Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60230

⸱

28 августа 2019 г.

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод живой визуализации in vitro для визуализации внутриклеточного переноса органелл и оборота плазменных мембранных белков в murine astrocytes. В этом протоколе также представлена методология анализа изображений для определения маршрутов грузовых перевозок и кинетики.

Аннотация

Астроциты являются одними из наиболее распространенных типов клеток во взрослом мозге, где они играют ключевую роль в множественности функций. Как центральный игрок в гомеостаз мозга, астроциты питания нейронов с жизненно важными метаболитами и буфервой внеклеточной воды, ионов и глутамата. Неотъемлемый компонент синапса «трипартита», астроциты также имеют решающее значение в формировании, обрезке, обслуживании и модуляции синапсов. Для того чтобы позволить эти высоки взаимодействуюные функции, астроциты связывают между собой и с другими глиальными клетками, невронами, сосудом мозга, и внеклеточной окружающей средой через множество специализированных протеинов мембраны которые включают клетки молекулы адгезии, аквапорины, ионные каналы, нейромедиаторные транспортеры и молекулы разрывных узлов. Для поддержки этого динамического потока астроциты, как и нейроны, полагаются на тесно скоординированный и эффективный внутриклеточный транспорт. В отличие от нейронов, где внутриклеточный оборот был широко разграничен, микротубулы на основе транспорта в астроцитах были менее изучены. Тем не менее, экзо- и эндоцитарный оборот клеточных мембранных белков и внутриклеточного транспортировки органеллы организует нормальную биологию астроцитов, и эти процессы часто страдают при болезни или в ответ на травму. Здесь мы представляем простой протокол для культуры высокого качества муринааааа, чтобы флуоресцентно маркировать астроцитические белки и органеллы, представляющие интерес, и записывать их внутриклеточной динамики транспорта с помощью замедленной конфокальной микроскопии. Мы также демонстрируем, как извлечь и количественно определить соответствующие параметры транспортировки из приобретенных фильмов с помощью доступных плагинов анализа изображений (т.е. ImageJ/FIJI).

Введение

Астроциты являются наиболее распространенными клетками в центральной нервной системе взрослого человека, где они выполняют уникальные функции развития и гомеостатических1. Астроциты модулируют синаптической развитие через прямой контакт с до- и постсинаптическими терминалами как часть трехпартитного синапса, который содержит нейромедиаторные рецепторы, транспортеры и молекулы клеточной адгезии, которые способствуют формированию синапса и нейрон-астроцитов связи2. Кроме того, астроциты активно контролируют синаптической передачи и предотвратить возневнищее экситотоксичность путем быстрого удаления возбуждающих нейротрансмиттеров из синаптической расщелины, рециркуляции нейротрансмиттеров, и участие в синаптической обрезкой3 , 4 , 5 , 6. Для того чтобы включить эти высоки взаимодействуючие функции, астроциты связывают между собой, с другими глиальными клетками, и с нейронами через специализированные протеины мембраны, включая молекулы стегезии клетки, aquaporins, каналы иона, нейромедиатор транспортеров, и разрыв узел молекул. Астроциты активно меняют поверхностные уровни этих белков в ответ на колебанияих внутри- и внеклеточной среды 7. Кроме того, изменения в уровнях и распределении митохондрий, липидных капель, а также деградативных и рециркуляционных органелл модулировать энергоснабжение, наличие метаболита и клеточных процессов очистки, которые имеют важное значение для астроцитов функции и Выживания.

