Методическая статья

Фибробласт-Производные 3D Матричная система применима к эндотелиальной трубе Формирование Ассай

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60304

⸱

26 декабря 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Oncology Department, Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS), CIBERONC, 2Department of Medical Oncology, Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Universidad Autónoma de Madrid, CIBERONC, 4Department of Oncology & Pathology, Karolinska Institutet

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого метода заключается в получении фибробластов полученных 3D матрицы в качестве естественного эшафота для последующих клеточных анализов. Фибробласты засеяны в предварительно обработанной культуре пластины и стимулируются аскорбиновой кислотой для генерации матрицы. Матрицы децеллюляризируются и блокируются для культуры соответствующих клеток (например, эндотелиальных клеток).

Аннотация

Внеклеточная матрица (ECM) представляет собой трехмерную эшафот, которая выступает в качестве основной опоры для клеток в тканях. Помимо своей структурной функции, ECM также участвует в миграции клеток, распространении и дифференциации. Фибробласты являются основным типом клеток, изменяющих расположение и производство волокон ECM. При раке, CAFs (рак связанных фибробластов) находятся в постоянном статусе активации, участвуя в ECM ремоделирования, содействие миграции опухолевых клеток, а также стимулирование опухолевых ангиогенез, среди других про-опухолевих ролей. Целью этого метода является создание трехмерной матрицы с составом волокон, который похож на in vivo матрицы, используя увековеченные фибробласты или человеческие первичные CAFs. Фибробласты культивируются в предварительно обработанных плитах клеточной культуры и выращиваются под стимуляцией аскорбиновой кислоты. Затем фибробласты удаляются и матрицы блокируются для дальнейшего посева клеток. В этой модели ECM фибробласты могут быть активированы или изменены для создания различных видов матрицы, эффекты которых могут быть изучены в клеточной культуре. 3D матрицы также формируются клеточными сигналами, такими как деградация или перекрестные ферменты, которые могут изменить распределение волокон. В этом контексте, ангиогенез может быть изучен, наряду с другими типами клеток, таких как эпителиальные опухолевые клетки.

Введение

Внеклеточная матрица (ECM) представляет собой динамическую структуру, присутствующее во всех типах тканей. Он состоит из белков и полисахаридов, которые создают сеть волокон, имеющих решающее значение для клеточной слипа, миграции и связи1. Состав ECM варьируется в зависимости от ткани. В то время как коллаген i типа является наиболее распространенным структурным белком, коллагеновытипы II, III, V и XI также можно найти в различных тканях2. Фибронектин, генерируемый фибробластами, необходим для клеточной адгезии2. Кроме того, Есть другие структурные молекулы, как эластин, ламинин и поверхностные рецепторы, называемые интегрины, которые посредничата сборки волокна и специфичны для различных тканей ECM2. ECM играет важную роль в качестве клеточного эшафота, а также может быть вовлечен как в физиологические, так и в патологические процессы1. Аномалии в ECM наблюдаются при патологиях, таких как рак, который изменяет состав ECM и/или его организацию. В опухолях ECM представляет собой неклеточный компонент микроокружения опухоли (TME), сложную среду клеточных компонентов, таких как фибробласты, иммунные клетки, эндотелиальные клетки, перициты и различные растворимые факторы. Известно, что TME способствует прогрессированию рака и метастазам; связанных с раком фибробластов, как преобладающий тип клеток в опухолевой строми, принимают участие в этом процессе3. В отличие от нормальных фибробластов, ЦАО находятся в постоянной активации, показывая повышенную секрецию белков ECM и факторов роста (например, Преобразование фактор роста-я, TGF-я), а также более высокое выражение некоторых маркеров, таких как плавный актин мышц (З-СМА) и активация белка фибробласта (FAP)4. Тем не менее, CAFs являются неоднородной популяции клеток, показывая различные уровни активации или маркер ажиотажавыражение 5. Можно предположить, что состав и структура фибробластов, полученных от матриц, будет зависеть от статуса и характеристик фибробласта.

В этом контексте цель этой методологии заключается в создании соответствующей модели in vitro для генерации ECM фибробластами, эквивалентной настройкам in vivo ECM. Мы предлагаем такой подход в качестве метода перевода in vitro для дальнейших исследований функций опухолевых клеток, таких как химиорезация или миграция, опосредованных ECM. Как наша группа опубликовала в другом месте, CAFs могут быть получены из свежих образцов тканей, но это должно быть отмечено, что выживание CAFs в культуре ограничено, и их число прохода клеток уменьшается6. Кроме того, первичные культуры CAF, созданные из образцов пациентов, могут использоваться для генерации матрицы. Манипуляция экспрессией генов в фибробластах также является интересным способом получения разнообразных матриц в пробирке для оценки возможного воздействия на матричную композицию, ориентацию на волокна и т.д. В этом направлении, наша группа недавно сообщила о роли улитки-выражения фибробластов в составе и волоконной ориентации различных производных матриц7.

