Анализы взаимодействия сокультуры, представленные в этом протоколе, являются недорогими, высокой пропускной их частью и простыми. Эти анализы могут быть использованы для наблюдения микробных взаимодействий в совместной культуре, выявления моделей взаимодействия и характеристики ингибирующего потенциала микробного штамма, интересующегося человеческими и экологическими патогенами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокая пропускная мощность Ко-культуры Анализы для исследования микробных взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение взаимодействий между микроорганизмами привело к многочисленным открытиям, от новых противомикробных препаратов до понимания микробной экологии. Многие подходы, используемые для изучения микробных взаимодействий, требуют специального оборудования и являются дорогостоящими и трудоемкими. В настоящем документе представлен протокол для анализов взаимодействия совместной культуры, которые являются недорогими, масштабируемыми для больших выборочных номеров и легко адаптируемыми к многочисленным экспериментальным проектам. Микроорганизмы культивируются вместе, каждый из которых хорошо представляет одну парную комбинацию микроорганизмов. Испытательный организм культивируется на одной стороне каждого колодца и впервые инкубируется в монокультуре. Впоследствии организмы-мишени одновременно прививаются на противоположную сторону каждого колодца с помощью 3D-печатной прививочной марки. После совместной культуры, завершенные анализы забиваются для визуальных фенотипов, таких как рост или ингибирование. Эти анализы могут быть использованы для подтверждения фенотипов или выявления закономерностей среди изолятов интересов. Используя этот простой и эффективный метод, пользователи могут анализировать комбинации микроорганизмов быстро и эффективно. Этот подход к совместной культуре применим к открытию антибиотиков, а также к исследованиям в области микробиома на основе культуры и уже успешно применяется в обоих приложениях.
Введение
В природе микроорганизмы редко существуют в изоляции; следовательно, они постоянно взаимодействуют с другими организмами. Поэтому изучение того, как микроорганизмы взаимодействуют друг с другом, имеет важное значение для понимания множества микробных поведений1. Микробные взаимодействия могут быть взаимоиссосимыми, сопутствующими или антагонистическими. Эти в teractions может повлиять не только на сами химеры микроорганизмов, но и окружающей среды и хостов, что микроорганизмы колонизировать1,2.
Многие ученые изучают микробные взаимодействия для выявления новых антимикробных молекул. Одна из первых клинически важных молекул противомикробных препаратов была обнаружена в результате изучения микробных взаимодействий. Сэр Александр Флеминг наблюдал загрязняющий пенициллий spp. изолировать, что препятствует росту штамма стафилококка, что привело к открытию широко используемых антибиотик пенициллин3. Характеристика механизмов, которые микроорганизмы используют для антагонизма своих конкурентов, остается плодотворным ресурсом для открытия антимикробных молекул. Например, недавно было показано, что Streptomyces sp. штамм Mg1 производит антибиотики линейных, которые имеют литическую и деградативную активность против Bacillus subtilis4.
Кроме того, нерибосомолицко синтезированный пептид имени lugdunin был недавно обнаружен после наблюдения, что носовой комменсальный стафилококк lugdunensis ингибирует золотистый стафилококк5. Исследования также показали, что взаимные взаимодействия между микроорганизмами столь же сильны, как антагонистические взаимодействия для открытия антимикробных молекул. Например, многие грибок-фермерских муравьев в племени Attini гавани симбиотические бактерии под названием Pseudonocardia на их экзоскелет, который производит противогрибковые молекулы для ингибирования обязывает возбудителя их грибковой культурой6. Поскольку изучение микробных взаимодействий было полезным для обнаружения антимикробных молекул, использование высокопроизводительных экранов может привести к открытию новых антимикробных молекул.
Что касается стоимости и простоты работы, то методологии, используемые для изучения микробных взаимодействий, варьируются от простых до сложных. Например, анализ агар-штепсельной вилки является недорогим и простым методом, который может быть использован для исследования антагонизма между несколькими микроорганизмами7. Тем не менее, анализ агар-штепсельной вилки не является эффективной процедурой и может быть трудоемким для многих парных комбинаций. Для оценки влияния микробно производимых продуктов на целевые изоляты, представляющие интерес в высокой пропускной форме, многие лаборатории используют дискдиффузионные анализы8. Эти анализы просты и недороги и могут быть масштабируемыми для более высокого числа образцов7. Тем не менее, этот анализ требует генерации микробных экстрактов и может привести к вводящим в заблуждение результатам для определенных комбинаций организмов-мишеней и антибиотиков, таких как сальмонеллы и цефалоспорины9.
