Методическая статья

Сравнение метастатической ясной клеточной почечной карциномы модели, созданной в мышиной почки и на куриные хориоаллантоический Membrane

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60314

⸱

8 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Метастатическая ясная клеточная карцинома является заболеванием без комплексной модели животных для тщательного доклинического исследования. Этот протокол иллюстрирует две новые модели животных для болезни: ортотопически имплантированной мыши модели и курица хориоаллантоической мембранной модели, оба из которых демонстрируют метастазирование легких, напоминающие клинические случаи.

Аннотация

Метастатическая ясная клеточная карцинома (ccRCC) является наиболее распространенным подтипом рака почек. Локализованный ccRCC имеет благоприятный хирургический исход. Тем не менее, одна треть пациентов CCRCC будет развиваться метастаза в легких, что связано с очень плохим исходом для пациентов. К сожалению, для этой смертельной стадии не предусмотрена терапия, так как молекулярный механизм метастазиса остается неизвестным. Уже 25 лет известно, что потеря функции гена супрессора опухоли фон Гиппель-Линдау (VHL) является патогномонической ccRCC. Однако не было создано клинически релевантных трансгенных мышей модели ccRCC. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы внедрить и сравнить две вновь созданные модели животных для метастатического ccRCC. Во-первых, почечная имплантация в модели мыши. В нашей лаборатории система редактирования генов CRISPR была использована для выбивания гена VHL в нескольких линиях клеток RCC. Ортотопическая имплантация неоднородных популяций ccRCC в почечную капсулу создала новые модели ccRCC, которые развивают надежные метастазы легких у иммунокомпетентных мышей. Вторая модель - система куриной хориоаллантоической мембраны (CAM). По сравнению с моделью мыши, эта модель больше времени, труда и экономически эффективным. Эта модель также поддерживала надежное образование опухоли и интравазацию. Из-за короткого 10-дневного периода роста опухоли в CAM, никаких явных метастаз не наблюдалось иммуногистохимией (IHC) в собранных тканях эмбриона. Однако, когда рост опухоли был продлен на две недели в вылупившихся курица, микрометатические поражения ccRCC наблюдались IHC в легких. Эти две новые доклинические модели будут полезны для дальнейшего изучения молекулярного механизма метастазов, а также для создания новых, полученных пациентом ксенотрансплантатов (PDXs) к разработке новых методов лечения метастатического ccRCC.

Введение

Карцинома почечных клеток (RCC) является7-м наиболее распространенным раком в Соединенных Штатах. Ежегодно, 74000 американцев, по оценкам, вновь диагностируется, что составляет более 14000 смертей (Ясно-клеточный гистологический подтип, или ccRCC, является наиболее распространенным подтипом, на долю которого приходится около 80% случаев RCC. Пациенты с локализованной злокачественностью лечатся нефрэктомией и имеют благоприятную 5-летнюю выживаемость 73%1. Тем не менее, 25%-30% пациентов развиваются отдаленные метастаза в жизненно важные органы, такие как легкие, в результате чего плохое среднее выживание 13 месяцев и 5-летняя выживаемость только 11%1,2,3. Дальнейшее понимание метастатического механизма необходимо для улучшения смертельного исхода для метастатического ccRCC.

Потеря гена супрессора опухоли VHL является отличительной чертой генетического поражения наблюдается в большинстве случаев ccRCC человека4,5,6,7. Однако точный онкогенный механизм потери ВХЛ в ccRCC неизвестен. Кроме того, статус выражения VHL не является предсказуемым исхода в ccRCC8. Примечательно, что, несмотря на многочисленные попытки почечно-эпителиальной целевой VHL нокаут, ученые не смогли создать почечной аномалии за пределами неопластических кистозных поражений наблюдается у мышей9, даже в сочетании с удалением других супрессоров опухоли, такие как PTEN и p5310. Эти выводы подтверждают идею о том, что потери ВХЛ сами по себе недостаточно для опухоли или последующего спонтанного метастаза.

Недавно наша лаборатория создала новую линию клеток VHL knockout (VHL-KO) с использованием CRISPR/Cas9 опосредованного удаления гена VHL в линии клеток MURINE VHL ' ccRCC (RENCA, или VHL-WT)11,12. Мы показали, что VHL-KO является не только мезенхимальным, но и способствует эпителии к мезенхимального перехода (EMT) вВХЛ-WT клеток12. ИЗВЕСТНО, что EMT играет важную роль в метастатическом процессе13. Наша работа также показала, что отдаленные метастазирование легких происходит только при совместном имплантации в почках вВХЛ-КО и ВХЛ-ВТ, поддерживая кооперативный механизм метастазирования. Важно отметить, что наша ортотопически имплантированная модель VHL-KO и VHL-WT приводит к устойчивым метастазам легких, повторяя клинические случаи ccRCC. Эта спонтанная метастатическая модель ccRCC компенсирует отсутствие трансгенной метастатической мышиной модели, особенно при разработке новых противметастатов. Этот протокол демонстрирует имплантацию почечной капсулы неоднородных клеточных популяций генетически модифицированных клеток RENCA.

Куриные модели CAM имеют долгую историю в исследованиях ангиогенеза и биологии опухоли из-за их многочисленных преимуществ, как обобщено в таблице 114,15,16,17,18. Короче говоря, временное окно для роста опухоли CAM является коротким, что позволяет максимум 11 дней, пока CAM разрушается при вылуплении курицы16. Несмотря на короткое время роста, богатое питание и иммунодефицитное состояние куриного эмбриона позволяют очень эффективно привить опухоль16,19,20,21. Наконец, стоимость каждой оплодотворенной яйцеклетки составляет 1 евро по сравнению с более чем 100 долларами за мышь SCID. Вместе модель CAM может служить ценной альтернативной моделью для животных в создании новых PDX при большой экономии времени и затрат по сравнению с мышью. В этом протоколе мы оценивали, удалось ли модели резюмировать биологию метастатического ccRCC, наблюдаемого в ортотопической модели мыши.