Динамические изменения в мембранном белке и торговле органеллами и позиционировании в астроцитах способствуют согласованной функции моторных белков и адаптеров, которые способствуют подвижности грузов8,9. Аналогичным образом, поверхностные уровни мембранных белков модулируются через интернализацию и переработку событий10. Эти грузы перевозятся через сложную сеть актина, микротрубочки и, возможно, промежуточные нити треков8. Исследования, основанные на иммунофлуоресценции окрашивания конечной связывания белка 1 (EB1), который накапливается на растущей микротрубочки плюс концы, показывают, что в астроцитах пучки микротрубок излучают из периноклея и расширяют их плюс конец к периферии11. Тем не менее, комплексное изучение организации и полярности микротрубок и других цитоскелетных элементов с использованием живой клетки изображения по-прежнему отсутствует. В то время как многие из механизмов, лежащих в основе динамики органелл и мембранных белков, были широко изучены в нейронах и других типах клеток, подвижность груза в астроцитах менее хорошо понята. Большинство наших современных знаний об изменениях в распределении белков и органелл в астроцитах основано на традиционной маркировке фиксированной препаратом на основе антител, что исключает точное пространственное и временное изучение динамики груза7, 12.

Здесь мы описываем метод маркировки мембранных белков и органелл для живой визуализации в культурах астроцитов высокой чистоты. Используя этот протокол, мы приведиваем примеры, в которых мы отслеживаем динамическую локализацию зеленого флуоресцентного белка (GFP) помеченных мембранных белков в трансинфицированных астроцитах, включая разрыв соединения белка connexin 43 (Cx43-GFP) и возбуждающей аминокислоты транспортер 1 (EAAT1-GFP). Мы также описываем использование флуоресцентного ацидотропного зонда для визуализации кислых органелл и следованизаих их динамике торговли живыми астроцитами. Наконец, мы демонстрируем, как анализировать данные замедленного управления для извлечения и оценки транспортных параметров для отдельных грузов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для животных были выполнены с одобрения Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл комитет по уходу за животными и использованию (IACUC).

1. Рассечение мозга и культура первичных астроцитов мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был адаптирован из опубликованных методов, который следует первоначальной процедуре, разработанной Маккарти и deVellis13,14,15. Смешанные клеточные культуры астроцитов Маккарти/ДеВеллиса (MD) готовятся из послеродового дня 2х4 (P2-P4) мышонки, обрабатываются антимитотический фактор, и очищаются, чтобы дать окончательный обогащенный астроцит культуры. Четыре кортики от мышей щенков обоих полов достаточно, чтобы генерировать один T75 культуры культуры колбы культуры культуры культуры культуры культуры культуры культуры.

