Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Live Cell Imaging для оценки динамики метафазных сроков и клеточной судьбы после Митотической Spindle Perturbations

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60255

⸱

20 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для оценки динамики формирования шпинделя и митотического прогрессирования. Наше применение замедленной визуализации позволяет пользователю идентифицировать клетки на различных стадиях митоза, отслеживать и выявлять митотические дефекты, а также анализировать динамику шпинделя и судьбу митотических клеток при воздействии антимитотических препаратов.

Аннотация

Визуализация замедленного времени в живых клетках является важным инструментом в клеточной биологии, который дает представление о клеточных процессах, которые в противном случае могли бы быть упущены из виду, неправильно поняты или неправильно истолкованы анализом фиксированных клеток. В то время как визуализация и анализ фиксированных клеток надежны и достаточны для наблюдения за клеточным устойчивым состоянием, он может быть ограничен в определении временного порядка событий на клеточном уровне и плохо оснащен для оценки преходящего характера динамических процессов, включая митотической прогрессии. В отличие от этого, живая клеточная визуализация является красноречивым инструментом, который может быть использован для наблюдения за клеточными процессами на одноклеточном уровне с течением времени и имеет способность фиксировать динамику процессов, которые в противном случае были бы плохо представлены в визуализации с фиксированными клетками. Здесь мы описываем подход к генерации клеток, несущих флуоресцентно помеченные маркеры хроматина и микротрубочек и их использование в живых клеточных подходах к визуализации для мониторинга выравнивания метафазной хромосомы и митотической выхода. Мы описываем методы, основанные на визуализации, для оценки динамики формирования шпинделя и митотического прогрессирования, включая идентификацию клеток на различных стадиях митоза, выявление и отслеживание митотических дефектов, а также анализ динамики шпинделя и митотические клетки судьба после лечения митотические ингибиторы.

Введение

Анализ фиксированных клеток на основе изображений обычно используется для оценки изменений уровня популяции клеток в ответ на различные возмущения. В сочетании с синхронизацией клеток, а затем сбор и изображение серийных точек времени, такие подходы могут быть использованы, чтобы предложить клеточной последовательности событий. Тем не менее, фиксированная визуализация клеток ограничена тем, что временные отношения подразумеваются для населения и не демонстрируются на уровне отдельных клеток. Таким образом, в то время как фиксированная клеточная визуализация и анализ достаточны для наблюдения за надежными фенотипами и изменениями устойчивого состояния, способность обнаруживать переходные изменения с течением времени и изменения, влияющие только на субпопуляцию клеток, несовершенна. В отличие от этого, живая клеточная визуализация является красноречивым инструментом, который может быть использован для наблюдения за клеточными и субклеточными процессами в одной клетке, или клеточной популяции, с течением времени и без помощи подходов синхронизации, которые сами по себе могут повлиять на клеточное поведение 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.

Формирование биполярного митоtic шпинделя имеет важное значение для надлежащей сегрегации хромосомы во время деления клеток, в результате чего две генетически идентичные клетки дочери. Дефекты в структуре митотического шпинделя, которые развращает митотическую прогрессию и ставят под угрозу точность сегрегации хромосом, могут привести к катастрофическим делениям клеток и снижению жизнеспособности клеток. По этой причине, митотические яды, которые изменяют образование шпинделя являются перспективными терапии, чтобы ограничить быстрое распространение раковых клеток7,8,9. Тем не менее, фиксированный клеточный анализ структуры шпинделя после добавления митотических ядов ограничен в своей способности оценить динамический процесс формирования шпинделя и не может указывать, являются ли наблюдаемые изменения в структуре шпинделя постоянными или вместо этого преходящий и может быть преодолен, чтобы позволить успешное разделение клеток.

