 60 мм/ч и начальном напряжении 6,0 кВ для получения микрокапсул размером 150 мкм.
  6. Подключите зажим анодной проволоки (красный) наконечники иглы генератора высокого напряжения к игле и соедините зажим (черный) к медной проволоке, которая на полпути погружена в гелеобразующей ванне. Одна партия альгинатной клеточной смеси (1 мл) занимает около 30 минут для подготовки инкапсулированных клеток (примерно 25 000 микрокапсул).
  7. Вымойте сформированные микрокапсулы, содержащие клетки с мытьем раствора (10 мМ HEPES буферизированный солен, содержащий 1,5 мм CaCl2, рН 7,4) дважды. Не используйте PBS для стирки.
  8. Инкубировать инкапсулированные клетки с 10% FBS дополнены DMEM средств в увлажненный инкубатор на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты процесса инкапсулирования изображены на рисунке 1.

3. Подтверждение того, что инкапсуляция не влияет на жизнеспособность клеток

  1. После инкубации инкубационных клеток в течение 24 ч в носителях, подготовить небольшой образец 500 л (30 микрокапсул) для окрашивания.
  2. Вымойте микрокапсулы 2x с помощью стирального раствора (10 мМ HEPES буферизированный солен, содержащий 1,5 мМ CaCl2) и пятно их для живой жизни жизнеспособности с помощью живого / мертвого набора анализ.
  3. Приготовьте окрашивание смеси кальцийна Am (ацетоксиметил) и этидия гомодимера-1 при конечной концентрации 2 ММ и 4 ММ соответственно.
  4. Добавьте 2 мл окрашивающей смеси в инкапсулированные клетки и насигните 30-45 мин в темноте при комнатной температуре (RT).
  5. При тщательном стремлении, аспирации раствор окрашивания и мыть микрокапсулы 2x с стиральным раствором. Используйте флуоресцентную систему микроскопа для наблюдения и изображения инкапсулированных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Документация инкапсуляции изображена на рисунке 2.

4. Подтверждение того, что капсулы являются подходящим размером для доставки и доставки биологической

  1. Интравитальные инъекции в мышеловачном глазу обычно выполняются с помощью иглы 27 G (внутренний диаметр 210 мкм), прикрепленной к шприцу Гамильтона с 2,5 л.
  2. Создайте капсулы в диапазоне от 100 до 200 мкм, разбавьте их в безыворотке, и осторожно вытяните их в шприц Гамильтона. PBS не подходит автомобиль, как альгинат капсулы растворяются в PBS.
  3. Медленно выбрасывайте 1 капли, содержащие капсулы, на слайд микроскопа и определить их целостность с помощью вертикального ярко-поля микроскопа.
  4. Отрегулируйте размер капсулы (см. шаг 2.3) путем корректировки напряжения и скорости потока соответственно. Меньшие микрокапсулы производятся нелинейным способом за счет увеличения напряжения и несколько уменьшения скорости потока8. В наших руках наиболее подходящими оказались капсулы диаметром 150 мкм. Корректировка размера капсулы также зависит от поддержания постоянной концентрации альгината при изменении других параметров.
  5. Поддерживать отдельный набор клеток в капсулах соответствующего размера в сывороточной среде, чтобы определить количество секреции желаемого биологического. Используйте чувствительные ELISAs или западного blotting для определения концентрации биопрепаратов в супернатанте.
  6. Определить необходимое количество капсул, которые должны быть введены на основе известных PK / PD (фармакокинетика / фармакодинамика) терапевтических. В наших руках, 10 капсул на мышь глаз оказался наиболее эффективным.