Кроме того, ЦАФы и ECM участвуют в сосудистой системе, как в генерации сосудов, так и в составе наружного слоя вазы8. ECM ремоделирования вызывает ангиогенез; матричные металлопротеины (ММП), как представляется, наиболее важным типом фермента, способствующего этому процессу9,10. Васкуляризация тканей первичных клеток, генерируют ЭКМ, макромолекулы ECM, остаточные факторы роста, включенные в ECM, матричную эластичность и толщину матрицы, описаны как факторы, участвующие в эндотелиальной активации клеток11. При опухолях гипоксия повышает жесткость ЭКМ и эндотелиальный росток поколения12. Кроме того, CAFs выделяют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и тромбоцитов полученных фактор роста (PDGF), которые стимулируют ангиогенез в опухолевой строми13. В этой области, в пробирке матричной генерации может быть использован для изучения ангиогенеза процессов или MMP действий в различных экспериментальных условиях. Таким образом, воспроизведение в пробирке наиболее аналогичной матрицы in vivo может быть ценным инструментом для изучения роли ECM в ангиогенезе или микро-экологических клеточных взаимодействий.

Стимуляция культивированных фибробластов аскорбиновой кислотой для улучшения матричного осаждения и создания ECM является общепринятым способом производства аналогичных матриц виво. Увековеченные линии фибробластных клеток легко культивируются и активируются различными факторами роста, такими как PDGF-BB, Фактор некроза опухолей (ТНФ-я) илиTGF-14. В рамках TME, CAFs синтезировать тип I коллагена и фибронектина в качестве основных компонентов ECM4. Аналогичным образом, эти компоненты находятся в качестве основных компонентов в пробирке генерируемых фибробластов полученных матриц(Рисунок 1).

Существуют различные методологии in vitro для имитации in vivo ECM. Использование покрытой культуры блюда со смесями ECM волокон был продлен в прошлые годы, но этот 2D подход нуждается в улучшении 3D структур, таких как кросс-связанные гели (например, Matrigel)1. Установка типа Matrigel стала стандартным методом моделирования 3D-матрицы. Фибрин также является альтернативой при генерации матриц, но не с точки зрения прочности и долговечности ECM1. Коллаген, используемый в сочетании с другими компонентами ECM, вносит изменения в некоторые из вышеупомянутых проблем. Тем не менее, эти гели коллагена образуют сильную сеть с волокнами, которые могут быть ориентированы, но очень неоднородны, что может быть проблемой в экспериментах повторений1. Тем не менее, следует предположить, что, в зависимости от цели экспериментов, использование Matrigel или других гидрогелей является более целесообразным (например, в исследованиях сокращения матриц, в которых сокращение геля может быть легко обнаружено).

Потенциальная иммуногенность генерируемых матриц может быть проблемой в экспериментах с некоторыми типами клеток. Таким образом, чтобы уменьшить вероятность иммунных реакций из-за ECM генерирующих клеток при использовании нашего метода, матрицы децеллюляризованы и промываются, хотя удаление фрагментов клеток не может быть всего15. Идеальный ECM должен быть совместим с клеточной культурой и уметь общаться и реагировать на сигналы клеток. Наша процедура позволяет вводить изменения без затруднений при производстве ECM (например, добавление фибробласт-стимулирующих факторов роста).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы тканей человека были получены с одобрения Научно-исследовательского совета по этике больницы Рамон-и-Кахал, Мадрид.