В этом протоколе мы описываем подход к оценке динамики митоза после возмущений шпинделя с помощью визуализации живых клеток. Использование hTERT увековеченных RPE-1 клеточной линии инженерии, чтобы выразить RFP помечены Histone 2B визуализировать хроматин, вместе с EGFP помечены й-тубулин для визуализации микротрубочек, сроки метафазной хромосомы выравнивания, анафазы начала, и в конечном счете судьба митотической клетки оценивается с помощью визуальных сигналов движения хромосомы, уплотнения и ядерной морфологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Поколение клеток hTERT-RPE-1 устойчиво выражает RFP-Histone 2B (RFP-H2B) и З-тубулин-ЭГП (tub-EGFP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги следуют асептическим методам и происходят в шкафу безопасности уровня биобезопасности II (BSL2).

  1. Создание ретровируса, несущего гены, представляющие интерес (з-тубулин-EGFP и RFP-H2B) путем трансфекции 293T-клеток с соответствующими лентивирными плазмидами в соответствии с инструкциями производителя системы доставки трансфекции на основе липидов.
    1. День 1: Используйте одноразовое стекло Пастер пипетка, чтобы аспирировать среды культуры клеток из пластины суб-конфилент29T клеток и смыть остаточной среде с фосфатами буферного соливого (PBS), добавив 5 мл PBS. Swirl распространять PBS по нижней пластины, а затем аспирировать PBS с стерильной одноразовой стеклянной pipette Pasteur.
    2. Добавьте 2 мл 0,05% трипсина, который был предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию и верните тарелку в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение 2 до 5 минут, чтобы позволить клеткам адептов быть освобожденными от поверхности тарелки клеточной культуры.
    3. Добавьте 8 мл свежего модифицированного орел-медиума Dulbecco (DMEM) в дополнение к 10% сыворотке крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина в тарелку, содержащую трипсин.
    4. Приостановите работу клеток, аккуратно протянив трубку и переветривайте подвеску на стерильную коническую трубку 15 мл. Поместите коническую трубку в сбалансированную центрифугу и вращайтесь при 161 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать клетки.
    5. Аспирировать раствор среднего/трипсина из пеллетных клеток и повторно приостанавливать клетки в 10 мл DMEM дополнены 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Используйте гемоситометр для подсчета 293T клеточной подвески и пластины 2 х 106 293T клеток на скважину 6 хорошо пластины.
    6. Культурные клетки в общем объеме 2 мл модифицированного орла Dulbecco Medium (DMEM) дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина и поддерживаются в увлажненном инкубаторе при 37 Градусах по Цельсию с 5% CO2.
    7. День 2: Pipette 7 л липидных основе трансфекционного реагента доставки и 100 л пониженной среды сыворотки в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки и позволяют ему инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин (трубка #1).
    8. В отдельной микроцентрифуговой трубке объемом 1,5 мл, пипетке 1 мкг вектора экспрессии RFP-H2B (или 1 мкг вектора экспрессии з-тубулин-ЭГПП), вместе с реагентом экспресс-усилителя мощностью 5 л (в соответствии с требованиями руководства производителя), 0,5 мкг pMD2.G и 1 мкг psPAX2 и 100 мкг уменьшенного сыворотки среднего (трубка #2).
    9. Объедините содержимое ступени 1.1.7 и шага 1.1.8 тщательно трубоуклады трубки #2 в трубку #1 и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть масштабирована по мере необходимости для трансфекции клеток в дополнительных скважинах.
    10. Пипетка трансфекционной реакции dropwise к желаемой хорошо, содержащих 293T клеток в 2 мл среднего и вернуть блюдо в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для генерации клеток, выражающих как RFP-H2B, так и a-tubulin-EGFP, генерируют отдельный вирус для каждой конструкции выражения (шаги 1.1.7- 1.1.9).
    11. День 3: Аспирируйте и замените среду 2 мл свежего DMEM, дополненного 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Вернуть блюдо в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  2. День 4: Соберите среду, содержащую выраженные частицы вируса, будучи осторожным, чтобы не нарушить или удалить 293T клеток. Фильтр среды, содержащей частицы вируса, проходя через фильтр 0,45 мкм, прикрепленный к 5 мл шприца. Аликвот вирус для кратковременного хранения при 4 градусах Цельсия, или долгосрочное хранение при -80 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные частицы, полученные таким образом, будут присутствовать в диапазоне 1 х 107 х 1 х 108 Преображенские единицы/мл. Поскольку вирусопроизводящие клетки и клетки, которые должны быть инфицированы, культивируются в одной и той же среде, вирусная концентрация для замены среды не требуется, и фильтрованные вирусные частицы могут быть использованы непосредственно для заражения клеток.
  3. Семена 2 х 105 hTERT-RPE-1 клетки на хорошо 6-наилучшим блюдо в рамках подготовки к вирусной инфекции. Культурные клетки в 2 мл DMEM дополнены 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина и поддерживать в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  4. День 5: Добавьте бромис того гексадиметрина (например, полибрен) к клеткам hTERT-RPE-1 до конечной концентрации 8 мкг/мл. Заразить клетки смесью из 500 л вируса, разбавленного в 500 л среды клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гексадимитрин бромидбульонный бульон раствор готовится в стерильной дистиллированной воде, а затем фильтруется через фильтр 0,45 мкм.
  5. День 6: Использование одноразового стекла Пастер пипетка, аспирировать среды из скважин, содержащих вирус инфицированных клеток. Замените среду культуры клетки с 2 мл DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, а также соответствующие концентрации антибиотика, чтобы выбрать для плазмидной интеграции и выражения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида экспрессии З-тубулин-ЭГП, используемая в описанных экспериментах, несет в себе ген пуромицин-резистентности, а плазмида экспрессии RFP-H2B несет ген сопротивления бласцидина. Таким образом, 10 мкг/мл пуромицицина и 2 мкг/мл бласцидина используются для выбора клеток З-тубулин-ЭГП, RFP-H2B, выражающих hTERT RPE-1. Концентрации антибиотиков, используемых для выбора может отличаться для различных клеточных линий, используемых.
  6. Поддерживайте клетки под отбором антибиотиков в течение 5-7 дней, заменяя среду каждые 3 дня свежей средой, содержащей соответствующие отборные реагенты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны поддерживаться при субслиянии во время отбора и должны быть расширены по мере необходимости, как описано в шагах 1.1.1 до 1.1.4.
  7. Используйте иммунофлуоресценцию для подтверждения выражения помеченных конструкций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, одноклеточные клоны могут быть получены для получения единообразных уровней экспрессии в популяции клеток. Как только будут подтверждены стабильные клоны, клетки могут поддерживаться в стандартных условиях культуры в отсутствие отбора антибиотиков.

