Мы подвергли воздействию микрофизиологическую систему (MPS) с органоидами кишечника и печени на ацетаминофен (APAP). В данной статье описаны методы производства органоидов и оценки фармакокинетической и токсикологической собственности АПАП в MPS. В нем также описаны анализы функциональности тканей, необходимые для проверки результатов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микрофизиологическая система кишечника/печени для фармакокинетической и токсикологической оценки лекарственных препаратов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Недавно введенные микрофизиологические системы (MPS), культивирующие человеческие органоиды, как ожидается, будут работать лучше, чем животные, на доклинологической фазе испытаний процесса разработки наркотиков, поскольку они генетически являются человеческими и подыгрывать взаимодействию между тканями. В этом исследовании, кишечный барьер человека (эмулируется совместно культуры Caco-2 и HT-29 клеток) и печени эквивалент (эмулируется сфероидов из дифференцированных клеток гепаРГ и человеческих печеночной стеллат клетки) были интегрированы в двухорганический чип (2-OC) микрофлюидное устройство для оценки некоторых ацетаминофен (APAP) фармакокинетических (APAP) MPS было три сборки: кишечник только 2-OC, печень только 2-OC, и кишечник / liver 2-OC с теми же средствами, perfusing обоих органоидов. Для оценок ПК, мы dosed APAP в средствах массовой информации на заданных времени после введения его либо над кишечным барьером (эмуляция устного маршрута) или в средствах массовой информации (эмуляция внутривенного маршрута), на 12 МКМ и 2 МКМ соответственно. Образцы средств массовой информации были проанализированы с помощью жидкой хроматографии высокого давления (HPLC). Органоиды анализировались на экспрессию генов, значения TEER, экспрессию и активность белка, а затем собирали, чинить и подались на набор морфологических оценок. Техника MTT хорошо справились с оценкой жизнеспособности органоидов, но анализы высокого содержания (HCA) смогли обнаружить очень ранние токсичные события в ответ на лечение APAP. Мы проверили, что поток мультимедиа не влияет на поглощение APAP, в то время как он значительно улучшает функциональность эквивалента печени. APAP поглощения кишечника человека и печеночным метаболизмом может быть подражания в MPS. Связь между данными MPS и силико-моделированием имеет большой потенциал для повышения предсказуемости методов in vitro и обеспечения лучшей точности, чем модели животных в фармакокинетических и токсикологических исследованиях.
Введение
Из-за геномных и протеомных различий модели животных имеют ограниченную прогностический значение для нескольких исходов человека. Кроме того, они относят много времени, дорогие и этическисомнительные 1. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностический мощности и сократить расходы и время, проведенное с доклинических испытаний. Это микрофлюидные устройства, культивирующие органоиды (искусственные миметические функциональные единицы органов) под потоком мультимедиа, который способствует органоидно-органоидной коммуникации. Органоиды из клеток человека увеличивают транстулятнуюактуально....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Производство тканевых эквивалентов для выращивания в 2-OC
- Производство эквивалента тонкого кишечника
- Поддерживайте клетки Caco-2 и HT-29 с использованием эквивалентной кишечника среды: DMEM дополнен 10% FBS, 1% пенициллина и стрептомицина, и 1% несущественных аминокислот, который называется "DMEM S" в этой рукописи.