1. Подготовка решений

  1. Приготовьте 0,2% желатина: добавьте 1 г желатина до 500 мл PBS. Автоклав раствор и держите при 4 градусах Цельсия. Фильтр с фильтром 0,22 мкм перед использованием.
  2. Подготовка 1% глютаральдегид: Добавить 1 мл 25% раствора запасов глюктаральдегида до 24 мл PBS. Фильтр с фильтром 0,22 мкм перед использованием.
  3. Подготовка 1 M этаноламин: подготовить этаноламин раствор со стерильным H2O. Фильтр с 0,22 мкм фильтр перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как этаноламин предоставляется крышка безопасности, игла и шприц будет необходимо.
  4. Приготовить аскорбиновую кислоту: добавить 0,1 мл 50 мг/мл бульонного раствора аскорбиновой кислоты (светочувствительной) до 100 мл средней.
  5. Подготовка буфера лиза: подготовить PBS 0.5% Triton 100X с 20 нм NH4OH. Добавить NH4OH прямо перед использованием.
  6. Подготовка PBS Pen/Strep: разбавлять ручку/стрепу до 100 U/mL Pen и 100 мкг/мл Strep.
  7. Подготовка DMEM с 10% FBS: Добавьте 10% FBS до 500 мл DMEM. Дополнение с 100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мЛ стрептомицин, 0,1 мг/мл Нормоцин и 0,25 мкг/мл амфотерицин B.
  8. Приготовьте 2% BSA тепла денатурированных: добавить 2 г BSA до 100 мл стерильной воды. Теплый в кипящей воде в течение 7 мин.
  9. Подготовка FBS с антибиотиками: дополнение FBS с 200 U/mL пенициллин, 200 мкг /мЛ стрептомицин, 100 мкг/мл гентамицин и 2,5 г/мЛ амфотерицин B.

2. Подготовка клеточной культуры

  1. Увековеченная линия клеток фибробластов
    1. Культура рекомбинантных теломераза трансфицированных увековеченных человека крайней плоти фибробластов (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) в DMEM с 10% FBS и поддерживать на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  2. Эндотелиальные клетки
    1. Культура человеческой пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVECs, ATCC PCS-100-013) в EBM-2 среды, содержащей 2% FBS и поддерживать на 37 КС и 5% CO2.
  3. Фибробластная первичная культура
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания CAF и культуры, протокол, ранее опубликованный нашей группой, следовал6.
    1. Кратко, вырезать образцы тканей на мелкие кусочки примерно 2-3 мм3 и семян в FBS с высокой концентрацией антибиотиков.
    2. Когда появились первые фибробласты, замените среду с fbM-средой для поддержания клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от происхождения тканей, клеточные культуры могут быть загрязнены легко. Образцы для мытья в ПБС дополняются антибиотиками, с сильно загрязненной тканью (например, толстой кишки6)и встряхивают в течение 30-45 мин.

3. Фибробласт атизируемое 3D Матрицы (адаптировано из Кастелье-Крос и Кукьерман16)

  1. Добавьте 2 мл по 0,2% желатина к каждому колодцу 6-хорошей пластины и насижайте по 1 ч при 37 градусах Цельсия или на ночь при 4 градусах Цельсия.
  2. Аспирируй желатин и мыть его в 2 мл PBS.
  3. Добавьте 2 мл 1% глютаральдегида и инкубировать в течение 30 мин на RT. Глютаральдегид будет поперечной желатин.
  4. Аспирный глютаральдегид и мыть колодцы в 2 мл PBS в течение 5 мин. Повторите 3 раза.
  5. Добавить 2 мл 1 M этаноламин и инкубировать в течение 30 минут на RT. Этаноламин будет действовать, чтобы блокировать оставшиеся глютаральдегида.
  6. Аспир этаноламин и мыть скважины в 2 мл PBS в течение 5 мин. Повторите 3 раза.
  7. Добавьте 1 мл DMEM с 10% FBS. Если среда сразу становится розове, удалите среду, промойте в 2 мл PBS и добавить еще раз 1 мл DMEM с 10% FBS.
  8. Семя 1 мл фибробластной суспензии, с 5 х 105 клетками в каждой скважине. Общий объем в каждой скважине составит 2 мл.
  9. Культурные ячейки до 100% слияния не достигаются. Затем удалите среду и заменить DMEM с 10% FBS с 50 мкг /мл аскорбиновой кислоты и дополнительного лечения при использовании.
  10. Замените среду на свежий DMEM 10% FBS и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты каждые 2 дня в течение 6 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется дополнительное лечение (например, PDGF-BB, TGF-и/или другие факторы роста), добавляйте их в те же дни, что и лечение аскорбиновой кислотой.
  11. Через два дня после последнего лечения аскорбиновой кислотой, удалить среду и вымыть в 2 мл PBS.
  12. Медленно добавьте 1 мл буфера лисиса, предварительно нагретого при 37 градусах Цельсия, к каждому колодцу. Инкубировать в течение 5-10 мин на RT до фибробластов лиза (наблюдаемые под микроскопом).
  13. Тщательно и без удаления буфера лиза, добавьте 2 мл PBS. Затем аспирирует сятву примерно 2,5 мл PBS. Повторите дважды в общей сложности три стирания.
  14. В конце концов, удалить 2,5 мл PBS и добавить 2 мл PBS с пером / Strep (100 U/mL и 100 мкг /мл, соответственно). Печать с пленкой и держать на 4 градуса х в течение 3 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от эксперимента, длительное хранение сгенерированных матриц может повлиять на результаты. Мы рекомендуем использовать матрицы как можно скорее, и тем более, если эксперимент включает в себя посев клеток, в связи с возможной деградацией белка. Если матрицы используются для структурных анализов, таких как наблюдение коллагена, матрицы могут быть исправлены и храниться в течение более длительных периодов. Этот протокол указан для 6-хорошо культуры пластины. Другие пластины могут быть использованы, но реактивные объемы и концентрация клеточной подвески должны быть пересчитаны в соответствии с областью скважины.