2. Подготовка клеток для визуализации живых клеток после возмущений митотической шпинделя

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте асептические методы и выполнять шаги в шкафбезопасности BSL2.

  1. Используя стерильное одноразовое стекло Пастер пипетка, аспирируйте среду из культурной пластины, содержащей клеточную линию, которая несет конструкцию выражения (ы) (от шага 1.7). Кратко промыть клетки с 10 мл стерильных PBS. Вихрь распространять PBS по нижней пластины, а затем аспирировать PBS с стерильной одноразовой стеклянной pipette Pasteur.
  2. Добавьте 2 мл 0,05% трипсина в тарелку 10 см. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в течение 2-5 мин или до тех пор, пока клетки не отсоединятся от поверхности пластины.
  3. Добавьте 8 мл свежей среды в тарелку, содержащую трипсин. Приостановите работу клеток, аккуратно протянив трубку и переветривайте подвеску на стерильную коническую трубку 15 мл. Поместите коническую трубку в сбалансированную центрифугу и вращайтесь при 161 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать клетки.
  4. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend в 10 мл PBS, пайпетируя мягко с 10 мл серологического пипетки. Поместите коническую трубку в сбалансированную центрифугу и вращайтесь при 161 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы аккуратно гранулировать клетки.
  5. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend в 10 мл свежей среде, аккуратно прокладывая с 10 мл серологического пипетки.
  6. Подсчитайте клетки, затем вычислите число клеток с помощью гемаситометра и разбавьте до концентрации 1-2 х 105 клеток/мл в среде клеточной культуры. Семя 500 л клеточной подвески к каждой скважине стерильной 12-ну хорошо визуализации нижней пластины. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры и позвольте клеткам прилипнуть к поверхности пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация живых клеток требует, чтобы клетки были хорошо приклеены, чтобы они оставались связанными с плоскости изображения во время приобретения изображения. Продолжительность времени, необходимого для клеток придерживаться следующие покрытия может отличаться от одной линии клеток к другой и должны быть оптимизированы для клеточной линии в исследовании.
  7. До 30 мин до начала тайм-лап изображения, добавить соответствующую концентрацию митотического препарата в один или несколько из скважин, посеянных с клетками. Чтобы учесть потенциальное влияние органического растворителя на клеточное поведение, добавьте равный объем разбавителя ингибитора в клетки в качестве контроля. Например, убедитесь, что добавление 100 нМ специфического ингибитора митотической киназы Аврора А (например, ализертиб) параллельно с равным объемом ДМСО, разбавителя для этого препарата, в контрольной скважине клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнительный анализ динамических изменений в митотической прогрессии требуют подготовки колодцев клеток при отсутствии возмущений, позволяющих проводить визуализацию нормальных митозов параллельно экспериментальным условиям.