  1. Пальто нижней части T75 колбы (100% угловой доступ шеи, 0,22 мкм гидрофобных вентилируемых фильтр крышка) с поли-D-лизина (1 мг/мл в 0,1 М Tris буфер, рН 8,5) и инкубировать при 37 кв кв 24 ч до начала вскрытия.
  2. Перед началом процедуры вскрытия, теплые 30 мл астроцитов культуры средств (Dulbecco в модифицированных Eagle в среднем "DMEM" высокой глюкозы, 10% тепло-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 1% пенициллин / стрептомицин) на 37 градусов по Цельсию и оттепель 5 мл аликут 2,5% трипсин льда. Приготовьте две рассекающие блюда (60 мм в диаметре) на льду, наполненном 6 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) без Ca2 или Mg2 .
  3. Дезинфицировать все хирургические инструменты (тонкий наконечник пинцета, вскрытие ножницы, Ваннас ножницы прямо, Graefe щипцы с изогнутыми наконечниками) в 70% этанола до и между каждым вскрытием.
  4. Спрей головы и шеи p2-P4 мыши щенки с 70% этанола, прежде чем быстро эвтаназии их путем обезглавливания хирургическими ножницами. Выполните задний передний разрез средней линии вдоль головы, чтобы разоблачить череп. Аккуратно вырежьте череп от шеи до носа.
  5. Выполните два дополнительных боковых разреза, превосходящих глаза. Используя тонкие пинцеты кончика нежно переверните заслонки черепа в сторону. Удалите мозг и поместите его в первую рассекающую тарелку, наполненную ледяной HBSS без Ca2 "или Mg2". Держите блюдо на льду и продолжать собирать остальную часть мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните оставшуюся часть процедуры вскрытия под рассекающим объемом.
  6. Удалите обонятельные луковицы с помощью ножниц Vannas или тонкой пинцетом(рисунок 1Ай). С изогнутыми щипцы наконечникна на пересечении поперечных и межгемисферных трещин, осторожно вставьте вторую пару изогнутых щипцы кончик между корой и диэнцефалоном, медленно открывая щипцы, чтобы отделить полушария головного мозга от остальной части мозг(Рисунок 1Айи,Aiii). Удалить нежелательные ткани(Рисунок 1Айв).
  7. Для каждого коркового полушария, тщательно удалить оленя с тонкой наконечником пинцета. Дополнительно, удалить гиппокампа из кортиков. Перенесите расчлененные кортики мыши во второе блюдо, наполненное ледяным HBSS без Ca2 или Mg2 и держите его на льду, вскрывая оставшиеся мозги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение следующих шагов в асептических условиях в ламинарном капоте потока.
  8. Разрежьте расчлененные кортики на мелкие кусочки (примерно 2,4 мм) с помощью стерильных острых хирургических ножниц или скальпеля. Перенесите расчлененные ткани в коническую трубку 50 мл, содержащую ферментный раствор (22,5 мл HBSS без Ca2' или Mg2 ,2,5 мл 2,5% трипсина). Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут с нежной инверсией каждые 10 минут.
  9. Соберите переваренные ткани центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин и удалите ферментный раствор путем декантации (не используйте вакуумный аспиратор). Добавьте 10 мл астроцитов культуры средств массовой информации и разъединить ткани в одиночные клетки путем pipetting раствор 20'30x с помощью 10 мл серологический пипетка.
  10. Фильтр клеточной подвески через 70 мкм ячейки ситечко, чтобы свести к минимуму ячейки сгустки и непереваренной ткани. Соберите фильтрат в чистой конической трубке 50 мл и отрегулируйте общий объем до 20 мл с помощью носителей культуры астроцитов. На этом этапе оцените эффективность корковой диссоциации путем смешивания 10 злицовой суспензии клетки с 10 злипан синий и подсчета клеток с гемоцитометром.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один препарат из четырех кортиков мыши P2-P4 дает 10-15 х 106 одиночных ячеек.
  11. Аспирировать поли-D-лизиновый покрытие раствор из T75 культуры колбы и мыть дважды стерильной водой. Плита 20 мл клеточной подвески и инкубировать при 37 КС и 5% CO2.

2. Очищение и поддержание культур астроцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все изменения мультимедиа в асептических условиях в ламинарном капоте потока с помощью стерильной фильтровальной мембраны (0,22 мкм) астроцитов, разогретых до 37 градусов по Цельсию.