4. Труба Формирование Ассай

  1. Выращивайте клетки HUVEC в EBM-2 2% FBS до максимального слияния.
  2. Замените среду на EBM-2 без FBS на 8 ч.
  3. Подготовьте матрицы перед посевными клетками.
    1. Удалить матрицы из холодильника и место для 1 ч на RT.
    2. Блок матрицы, добавив 2 мл теплоденатурированных 2% BSA. Инкубировать 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    3. Аспир bsA и мыть в 2 мл PBS.
  4. Семена 2 х 105 HUVEC клеток в FBS-обеденной среде на каждом колодце 6-хорошо пластины ранее покрыты 3D фибробластов полученных матриц.
  5. Инкубировать эндотелиальные клетки при 37 градусах по Цельсию на 16 ч.
  6. Изучите трубоподобную структуру под стандартным ярким полевым микроскопом при увеличении в 20-40 раз.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

PDGF-BB стимулировали фибробласты создают более толстый ECM. Herrera et al. показали, как стимулируемые PDGF фибробласты генерировали более толстую матрицу, а также более высокую ориентацию волокна7. BJ-hTERT фибробласты были инкубированы с или без PDGF и представительных областях наблюдается показал более выровненные распределения клеток в матрицах, производимых PDGF стимулировали фибробласт(Рисунок 1a). Коллаген I и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Матрицы могут быть созданы с увековеченными фибробластами или первичными культурами фибробластов. Фибробласты легко поддерживать в культуре in vitro с высокими темпами роста и стрессоустойчивостью. Они могут быть даже изолированы от посмертной ткани3, хотя загрязнение может быть ограничением, в зависимости от происхождения ткани.

Модель 3D-матрицы предлагает новую и эффективную систему для успешного изучения состава ECM и волоконной ориентации. Он также подходит для ана...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Разработка этого протокола была поддержана PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 и RD12/0036/0041 от Института Салуда Карлоса III; по Фондо Европао де Десарролло Региональный (FEDER); "CIBER де Кансер", CB16/12/00273 и CB16/12/00446, от Института Салуд Карлос III-ФЕДЕР; и Фондом Кьентифика АЕКК (многогранный подход к борьбе с раком поджелудочной железы). Кристина Пенья является получателем контракта Мигеля Серве тазна от Института Салуд Карлос III. М. Иод помогал с английским текстом. Мы благодарим сотрудников лаборатории за помощь и советы на протяжении всего этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гидроксид аммония (NH4OH)RothA990.1
Amphotericin-BCorning30-003-CF
Бычий сывороточный альбумин (BSA)SigmaA7906-50G
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Corning10-014-CVR
Эндотелиальная базальная среда (EBM)LonzaCC-3121добавлять добавки перед применением
Добавки базальной среды эндотелиальных клеток (EGM-2)LonzaCC-4176
ЭтаноламинSigma411000-100ML
Фетальная бычья сыворотка (FBS)BiowestS181B-500термоинактивированный перед применением
Базальная среда роста фибробластов (FBM)LonzaCC-3131добавлять добавки перед использованием
Добавки и факторы роста фибробластов (FGM-2)LonzaCC-4126
Желатин из кожи крупного рогатого скотаSigmaG9391-100G
ГлутаральдегидSigmag5882
L-аскорбиновая кислотаSigmaA92902-100Gсветочувствительный
L-глютаминLonzaBE17-605E
НормоцинИнвивоген3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycin (Pen/Streprep)Gibco15140122
фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)Corning21-040-CVR
Triton X100Roth3051
Рекомбинантная теломераза трансфицированная иммортализованные фибробласты крайней плоти человека (BJ-hTERT)ATCCATCC CRL-4001
Пупочная вена человека эндотелиальные клетки (HUVECs)ATCCPCS-100-013

Ссылки

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
  3. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  4. Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
  5. Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
  6. Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773(2016).
  7. Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76(2018).
  8. MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
  9. Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
  10. Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
  11. Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
  12. Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
  13. Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
  14. Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
  15. Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
  16. Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HUVECPDGF

Похожие статьи