3. Микроскоп, созданный для замедленной визуализации RFP-H2B, q-tubulin-GFP, выражающих клетки(рисунок 1, рисунок 2)

  1. Поместите пластину культуры клеток, содержащую RFP-H2B, q-tubulin-GFP, выражающие клетки hTERT RPE-1, которые будут изображены в соответствующую стадию вставки на перевернутом эпифлюоресценционном микроскопе, который оснащен камерой высокого разрешения (пиксельный размер 0,67 мкм в 20x), экологическая камера предварительно разогрета до 37 градусов по Цельсию, а система доставки для увлажненного 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Либо закрытые экологические камеры или температуры контролируемых этапе вставки могут быть целесообразными при условии увлажненной 5% CO2 могут быть доставлены и стабильный контроль температуры получены.
  2. Используйте 20-x воздушную цель с численной диафрагмой 0,5 и оборудованную для высококонтрастной флуоресценции и фазового контраста или яркого поля изображения. Просмотр клеток с фазовой контрастной или яркой поля, отрегулируйте курс и сосредоточьте внимание на микроскопе, чтобы привлечь клетки в фокус.
  3. Определите и установите оптимальное время экспозиции для получения изображений Brightfield, GFP и RFP, выбрав соответствующий куб фильтра с соответствующим возбуждением и выбросом флюорофоров, которые будут изображены. Кроме того, нажмите кнопку автоматической экспозиции, чтобы ввести заранее определенное время экспозиции. Если сигнал не является достаточно интенсивным, выберите пиксельный биннинг, чтобы обеспечить более короткое время экспозиции, нажав на биннингную вкладку и выбрав 2 х 2 пикселя из меню drop down.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фототоксичность может ухудшить прогрессирование митотической и жизнеспособности клеток. Неспособность митотических клеток в контролируемых популяциях завершить нормальные митозы может свидетельствовать о том, что время воздействия и/или продолжительность изображения необходимо оптимизировать.
  4. Используйте программное обеспечение для приобретения и анализа, которое позволяет одновременно приобретать многокогосную, многоскважинную визуализацию и определять параметры для приобретения изображения.
    1. Выберите и откалибруйте сцену микроскопа до многоскважины, в соответствии с инструкциями производителя. Используйте программное обеспечение для приобретения изображений, чтобы выделить или иным образом выбрать скважины, которые будут изображены, нажав на соответствующие скважины в диаграмме формата пластины, которая используется.
    2. Под панелью управления GeneratedPoints (рисунок 2),определить координаты в каждой скважине, которые будут изображены, нажав на вкладку размещения точек и выбрав предопределенное или случайное размещение координат из падение вниз меню. Выберите вкладку «Рабочая зона» и выберите ограниченное из меню понижения, чтобы ограничить область выбора координат, чтобы исключить границы скважины. Нажмите на вкладки Count и Distribution, чтобы выбрать количество и распределение точек, которые должны быть захвачены в скважине, соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество координат, которые могут быть изображены на скважину в пределах 5 мин приращения времени будет ограничено числом скважин, которые будут изображены, а также время экспозиции для каждого канала. Как правило, 5-8 координат на скважину достаточно, чтобы наблюдать по крайней мере 50 клеток в каждом состоянии прогресс через митоз в течение 4 ч.
    3. Выберите и вввеждите временной интервал и продолжительность сбора изображений, нажав на и ввводя значения в панель управления TimeSequence.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение изображений каждые 1 до 5 минут подходит для мониторинга динамики митотической прогрессии. Общая продолжительность изображения должна отражать нужную конечную точку и скорость пролиферации клеточной линии. Например, 4 часа достаточно, чтобы увидеть, как многие клетки прогрессируют через митоз, 16 часов достаточно, чтобы увидеть большинство клеток RPE-1 в асинхронном прогрессе популяции через митоз.