  1. Замените клеточный носитель 48 ч после покрытия (день в пробирке 2, DIV2).
  2. В DIV5, заменить средства массовой информации со свежими астроцитами культуры средств массовой информации дополнены 10 мкм цитозин арабиносид (AraC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг облегчает удаление загрязняющих клеток, в том числе фибробластов и других глиальных клеток. Важно относиться к культурам с AraC не более 48 ч, как больше времени инкубации позволит снизить жизнеспособность астроцитов.
  3. В DIV7, изменить средства массовой информации астроцитов культуры средств массовой информации без AraC и начать проверять культуры confluency ежедневно. После того, как клетки достигли 80% слияния, пальто два-T75 колбы для каждого неочищенного астроцита культуры колбу с поли-D-лизин и инкубировать при 37 кС, по крайней мере 8 ч до ночи.
  4. На следующий день, начать очистку астроцитов, встряхивая культуры фляги на 180 об/мин в течение 30 минут в 37 КК орбитального встряхивания инкубатора. Удалите средства массовой информации и заменить его свежими астроцитами культуры средств массовой информации. Встряхните клетки при 240 об/мин в течение 6 ч в орбитальном встряхивании 37 градусов по Цельсию. Prewarm 1x фосфат-буферный солен (PBS), астроцитов культуры средств массовой информации, и 0,25% трипсин-EDTA до 37 градусов по Цельсию 20-30 мин до конца периода встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация CO2не требуется во время встряхивания шагов. При желании средства массовой информации, собранные после 30-мин и 6-х тряски шаги могут быть использованы для культуры микроглии и олигодендроцитов, соответственно. AraC лечения смешанной культуры, однако, уменьшить обилие других глиальных клеток.
  5. Удалите культурную колбы из шейкера и немедленно замените носитель 10 мл теплого 1x PBS на колбу. Удалить PBS и добавить 3 мл 0,25% трипсин-EDTA на колбу. Инкубировать при 37 градусахПо кв. м и 5% CO 2, проверяя каждые 5 мин на отслоение.
  6. После того, как клетки отделились от колбы, остановить трипсинизации, добавив 10 мл астроцитов культуры средств массовой информации. Передача отдельных астроцитов в коническую трубку 50 мл и клетки гранул центругирование при 300 х г в течение 5 мин. Аспир супернатант и повторно приостановить клетки в 40 мл астроцитов культуры средств массовой информации.
  7. Вымойте поли-D-лизин покрытием T75 фляги дважды стерильной водой и пластины 20 мл очищенной астроцитной подвески. Вернитесь к инкубатору 37 и 5% CO2. Изменение астроцитов культуры средств массовой информации каждые два дня в течение дополнительных 10 дней, пока астроциты созреют.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая колба T75 очищенных астроцитов должна быть достаточной для производства 2 новых колб T75 с 3 х 105 ячейками каждый на покрытие.
  8. Повторите шаги 2,5–2,7 для последующих проходов или для микроэлементов для микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота культур астроцитов после добавления AraC и после очистки может быть оценена качественно с помощью яркой микроскопии поля, или, точнее, путем количественной оценки процента глиально-фибриллярного кислотного белка (GFAP)-положительного клетки на поле зрения в флуоресцентных изображениях(Рисунок 1B, C).

3. Трансфекция флуоресцентно помеченных плазмидов

  1. За день до трансфекции или маркировки, семена астроцитов при желаемой плотности для визуализации 24-48 h после трансфекции. Рекомендуемая плотность для 24-нуколой или 14 мм стеклянных нижних колодцев составляет 2 х 104 ячейки/хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для трансфекции астроцитов, покрытых 12-мм стеклянными крышками на 24-ну колодцах или 14-мм стеклянных нижних колодцах с использованием метода, основанного на липотеке. Реагенты должны масштабироваться в зависимости от размера блюда культуры, в котором растут астроциты.
  2. Разбавить липотекционный реагент(Таблица материалов) в сывороточных носителях (Таблица материалов). Чтобы оптимизировать соотношение липотекции реагента к ДНК, проверить диапазон адекватных разбавления. Например, при использовании реагента, используемого в этом протоколе(Таблицаматериалов), разбавить 2, 3, 4 и 5 л липофеоционного реагента в 50 qL пониженных сывороточных носителей.
  3. Разбавить 5 мкг ДНК высокой чистоты в 250 л сокращенных сывороточных носителей. Добавить 5 зл липотекции усилитель усилитель(Таблица материалов). Объедините трубку, содержащую реагент липотекции, с равным объемом смеси усилителя усилителя ДНК-липотекции. Смешайте трубачом и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин.
  4. Удалите среду астроцитов и добавьте трансфекционную смесь (шаг 3.3) в клетки. После инкубации 6-h при 37 градусах Поцельсии и 5% CO2замените трансфекционный комплекс соответствующим объемом носителей культуры астроцитов (2 мл для 14 мм стеклянных донных посуды). Инкубировать еще 24-72 ч, прежде чем приступить к приобретению изображения. Внимательно следите за продолжительностью инкубационного шага, чтобы достичь наилучшего баланса между экспрессией белка и жизнеспособностью клеток.

4. Маркировка поздних эндосом/лисосомы с использованием флуоресцентных зондов

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые грузы могут быть помечены с использованием флуоресцентных красителей с высоким сродством к грузовым белкам. Следующий пример позволяет маркировать поздние эндосомы/лисосомы флуоресцентным ацидотропным зондом.