Предыдущие подходы опирались на изолированные компоненты для вырастающей реакции в организме-мишень, вместо того, чтобы позволить микроорганизмам взаимодействовать друг с другом. Это примечательно, потому что взаимодействие между микробами может вызвать производство "загадочных" антимикробных молекул, которые не производятся в монокультуре. Например, недавно было показано, что противомикробный кейицин производится только Micromonospora sp. при совместной культуре с Rhodococcus sp., который изолирован от той же губкимикробиом 10. Более сложные методологии взаимодействия обходят эту потенциальную монокультурную помеху. Например, iChip полезен для изоляции редких и трудно культивируемых бактерий из экологических образцов и позволяет наблюдать микробных взаимодействий через рост на месте11. Для детального изучения взаимодействий можно использовать матричную лазерную десорпацию/ионизацию масс-спектрометрии изображений (MALDI-TOF-IMS). Этот подход содержит подробную информацию о составе и распределении малых молекул и пептидов, производимых путем взаимодействия микробных колоний с высоким пространственным разрешением. MALDI-TOF-IMS также был использован в многочисленных исследованиях бактериальных взаимодействий для характеристики механизмов конкуренции12,13,14,15. Тем не менее, MALDI-TOF-IMS часто требует кропотливой подготовки образцов, специализированных экспертиз для работы оборудования, а также дорогих и специализированных масс-спектрометров. По этим причинам, это трудный метод для использования для высокой пропускной воды исследований. Таким образом, было бы полезно провести простой, масштабируемый и высокопроизводительный анализ совместной культуры микробных взаимодействий, который преодолевает многие ограничения вышеуказанных подходов.
Здесь представлен протокол высокой пропускной пролимки микробной кокультуры. Этот анализ прост и легко включен в уже существующие исследования микробных взаимодействий. В отличие от многих широко используемых методов для изучения микробных взаимодействий, наш метод прост, недорог и поддается исследованию большого количества взаимодействий. Эти анализы не только просты в исполнении, но материалы широко доступны у большинства лабораторных поставщиков или государственных ресурсов (например, библиотек и makerspaces). Следовательно, этот анализ является выгодным в качестве первой линии исследования для выявления и разбора интересных моделей среди многих парных комбинаций микроорганизмов, которые могут быть особенно полезны для исследования микробной экологии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Информированное согласие было получено от родителей донора, и Комитет по гуманитарным вопросам при Университете Висконсин-Мэдисон одобрил исследование (Институциональный обзорный совет (IRB) утвержденный номер H-2013-1044).
1. Культура образца
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура используется здесь для изучения взаимодействий между изолятами бактерий из полости носа человека. В принципе, к любым культурным состояниям применимы следующие методы. Мозг сердце инфузионного бульона (BHI) используется для общего распространения носовых бактерий. Все пластины затвердевают с помощью 1,5% агара. Для этого исследования, образцы взяты из солей раствора покраснел в нос донора (носовая лаваж), переносится в микроцентрифуговых труб, и замороженные при -80 градусов по Цельсию.
- Используйте стандартные методы культуры, чтобы пластины 100 л каждого из талого промывки образцов на пластины BHI.
- Инкубировать пластины аэробно при 37 градусах по Цельсию в течение 1 недели.
- После инкубации выберите 2 колонии каждого отдельного морфотипа на тарелку и проход изолирует аэробно на пластинах BHI, выбив колонию из первоначальной пластины на новую пластину BHI и инкубируя пластину при 37 градусах Цельсия. Повторяйте до тех пор, пока бактериальные культуры не будут чистыми.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальные изоляты могут быть определены с помощью колонии морфологии, грам-окрашивания, 16S rRNA гена секвенирования, или другой метод. Однако знание личности изолятов не является необходимым для продолжения протокола. - Криоконсервировать все бактериальные изоляты при -80 градусов после объединения 1 мл 50% глицерола с 1 мл бактериальной ночной культуры (см. раздел 3) в криотубес.