- Удалите среду, мыть дважды с 1x DPBS и добавить 8 мл 0,25% трипсина / ЭДТА, чтобы отмежеваться Caco-2 клеток, выращенных в колбах клеточной культуры (175 см2). Инкубировать в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию и остановить реакцию, добавив по крайней мере двойной объем ингибитора трипсина. Выполните ту же ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для выполнения испытаний PK APAP в 2-OC MPS, первым шагом является производство кишечника человека и печени эквиваленты (органоиды). Они интегрированы в 2-OC микрофлюидное устройство(рисунок 1A) 24 ч до начала анализа PK APAP. На следующий день среда изменена, и модель подвергается APAP. Рисунок 1 иллюстрирует эквиваленты кишечника и печени, помещенные внутри устройства 2-OC(рисунок 1B)и курс времени эксперимента APAP
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Точная и надежная оценка фармакологических свойств новых препаратов имеет решающее значение для снижения риска на следующих этапах развития. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностической мощности и сокращение затрат и времени, затраченных на доклинтические испытания. Наша группа продвигается в оценке фармакокинетических и токсикологических свойств, в основном необходимых для оптимизации свинца. Мы работали с 2-OC микрофлюидным устройством, которое имеет две камеры, что позво.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим д-ра Кристи Гуген-Гийозо, д-ра Филиппа Грипона в подразделении 522 INSERM и доктора Кристиана Трепо в подразделении 271 INSERM за использование биологического материала (клетки Hepa RG) и за то, что он был доступен для нас для проведения научных исследований.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | Без кальция, без магния |
| 2-OC | TissUse GmbH | Двухорганный чип | |
| 384-луночный сфероид Микропластина | Corning | 3830 | Черный/прозрачный, круглое дно, сверхнизкое вложение |
| 4% параформальдегида | Использование для фиксации клетки | ||
| Ацетаминофен | Sigma Aldrich | A7085 | Использование для анализа МПС |
| Ацетонитрил | Tedia | Используется для проведения ВЭЖХ | |
| Alexa Fluor 647 фаллоидин | Thermo Fisher Научный | конфокальный эксперимент | |
| Ацетат аммония | Sigma Aldrich | Используется для проведения ВЭЖХ | |
| Caco-2 клетки | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate буфер | |||
| Колбы | для клеточных культурКонфокальный | ||
| Leica | DMI6000 | ||
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM с высоким содержанием глюкозы | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Добавить добавки: 10% фетальная бычья сыворотка, 100 единиц на мл пенициллина, 100 &; г/мл стрептомицина, и 1% заменимых аминокислот |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Добавить 2% в среду HepaRG |
| Этанол | Синт | ||
| Фетал Бычья сыворотка | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Замораживающая среда OCT | Ткань-Тек | Ткань-Тек<Суп>&рег; O.C.T.™ Компаунд представляет собой рецептуру водорастворимых гликолей и смол, обеспечивающую удобную матрицу для срезов криостата при температурах -10°С; C и ниже. | |
| Гематоксилин и Эозин | |||
| HepaRG клетки | Biopredic International | HPR101 | Недифференцированные клетки |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Клетки и все добавки к культуре |
| Hoechst 33342 | HCA эксперименты | ||
| HT-29 клетки | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| человеческий инсулин | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| гидрокортизон | Sigma Aldrich | H0888 | |
| изопропанол | Merck | 278475 | |
| Karnovsky' s фиксатор | |||
| L-глутамин | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 защитная колонка SS | Phenomenex | Используется для выполнения ВЭЖХ | |
| Микроскоп | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 &; m поры размер вставки | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 метр | Merck | MERS00002 | Используется для измерения TEER |
| MitoTracker Deep Red | HCA эксперименты | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P система | Agilent Technologies | ||
| Neubauer камера | Подсчет клеток | ||
| Система визуализации оперетты с высоким содержанием | Perkin Elmer | Используется для проведения анализа HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 с люциферином-IPA | Promega Cat.# V9001 | ||
| Пенициллин/стрептомицин | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Клеточная культура |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | ||
| Histology Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF мембрана | BioRad | ||
| PVDF Шприцевой фильтр | 0,22 μ m размер пор | ||
| Обратная фаза Luna C18 колонка | Phenomenex | Используется для выполнения шейкера ВЭЖХ | |
| (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Используется для сфероидов для улучшения анализа MTT |
| Stellate Cell Medium (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Добавить добавки STeC CM |
| SuperScriptIITM Обратная транскриптаза | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific TRizol | ||
| TM реактив | Thermo Fisher Scientific | Тризол представляет собой монофазный раствор фенола и гуанидина изотиоцианата. | |
| Раствор трипсина/ЭДТА | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Пластины со сверхнизким креплением | Corning | CLS3471-24EA | 6 лунок |
| Vectashield плюс DAPI монтажный материал | |||
| White Opaque 96-луночный микропланшет | PerkinHelmer | ||
| Широкопроходные наконечники | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Добавить добавки: 10% фетальная бычья сыворотка, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц на мл пенициллина, 100 &; г/мл стрептомицина и 5 & микро; г/мл человеческого инсулина |
Ссылки
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