  1. Разбавить лисосомально-маркировки зонда (Таблица материалов) в 200 Л астроцитов культуры средств массовой информации для рабочей концентрации 1 ММ и применять к астроцитов от шага 3.1 при плотности 2 х 104 клеток / хорошо. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
  2. Вымойте клетки один раз с теплой астроцитной культуры средств массовой информации и заменить изображения средств массовой информации (Таблица материалов). Приступайке к живой визуализации немедленно.

5. Приобретение изображений с помощью системы визуализации замедленного времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Time-lapse живой визуализации должно быть сделано с помощью флуоресценционного микроскопа оснащен высокоскоростной камерой, определенный фокус, инкубационная камера, и 40x цель масла с высокой численной диафрагмы (например, план-апохрома1.4NA). Разнообразие приобретения программного обеспечения доступно для замедленного изображения. Выбор системы микроскопии и программного обеспечения для приобретения должны основываться на их доступности и пригодности для целей конкретного исследования. Ниже приведены некоторые общие руководящие принципы.

  1. Поместите культурную камеру или блюдо в надлежащий адаптер на сцене микроскопа. Используя свет эпифлюоресценции, выберите клетки (ы), которые выражают флуоресцентные белки или зонд для записи. Отрегулируйте флуоресцентное освещение образца, чтобы визуализировать выбранную ячейку (ы) с помощью цифровой камеры. Избегайте использования высокой освещенности, которая может привести к фотоотбелению и фототоксичности. Отрегулируйте фокус и масштабирование.
  2. Приобретайте одну серию тайм-лап стека с частотой 1 кадр каждые 2 с для временных интервалов в диапазоне от 300 с до 500 с с с использованием зума и определенных функций фокусировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Динамика торговли людьми (скорость, частота движения и т.д.) будет варьироваться в зависимости от белка, интересующего, таким образом, время приобретения может потребовать корректировки. Например, митохондрии менее метительны, чем лисосомы, и проявляют частые паузы. В этом случае целесообразнее настроить параметры приобретения до 1 кадра каждые 5 с на 800 с.
  3. Экономьте замедленное изображение и экспортируйте их в виде файлов стеков AVI или TIFF.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений был проведен с помощью плагина KymoToolBox для ImageJ/Fiji16. Подробные пошаговые письменные инструкции доступны онлайн17. Следующие сокращенные шаги должны быть достаточными для создания kymographs и извлечения параметров транспортировки частиц.