4. Анализ изображения замедленного периода для определения метафазных сроков и судьбы митотических клеток после возмущений митотического шпинделя

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ изображений с помощью программного обеспечения для приобретения изображений(Таблица материалов), ImageJ, или сопоставимое программное обеспечение для анализа изображений.

  1. Визуализируйте RFP-H2B помеченный хроматин, выбрав изображения, полученные с помощью кубика фильтра RFP на месте. Определите ячейку, вводя митоз, как показано в первоначальном уплотнении хроматина(рисунок 2C,синяя стрелка) и ядерный конверт сломать (когда з-тубулин-EGFP больше не исключается ядерной границы).
  2. Определить митотическое время выравнивания метафазы и начала анафазы в отдельных клетках: Отслеживайте ячейку через последовательные временные точки в приобретенном фильме, чтобы определить количество таймтов/минут от митотического входа до rfP-H2B-маркированного хроматина завершает выравнивание на экваторе клетки во время метафазы(рисунок 2C,желтая наконечник стрелы).
  3. Для мониторинга митотического времени, митотической верности и судьбы клеток, продолжайте отслеживать клетку через последовательные временные точки, чтобы определить временной координат, при которых анафазная хромосома сегрегации очевидна(Рисунок 2C, белая стрелка) и /или где хроматин декомборации и ядерного конверта реформирования (как указано на тубулин исключение из ядра) произошло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возмущения в сборке шпинделя или митотической прогрессии могут быть оценены как функция времени, необходимого для получения биполярного митоtic шпинделя и достижения полного выравнивания хромосомы, или для завершения анафазной сегрегации хромосомы.
  4. Визуализируйте RFP-H2B для выявления клеток в каждой популяции, которые проявляют митотические дефекты, включая отстающие хромосомы и хроматины мосты во время анафазной сегрегации хромосомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компромиссный митотической верности может также привести к многоядерных или микронуклеядных клеток дочери и могут быть визуализированы в клетках после митотической выхода, как на рисунке 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка митотического прогрессирования в присутствии возмущений шпинделя
Регулирование фокусировки шпинделя полюса является важным шагом в надлежащем биполярное образование шпинделя. Нарушение в этом процессе через истощение белка, ингибирование наркотиков, или изменения в центросомном количестве коррумпированных структур шпинделя и задержки или остановки митотической прогрессии10,11,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Временное разрешение, обеспечиваемые замедленной визуализацией, позволяет визуализировать и оценивать последовательные клеточные события в одиночных клетках. Подходы, которые используют клеточной синхронизации с последующим сбором и фиксацией клеток в последовательных временных точках, ограничены тем, что сравнения в конечном счете проводятся между популяциями клеток. В условиях, когда клеточная реакция на возмущения может быть неравномерной, или когда процесс визуализации является динамичным, живой клеточной замедленной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