2. 3D печать марки
ПРИМЕЧАНИЕ: Поликарбонат был выбран в качестве материала штамповки из-за его высокой температуры перехода стекла (147 градусов по Цельсию), который превышает стандартные температуры автоклава (121 кВ), что сводит к минимуму потенциал для деформации после повторного использования.
- Загрузите 3D принтер поликарбонатной нитью.
- Нанесите белый школьный клей (поливинилаа) на печатную кровать, чтобы помочь в сливе и свести к минимуму деформацию прививочной марки во время печати.
- Загрузите . Файл модели STL(Дополнительный файл данных) для прививочной марки(рисунок 1) в программное обеспечение для 3D принтера.
- Печать прививочный штамп при температуре сопла 290 градусов, температура кровати 60 градусов по Цельсию и высота слоя 0,38 мм.
- Оберните штамп в алюминиевой фольге и стерилизовать путем автоклавирования для 1.5 h на гравитационном цикле с 15 минутами сушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя поликарбонат гигроскопичен, марки сохраняют вес воды только около 0,5% после автоклавирования.
3. Подготовка ночных культур
- Используя серологический пипетку, пипетка 3 мл стерильного бульона BHI в 14 мл культуры труб.
- Используя стерильную петлю прививки 1 зл, привить бактериальную колонию в бульон. Вихрь петли для обеспечения комок рассеивается в бульон. Vortex трубы культуры кратко перед инкубации.
- Инкубировать культурные трубки при 37 градусах По цельсии на ночь (16 ч) на шейкере при 250 об/мин.
- Вихрь, чтобы разбить скопления клеток, как только бактериальные культуры достигают достаточной мутности (OD600 и 1).
4. Подготовка биоассаных пластин
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины биоассажа готовятся в ламинарном капоте для поддержания бесплодия.
- Подготовьте BHI-носители с 1,5% агаром и стерилизуем путем автоклавирования в соответствии с инструкциями производителя.
- После автоклавирования охладите бХИ-носители до 55 градусов по Цельсию в водяной бане, контролируемой температурой.
- Используя серологический пипетку, пипетка 3 мл расплавленных средств BHI в каждый из 12 скважин на 12 скважинной пластине. Убедитесь, что скважины максимально точны и ровны. Один литр носителя даст 27 пластин биоассии.
- Разрешить агар установить на ночь.
5. Инокуляция биоанализа пластин с тестовый организм
ПРИМЕЧАНИЕ: Испытательный организм относится к организму, для которого определяется выработка ингибирующей активности (например, производство антибиотиков) с помощью анализа взаимодействия сокультуры. Для этого эксперимента, испытательные организмы Actinobacteria изолированы из носовых образцов lavages.
- Прививать испытательный организм на биоассайской пластине, вставив стерильную петлю 10 л инокуляции в ночную культуру и прокладывая культурную каплю над левой третью пластины хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется только полоса одна треть скважины, так как заросляй скважины запрещает более позднюю прививку организмов-мишеней. - Повторяйте до тех пор, пока все 12 скважин на плите не будут привиты с испытательным организмом.
- Инкубировать пластины вверх дном при соответствующей температуре в течение 7 дней. При более высоких температурах (37 градусов по Цельсию) или в сухом климате храните тарелки во влажном контейнере, чтобы не допустить высыхания пластин.
6. Подготовка целевых организмов
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой организм относится к организму, состояние ингибирования которого определяется с помощью сокультурного взаимодействия. Для этого эксперимента, целевые организмы staphylococcus spp. изолированы от носовых образцов lavages.
- После инкубации биоассажных пластин в течение 6 дней, подготовить ночные культуры указанных целевых организмов, как это делается выше (см. раздел 3).
7. Целевая прививка организма
ПРИМЕЧАНИЕ: После ночной инкубации убедитесь, что культуры мутные (OD600 No 1). Некоторые бактериальные культуры могут flocculate на дне пробки культуры. Vortex культуры трубки для разгона скопления и оценить культуру мутности.
- Подготовьте целевую пластину, заполнив каждую скважину пустой 12 скважинной пластины 1,8 мл BHI и 200 л целевой ночной культуры.
- Разверните и поместите стерильную прививочную печать в целевую пластину. Аккуратно закружить культур вокруг в колодцах, заботясь, чтобы культуры не пересекают загрязняют соседние колодцы.