  1. Откройте последовательность изображений замедленного времени в программном обеспечении ImageJ/Fiji. Импортируйте изображения из меню файлов файлов файлов файлов файлов AVI или TIFF. Преобразуйте изображения в 8-битные или 16-битные, выбрав один из этих типов изображений с помощью инструмента Type из меню изображения. При работе с файлами RGB разделите каналы с помощью инструмента Split Channel, доступного под функцией Color в меню изображения.
  2. Для создания kymograph (представление в положении и времени траекторий частиц) нарисуйте каждый трек, в котором частицы движутся, отслеживая линию вдоль траекторий частиц с помощью сегментированного инструмента линии. Чтобы правильно назначить направленность движения, нарисуйте полилин, используя одинаковую желаемую направленную конвенцию для всех фильмов, чтобы полярность была последовательной внутри и во всех исследуемых клетках. Например, нарисуйте полилин от центра клетки к периферии или наоборот. Отрегулируйте ширину линии, чтобы соответствовать толщине трека, нажав на инструмент Line.
  3. Выполнить Draw Kymo макрос плагина KymoToolBox с использованием ширины линии 10. Появится запрос с просьбой откалибровать изображение во времени (количество кадров, частота кадров) и пространство (x,y разрешение). После калибровки, kymographs генерируются и могут быть сохранены как TIFF файлы для представления данных или дальнейшего анализа частиц.
  4. Назначайте траектории частиц, вручную отслеживая каждую частицу в kymograph с помощью сегментированного инструмента линии в течение всего срока приобретения. Запись каждой траектории частиц как области интереса (ROI) с помощью инструмента менеджера roI, найденного в меню Analyse/Tools. Сохранить все ROIs за каждый промежуток времени видео для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно назначить правильную траекторию для отдельных частиц на kymograph для достижения наиболее точного расчета транспортных параметров.
    1. Выполнить анализ Kymo макрос плагина KymoToolBox. Откроется окно с просьбой определить "внешнее" направление движения частиц (слева направо или наоборот) из выпадающего меню. Этот выбор зависит от положения флуоресцентных грузов, изображенных относительно ядра или периферии клетки, как это установлено в шаге 6.2. Например, если ядро расположено слева от грузов, а полилин в шаге 6.2 оттягивается от ядра, определяем движение наружной частицы как "слева направо".
    2. Определите предельную скорость (минимальная скорость, с которой груз считается motile) в окне Анализа Kymo. Для грузов, которые движутся со скоростью внутриклеточного транспорта, 0,1 мкм в секунду является подходящим выбором. Измените это значение, чтобы настроить чувствительность программного обеспечения к каждому интересуемому грузу. Отрегулируйте ширину линии, чтобы соответствовать толщине каждой траектории частицы.
    3. Выберите журнал все данные и экстраполированные параметры координат в окне Analyse kymo. Это позволит рассчитать различные параметры грузового транспорта, включая средней скорости, внутреннюю скорость, внешнюю скорость, кумулятивное пройденное расстояние, пройденное расстояние в направлении внутрь или наружу, количество переключателей для каждой частицы, процент времени двигаясь в каждом направлении или приодя, и т.д. Данные, рассчитанные для отдельных треков, затем объединяются в kymograph и сохраняются в текстовых файлах, характерных для каждого изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Показать Цветные Kymo вариант анализ Ировать Kymo макро генерирует цветной наложения пути над оригинальным kymograph. Частицы, перемещающиеся наружу, окрашены в зеленый цвет, внутрь красным цветом и неподвижными частицами в синий цвет. Координаторы отчета по варианту Original Stack макроса Analyse Kymo создают цветную накладку позиции экстраполированного объекта на исходное видео и kymograph.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол для создания первичной мыши MD астроцитов, изложенных выше должны дать воспроизводимые, высокое качество культур. Хотя культуры первоначально содержат смесь астроцитов, фибробластов и других глиальных клеток, включая микроглии и олигодендроциты(рисунок 1Bi,Biv; красные наконечники стрел), добавление AraC к смешанной культуре между DIV5-DIV7 сводит к минимуму распространение этих загрязняющих клеток. Комбинированная обработка AraC и стратегия очищения на основе тряск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем экспериментальный подход к выражению, визуализации и отслеживанию флуоресцентно помеченных органелл и мембранных белков, представляющих интерес, используя видеомикроскопию замедленного времени в высокой чистоте первичных корковых астроцитов MD мыши. Мы также излагаем методологию измерения динамики частиц. Прямая визуализация белковой и органеллной динамики в первичных астроцитах обеспечивает мощный инструмент для изучения регуляции внутриклеточного переноса в этих клетках в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