5. Капсула Доставка в мышь Vitreous

  1. Выполняйте внутривитровитровые инъекции с помощью рассекающего микроскопа. См Рисунок 3 для хирургической настройки и материалов, используемых во время процедуры. Подробный протокол для внутривитрарных инъекций можно найти в другом месте16.
  2. Анестезия мышей путем интраперитонеальной инъекции ксилазина и кетамина (20 мг/кг и 80 мг/кг) или других предпочтительных анестезий, утвержденных Комитетом по уходу и использованию животных конкретного учреждения. Обеспечьте соответствующую глубину анестезии с помощью щепотки17.
  3. Упчат ездяки мыши с фенилэфрин HCL (2.5%) и сульфат атропина (1%) для обеспечения хорошей видимости стекловидной камеры и применить смазочный гель для глаз, чтобы держать их гидратированных во время процедуры.
  4. Прокол склеры на лимбу с 26 G иглы, как направляющее отверстие, убедившись, что 1) игла находится под углом 45 "с глазом и столом и 2) скошенный кончик указал вверх, чтобы избежать прокола объектива.
  5. Тщательно впрысните капсулы с помощью 27 G тупой кончик иглы прилагается к шприцу Гамильтон под углом 45 "под визуальный осмотр, убедившись, чтобы избежать прикосновения объективс с иглой. Травма хрусталика приведет к образованию катаракты. Капсулы должны быть видны в стекловидном с помощью рассекающего микроскопа(рисунок 4A).
  6. После опрокидки иглы, лечить место инъекции с антибиотиками мази неомицина и полимиксина B сульфатов в дополнение к дексаметазон офтальмологических антибиотиков мазь.
  7. Применить goniotaire hypromellose demulcent офтальмологический раствор (2.5%) для обоих глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время восстановительного периода.
  8. Поместите мышь на грелку, удерживаемую при 37 градусах Цельсия, и следите до полного пробуждения.
  9. Успешная инъекция инкапсулированных клеток ARPE-19 должна выявить наличие нетронутых капсул в стекловидной камере мыши только с незначительным количеством мусора при визуализации глаза оптической когерентной томографией или другими методами(Рисунок 4B).
  10. Вводили мыши глаз, после нескольких дней восстановления из-за операции, в настоящее время готов к экспериментальной парадигмы под рукой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая настройка и документация капсул в глазу изображены на рисунке 3 и рисунке 4,соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Клетки ARPE-19 являются спонтанно увековеченной клеточной линией RPE, которая, как было доказано, поддается инкапсуляции и долгосрочному выживанию при имплантации капсул в глаз. Инструменты для инкапсуляции альгината показаны на рисунке 1. В этом исследовании было продемонстрировано, что при инкапсуляции в альгинате, клетки в альгинатных капсулах были подтверждены ярко-поля изображения(Рисунок 2A). Live-мертвые анализы были выполнены на клетках внутри капсул, де...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод инкапсуляции клеток относительно быстр и прост в исполнении; однако, некоторые моменты должны быть в виду, чтобы получить точные результаты вниз по течению. Клетки должны поддерживаться в культуре в чашке Петри до инкапсуляции и проводиться при надлежащей стельности. Инкапсуляция должна выполняться в надлежащем вентиляционном капоте с регулируемым потоком воздуха, если это возможно. Слишком сильный воздушный поток может повлиять на образование капсулы, особенно в длительных экспериментах. Стерильная посуда и р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано грантами, присужденными B. R. Национальными институтами здравоохранения (R01EY019320), Департаментом по делам ветеранов (RX000444 и BX003050) и Фондом SmartState в южной Каролине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3 мл ШприцBD309656
30 г 1" Тупой иглойSAI Технология инфузииB30-100
Альгиновая кислота натриевая соль, из бурых водорослейSigmaA0682
Атропина сульфат Офтальмоловый раствор (1%)AkornNDC 17478-215-15для расширения зрачков
BD 1 мл Шприц 26 Г x 3/8 (0,45 мм x 10 мм)Becton, Dickinson и КомпанияDG518105 500029609 REF 309625для создания направляющего отверстия
Кальция хлорид, безводный, гранулированныйSigmaC1016
GenTeal TearsAlconNDC 0078-0429-47для смазки глаз во время анестезии
Гониотер: Гипромеллоза (2,5%) Офтальмолический денежный раствор (стерильный)Altaire Pharmaceuticals Inc.NDC 59390-182-13для смазывания глаз во время анестезии
игла/шприц Hamilton Наконечник: 27 G, Small Hub RN NDL, длина кустума (12 мм), тип точки 3, 6/PKHamilton7803-01для интравитреальной доставки капсул
Hamilton Шприц: 2,5 & микро; L, Model 62 RN SYR, NDL Продается отдельноHamilton7632-01для интравитреальной доставки капсул
HEPES buffer, 1 MFisher BioreagentsBP299100
высоковольтный генераторESD EMC TechnologyES813-D20
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisher ScientificL3224
L-орнитина гидрохлорид, 99%альфа AesarA12111
Неомицин и полимиксин В сульфаты и дексаметазона Офтальмольная мазьSANDOZNDC 61314-631-36антибиотик для профилактики инфекции после интравитреального введения
Фенолефрина гидрохлорид Офтальмоловый раствор (2,5%)AkornNDC 17478-201-15для расширения зрачков
Хлорид натрияSigmaS-5886
Стерильный шприц фильтры, 0,2 μ мVWR28143-312
Насос шприцевойGRASEBYMS16A

Ссылки

  1. Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
  2. Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
  3. Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
  4. Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).
  5. Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
  6. Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
  7. Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
  8. Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
  9. Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
  10. Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
  11. Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
  12. Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
  13. Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).
  14. Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).
  15. Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
  16. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).
  17. Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  18. Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
  19. Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
  20. Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).
  21. Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).
  22. Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
  23. Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
  24. Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ARPE 19LIVE DEAD
Инкапсулированные технологии клеток для доставки биологических препаратов для мышиного глаза
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.