- Поднимите прививочный штамп и убедитесь, что на каждом наконечнике марки есть капля разбавленной целевой культуры.
-
Подготовьте контрольно-емлю монокультуры, поставив прививочной штамп на неинноизолированную пластину биоассай и аккуратно раскачивайте штамп так, чтобы падение культуры прививоли каждую скважину. После того, как прививочной штамп удаляется, капля культуры должна быть видна в колодцах пластины биоасса.
- Если какие-либо скважины не прививаются прививочной печатью из-за неравномерного уровня носителей, то направьте 3 злители разбавленной ночной культуры на правую сторону скважин с помощью пипетки.
- Прививать пластины биоассажа, как это делается выше (см. шаг 7.4.1), но выровнять штамп так, чтобы кончики выровнять с правой стороны 12 хорошо пластины. Убедитесь, что марка не контактирует с существующей бактериальной колонией при прививке скважин.
- Аккуратно снимите штамп и поместите обратно в целевую пластину.
- Повторите прививку для каждой пластины биоассай, пока все пластины не будут привиты.
- Инкубировать биоассадные пластины вверх дном при соответствующей температуре в течение 7 дней.
8. Скоринг
-
После совместного культивирования теста и целевых организмов в течение 1 недели, оценка взаимодействий на основе следующей визуальной оценки:
- Оценка скважин с целевым ростом организма, который демонстрирует рост, который неотличим от контроля монокультуры, как "0" (без ингибирования) (Рисунок 2A, B).
- Оценка скважин с целевым организмом, который проявляет снижение роста по сравнению с контролем, как "1" (слабое ингибирование) (Рисунок 2C).
- Оценка скважин, где целевой организм не растет как "2" (сильное ингибирование)(Рисунок 2D).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализы взаимодействия со культуры могут быть использованы для понимания микробных взаимодействий, выявления интересов и выявления микробных изолятов с интригующей деятельностью. В этих анализах испытательный организм монокультурируется с одной стороны 12 колодца агарплиты и инкубируется в течение 7 дней. Впоследствии, целевой организм был замечен рядом с испытательным организмом и два микроба были совместно культивированы в течение 7 дней, прежде чем забил для роста фенотипа организма-це...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Антибиотики и другие вторичные метаболиты, которые посреднические микробные взаимодействия полезны для множества применений, в ключая открытие лекарств. В этом вопросе представлен протокол для совместно-культурных анализов для оценки большого количества микробных взаимодействий. Эти анализы взаимодействия со культуры являются простыми, доступными, масштабируемыми и высокой пропускной мощностью средствами для исследования многих парных комбинаций микроорганизмов в тандеме. Целевые организмы пятнистые рядом с испытанием ор...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Благодарности
Мы благодарим Даниэля Мэй, Марка Шевретта и Дона Хоанга за критическое прочтение рукописи. Эта работа, в том числе усилия Кэмерона Р. Карри, была поддержана Университетом Висконсин-Мэдисон, Офис вице-канцлера по исследованиям и высшему образованию при финансировании из Висконсинского фонда исследований выпускников, финансирование также обеспечивается Национальные институты медицинских центров передового опыта в области трансляционных исследований (U19-AI109673-01). Рид М. Stubbendieck была поддержана Национальной библиотекой медицины учебный грант для вычислений и информатики в биологии и медицины Учебная программа (NLM 5T15LM007359). Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и интерпретации данных или принятии решения о представлении работы для публикации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 μ L одноразовые полистирольные инокуляционные петли, синие | VWR | 12000-806 | |
| 10 μ L одноразовые петли для инокуляции полистирола, желтые | VWR | 12000-810 | |
| 12-луночный планшет для культивирования клеток, стерильные с крышкой | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 мл полистирольная трубка с круглым дном, 17 x 100 мм 2стиль, непирогенный, стерильный | Falcon | 352057 | |
| 2.0 самостоятельные пробирки с винтовой крышкой и колпачками, стерильные | США научные | 1420-9710 | |
| 25 мл серологическая пипетка | Cell Treat | 229225B | |
| Агар, бактериологический | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Поликарбонатная нить, белая, диаметр 3 мм | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| Школьный клей | Elmer's | EPIE304 | |
| 3D-принтер Taz 6 | Lulzbot |
Ссылки
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234(2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226(1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722(2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516(2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