DLM поддерживается GRFP NSF. ALM поддерживается финансированием из Смит семьи премии за выдающиеся достижения в области биомедицинских исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсинGibo-Life sciences25-510Сериновая протеаза, используемая для высвобождения адгезивных клеток из культуральных чашек
15 мл центрифужные пробиркиOlympus Plastics28-101
20x CFI Plan Fluor objective NikonДля использования в визуализации живых клеток для визуализации как яркого поля, так и флуоресценции
293T CellsATCCCRL-3216Для использования при ретровирусной трансффекции; используется на этапе 1.1
a-тубулин-EGFP Векторэкспрессии альфа-тубулина, слитый с зеленой флуоресцентной белковой меткой; для использования в визуализации тубулина в визуализации живых клеток: коммерчески доступен через addgene и других поставщиков
AlisertibSelleckchemS1133Низкомолекулярный ингибитор митотической киназы Aurora A. Стоковая концентрация получена при 10 мМ в ДМСО и используется при конечной концентрации 100 нМ.
БластицидинИнвитрогенA11139-03Агент для отбора антибиотиков; используется для отбора клеток, экспрессирующих a-tub-EGFP
C02АэрогазДля использования в клеточных культурах и визуализации живых клеток
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)Chroma49005Набор однополосных фильтров; длина волны возбуждения 545 нм с шириной полосы 25 нм и излучение на длине волны 605 нм с шириной полосы 70 нм; для визуализации H2B-RFP
Chroma49002Комплект однополосных фильтров; длина волны возбуждения 470 нм с шириной полосы 40 нм и излучением на длине волны 525 нм с шириной полосы 50 нм; для визуализации GFP-тубулина
одноразовые стеклянные пипетки Pastuer, стерилизованныеFisher Scientific13-678-6AДля использования в аспирирующих клетках 
Дульбекко s Модифицированная среда Eagle (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084Среда для культивирования клеток для выращивания клеток RPE-1 и 293T
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Gibo-Life sciences10438-026Добавка среды для клеточных культур
Липофектамин 3000 и p3000InvitrogenL3000-015Реагент для трансфекции плазмид на основе липидов для трансфекции плазмид; используется в 1.1.4
Многолуночные чашки для культивирования тканейCorning различныедля использования в клеточных культурах, трансфекции/инфекции и визуализации живых клеток
Микроскоп Nikon Ti-EИнвертированный эпифлуоресцентный микроскоп Nikon для использования в визуализации живых клеток
NikonVersion 4.51Программное обеспечение для получения и анализа изображений; используется в разделах 3 и 4
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070Восстановленная сывороточная среда для трансфекции клеток; используется в шаге 1.1.3
Пенициллин/стрептомицин Gibo-Life sciences15140-122антибиотик, используемый в клеточной культуре средний
фосфатный буферный раствор (PBS)Caisson labsPBP06-10X1LTстерильный физиологический раствор для использования с клеточной культурой
pMD2.GAddgene12259Lentiviral VSV-G конструкция для экспрессии оболочки; используется на этапе 1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268Катионный полимер, используемый для повышения эффективности вирусной инфекции; используется на шаге 1.1.10
psPAXAddgene122602-го поколения лентивирусная упаковка плазмиды; используется на шаге 1.1.4
PuromycinInvitrogenant-pr-1Антибиотический агент селекционного агента; используется для отбора RFP-H2B экспрессирующих клеток
RFP-Histon 2B (H2B)Addgeneразличных номеровВектор экспрессии гистона 2B, меченного красным флуоресцентным белком; для использования в визуализации хроматина в визуализации живых клеток: коммерчески доступно через Addgene и других поставщиков
RNAi MaxInvitrogen13778-150Реагент для трансфекции миРНК на основе липидов для трансфекции конструкций миРНК
RPE-1 клеткиATCCCRL-4000Линия пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека
Чашка для культуры тканей 100x20 ммCorning 353003для использования в культивировании адгезивных клеток
Zyla sCMOS камера Nikon, прикрепленный к микроскопу, используется для съемки клеток
NIS Elements HC Фотоаппарат

Ссылки

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Live Cell Imaging для оценки динамики метафазных сроков и клеточной судьбы после Митотической Spindle Perturbations
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.