Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Астроциты являются одними из наиболее распространенных типов клеток во взрослом мозге, где они играют ключевую роль в множественности функций. Как центральный игрок в гомеостаз мозга, астроциты питания нейронов с жизненно важными метаболитами и буфервой внеклеточной воды, ионов и глутамата. Неотъемлемый компонент синапса «трипартита», астроциты также имеют решающее значение в формировании, обрезке, обслуживании и модуляции синапсов. Для того чтобы позволить эти высоки взаимодействуюные функции, астроциты связывают между собой и с другими глиальными клетками, невронами, сосудом мозга, и внеклеточной окружающей средой через множество специализированных протеинов мембраны которые включают клетки молекулы адгезии, аквапорины, ионные каналы, нейромедиаторные транспортеры и молекулы разрывных узлов. Для поддержки этого динамического потока астроциты, как и нейроны, полагаются на тесно скоординированный и эффективный внутриклеточный транспорт. В отличие от нейронов, где внутриклеточный оборот был широко разграничен, микротубулы на основе транспорта в астроцитах были менее изучены. Тем не менее, экзо- и эндоцитарный оборот клеточных мембранных белков и внутриклеточного транспортировки органеллы организует нормальную биологию астроцитов, и эти процессы часто страдают при болезни или в ответ на травму. Здесь мы представляем простой протокол для культуры высокого качества муринааааа, чтобы флуоресцентно маркировать астроцитические белки и органеллы, представляющие интерес, и записывать их внутриклеточной динамики транспорта с помощью замедленной конфокальной микроскопии. Мы также демонстрируем, как извлечь и количественно определить соответствующие параметры транспортировки из приобретенных фильмов с помощью доступных плагинов анализа изображений (т.е. ImageJ/FIJI).
Введение
Астроциты являются наиболее распространенными клетками в центральной нервной системе взрослого человека, где они выполняют уникальные функции развития и гомеостатических1. Астроциты модулируют синаптической развитие через прямой контакт с до- и постсинаптическими терминалами как часть трехпартитного синапса, который содержит нейромедиаторные рецепторы, транспортеры и молекулы клеточной адгезии, которые способствуют формированию синапса и нейрон-астроцитов связи2. Кроме того, астроциты активно контролируют синаптической передачи и предотвратить возневнищее экситотоксичность путем быстрого удаления возбуждающих нейротрансм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры для животных были выполнены с одобрения Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл комитет по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Рассечение мозга и культура первичных астроцитов мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был адаптирован из опубликованных методов, который следует первоначальной процедуре, разработанной Маккарти и deVellis13,14,15. Смешанные клеточные культуры астроцитов Маккарти/ДеВеллиса (MD) готовятся из послеродового дня 2х4 (P2-P4) мышонки, обрабатываются антимитотический фактор, и о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол для создания первичной мыши MD астроцитов, изложенных выше должны дать воспроизводимые, высокое качество культур. Хотя культуры первоначально содержат смесь астроцитов, фибробластов и других глиальных клеток, включая микроглии и олигодендроциты(рисунок 1Bi,Biv; красные наконечники стрел), добавление AraC к смешанной культуре между DIV5-DIV7 сводит к минимуму распространение этих загрязняющих клеток. Комбинированная обработка AraC и стратегия очищения на основе тряск.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем экспериментальный подход к выражению, визуализации и отслеживанию флуоресцентно помеченных органелл и мембранных белков, представляющих интерес, используя видеомикроскопию замедленного времени в высокой чистоте первичных корковых астроцитов MD мыши. Мы также излагаем методологию измерения динамики частиц. Прямая визуализация белковой и органеллной динамики в первичных астроцитах обеспечивает мощный инструмент для изучения регуляции внутриклеточного переноса в этих клетках в пробирке.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
DNL была поддержана Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл (UNC) Школа медицины в качестве стипендиата Симмонса. TWR была поддержана КООН PREP Грант R25 GM089569. Работа с использованием КООН Центр нейронауки Центр Микроскоп Микроскоп Основные фонд был поддержан, в частности, за счет финансирования со стороны NIH-NINDS Неврология центр поддержки Грант P30 NS045892 и NIH-NICHD интеллектуальных и развития инвалидов научно-исследовательский центр Поддержка Грант U54 HD079124.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2,5% трипсин (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Настольная центрифуга | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Центрифуга |
| для клеточных культур качества Водный | ген клон | 25-511 | |
| Микроскоп для клеточных культур | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 инвертированный прицел, Микроскоп для инвертированной культуры тканей с флуоресцентными возможностями |
| Цитозин арабинозид | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Растворить лиофилизированный порошок в стерильной воде для клеточной культуры для получения 10mM запаса, аликвоту и заморозить для длительного хранения |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Растворить лиофилизированный порошок в деионизированной воде до максимальной концентрации 20 мг/мл, нагреть или обработать ультразвуком по мере необходимости. Используйте при 300 нМ для противозапятнания. |
| Препарирующий микроскоп | Zeiss | Stemi 305 | |
| Препарирующие ножницы | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gemini | 100-106 | Термоинактивированный |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Пинцет с тонким наконечником | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Флуоресцентный источник света | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP антитело | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) мышиное моноклональное антитело |
| Стеклянное дно Тарелки | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 мм Тарелка | No 1.5 Покровное покрытие | Диаметр стекла 14 мм | |
| Щипцы Graefe | без покрытия F.S.T | 11054-10 | Щипцы Graefe Iris с изогнутыми кончиками |
| Зеленый флуоресцентный краситель, который окрашивает кислотные компартменты (поздние эндосомы и лизосомы) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Предварительно растворен в ДМСО до 1 мМ стокового раствора. Разбавьте до конечной рабочей концентрации в питательной среде или буфере по выбору. |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнка (10x) | Gibco | 14065-056 | Магний и кальций без магния и кальция |
| Средства визуализации | Life Technologies | A14291DJ | Решение для визуализации живых клеток |
| Инвертированный конфокальный микроскоп | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| реагент для усилителя липофекции | Life Technologies | 11514015 | Plus |
| Реагент Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX реактив |
| Orbital shaketing incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , орбитальный встряхивающий инкубатор с контролем температуры и скорости |
| Раствор пенициллина/стрепомицина (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Фосфатно-солевой буфер (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-лизина гидробромид | Sigma | P7405 | растворить в трис-буфере, pH 8,5, при 1 мг/мл. Заморозьте для длительного хранения. Избегайте циклов замораживания и размораживания |
| Пониженная сывороточная среда | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Колбы для культуры тканей | Olympus Plastics | 25-209 | 75 см^2. 100% доступ под углом горлышка, 0,22 мкм гидрофобная вентилируемая крышка фильтра |
| Инкубатор для тканевых культур | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, инкубатор для тканевых культур с контролем |
| температуры, влажности и CO2Tris-Base | Sigma | T1503 | 8,402 г растворить до одного литра в воде с 4,829 г Tris HCl для получения 0,1 М Tris буфера, pH 8,5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4,829 г растворить до одного литра в воде с 8,402 г Tris Base для получения 0,1 M Tris buffer, pH 8,5 |
| Trypsin-EDTA (0,25%), фенол красный | Gibco | 25200072 | |
| вакуумные фильтрующие системы | Olympus Plastics | 25-227 | 500 мл, мембрана PES, 0,22 &; m |
| Ножницы Vannas прямые | Roboz | RS-5620 |
Ссылки
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