DNL была поддержана Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл (UNC) Школа медицины в качестве стипендиата Симмонса. TWR была поддержана КООН PREP Грант R25 GM089569. Работа с использованием КООН Центр нейронауки Центр Микроскоп Микроскоп Основные фонд был поддержан, в частности, за счет финансирования со стороны NIH-NINDS Неврология центр поддержки Грант P30 NS045892 и NIH-NICHD интеллектуальных и развития инвалидов научно-исследовательский центр Поддержка Грант U54 HD079124.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,5% трипсин (10x)Gibco15090-046
Настольная центрифугаThermo Scientific75-203-637Sorvall ST8 Центрифуга
для клеточных культур качества Водныйген клон25-511
Микроскоп для клеточных культурZeissWSN-AXIOVERT A1Vert.A1 инвертированный прицел, Микроскоп для инвертированной культуры тканей с флуоресцентными возможностями
Цитозин арабинозидSigmaC1768-100MG(AraC) Растворить лиофилизированный порошок в стерильной воде для клеточной культуры для получения 10mM запаса, аликвоту и заморозить для длительного хранения
DAPISigmaD9542-5MGРастворить лиофилизированный порошок в деионизированной воде до максимальной концентрации 20 мг/мл, нагреть или обработать ультразвуком по мере необходимости. Используйте при 300 нМ для противозапятнания.
Препарирующий микроскопZeissStemi 305
Препарирующие ножницыF.S.T14558-09
Dulbecco's Modified Eagle MediumGen Clone25-500
Фетальная бычья сывороткаGemini100-106Термоинактивированный
FIJI (Fiji is Just Image J)NIHVersion 1.52i
Пинцет с тонким наконечникомF.S.T11254-20Style #5
Флуоресцентный источник светаExcelitas012-63000X-Cite 120Q
GFAP антителоCell Signaling3670SGFAP (GA5) мышиное моноклональное антитело
Стеклянное дно ТарелкиMattek corporationP35G-1.5-14-C35 мм Тарелка | No 1.5 Покровное покрытие | Диаметр стекла 14 мм |
Щипцы Graefeбез покрытия F.S.T11054-10Щипцы Graefe Iris с изогнутыми кончиками
Зеленый флуоресцентный краситель, который окрашивает кислотные компартменты (поздние эндосомы и лизосомы)Life TechnologiesL7526LysoTracker Green DND 26. Предварительно растворен в ДМСО до 1 мМ стокового раствора. Разбавьте до конечной рабочей концентрации в питательной среде или буфере по выбору.
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (10x)Gibco14065-056Магний и кальций без магния и кальция
Средства визуализацииLife TechnologiesA14291DJРешение для визуализации живых клеток
Инвертированный конфокальный микроскопZeissLSM 780
KymoToolBoxhttps://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
реагент для усилителя липофекцииLife Technologies11514015Plus
Реагент Lipofection ReagentLife Technologies15338100Lipofectamine LTX реактив
Orbital shaketing incubatorNew Brunswick Scientific8261-30-1008Innova 4230 , орбитальный встряхивающий инкубатор с контролем температуры и скорости
Раствор пенициллина/стрепомицина (100x)Gen Clone25-512
Фосфатно-солевой буфер (10x)Gen Clone25-507x
Poly-D-лизина гидробромидSigmaP7405растворить в трис-буфере, pH 8,5, при 1 мг/мл. Заморозьте для длительного хранения. Избегайте циклов замораживания и размораживания
Пониженная сывороточная средаGibco31985-062OPTI-MEM
Колбы для культуры тканейOlympus Plastics25-20975 см^2. 100% доступ под углом горлышка, 0,22 мкм гидрофобная вентилируемая крышка фильтра
Инкубатор для тканевых культурThermo Scientific51030285HERAcell VIOS 160i, инкубатор для тканевых культур с контролем
температуры, влажности и CO2Tris-BaseSigmaT15038,402 г растворить до одного литра в воде с 4,829 г Tris HCl для получения 0,1 М Tris буфера, pH 8,5
Tris-HClSigmaT32534,829 г растворить до одного литра в воде с 8,402 г Tris Base для получения 0,1 M Tris buffer, pH 8,5
Trypsin-EDTA (0,25%), фенол красныйGibco25200072
вакуумные фильтрующие системыOlympus Plastics25-227500 мл, мембрана PES, 0,22 &; m
Ножницы Vannas прямыеRobozRS-5620

Ссылки

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
  3. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  4. Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
  5. Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
  6. Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).
  7. Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
  8. Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
  9. Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
  10. Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
  11. Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).
  12. Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
  13. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).
  14. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  15. Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
  16. Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
  17. Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ImageJ
Визуализация и анализ внутриклеточного переноса органелл и других грузов в астроцитах
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.