(SCID) МышиКамераПримечание
Стоимость100 долларов США каждый1$1 каждыйВыживаемость от 50-75%
Потребность в барьерном жильеДаНетДальнейшее снижение затрат и упрощение последовательного мониторинга опухолей
Опухоль непосредственно виднаНетДаРисунок 3A
Время для первого прививоки (RENCA)2 недели2-4 дняреф 14, 15
Конечная точка роста (RENCA)3-6 недель10 днейреф 14, 15
Метастаз (RENCA) наблюдаетсяДаДа у цыплятРисунок 3D
Серийные проходыДаДарефери 16-18
Проход к мышам (RENCA)ДаДаHu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019)
Поддержание неоднородности опухолиДаДаHu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019)

Таблица 1: Преимущества и ограничения моделей мыши и CAM. В этой таблице сравниваются две модели по их преимуществам и ограничениям с точки зрения требуемого времени, затрат, труда, а также биологии. Модель CAM имеет преимущества в эффективности, но она также имеет свои собственные уникальные ограничения из-за различных морфологии между птицами и млекопитающими. Поэтому важно подтвердить, что модель может сохранить биологию ксенотрансвантов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC), назначенным как Комитет по исследованиям животных канцлера UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 и ARC 2017-102-01A). Протокол 2002-049-53 оптимизирован для имплантации опухолевых клеток ccRCC в почечную капсулу мышей Nude или BALB/c. Эксперименты по имплантации опухоли в оплодотворенных куриных яйцах до вылупления не требуют одобрения IACUC. Чтобы продлить время для установления метастазиз легких, эмбрионы с опухолью CAM могут вылупляться и расти в кур. Протокол 2017-102-01A охватывает эти эксперименты на животных.

1. Ортотопические исследования опухоли у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Хронология этого эксперимента показана на рисунке 1A. Эти процедуры были адаптированы из предыдущихпубликаций 11,12.

  1. Подготовка одноклеточной подвески для прививки
    1. Отсоедините клетки RENCA VHL-WT и VHL-KO от культурных блюд с помощью трипсина/EDTA.
    2. Подсчитайте клетки гемоцитометром и повторно приготовьте в предварительно охлажденный 1:1 смесь PBS и внеклеточного матричного раствора в концентрации 1 х 105 клеток/ Л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 1:4 клеток VHL-WT:VHL-KO для неоднородных имплантатов и только VHL-WT для однородных имплантатов.
    3. Перенесите переплетемые клетки в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл и держите на льду до имплантации.
  2. Имплантация в почечную капсулу
    1. Анестезия: Разогреть теплую подушечку до 37 градусов по Цельсию и покрыть его куском толстой стерильной драпировки. Анестезия мыши либо изофлуран ингаляции через индукционную камеру или интраперитонеальной (IP) инъекции 1% пентобарбитального натрия в дозировке 10 мл/кг.
    2. Бритье волос из хирургического участка. Этот шаг можно пропустить для обнаженных мышей.
    3. Дезинфекция и хирургическая драпировка: Дезинфекция задней части мыши полностью с повид-йод 3x следуют 70% этанола 1x и протрите его сухим с стерильными ватными тампонами. Затем нанесите три стерильные медицинские повязки последовательно, покрывая всю спину, чтобы создать хирургическое поле, а также обездвижить мышь.
    4. Разрез и экстерьер из почек: Перед операцией продезинфицировать пальцы оператора поидон-йодом или использовать пару стерильных перчаток. Поместите мышь в положение лежа и использовать пальцы, чтобы найти левую почку прямо под левым флангом. Используйте пару тупых щипцы и ножницы, чтобы разрезать кожу открытой и мышечный слой под указанным местом. Используйте стерильные ватные тампоны и щипцы, чтобы частично экстерьеризировать левую почку из живота.
    5. Имплантация опухолевых клеток: Загрузите клеточную подвеску, подготовленную в шаге 1.1 в инсулиновых шприцах или настраиваемых шприцах Гамильтона (см. Таблицу Материалов для спецификаций). Вводят 20 л из подвесных клеток под капсулу почки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная инъекция определяется образованием полупрозрачного выпуклости на поверхности почки. Случайная инъекция в почечную паренхиму приводит к кровотечению и послеоперационной смертности выше 90% из-за смертельного кровоизлияния в месте инъекции.
    6. Медленно вытащите иглу, чтобы внеклеточный матричного раствора затвердеть и предотвратить кровоизлияние или утечку опухолевых клеток. Затем, используя стерильный ватный тампон, нажмите почки обратно в живот.
    7. Рана сшивание: Используйте 5-0 покрытием VICTRYL шов, чтобы сшить мышечный слой. Дезинфицировать кожу с помощью повид-йода один раз и закрыть кожу с раной автоклипов.
    8. Восстановление: Поместите мышь на теплую площадку, пока она не проснется. Если мышь была обезглавлена путем вдыхания, снять изофлуран и держать мышь на теплой площадке, пока он не проснулся.
  3. Биолюминесценция (BLI) и сбор тканей
    1. Через шесть недель после имплантации опухоли, принимать светлячковых основе BLI изображений. Затем эвтаназии мышей с изофлуранинга ингаляции с последующим вывихом шейки матки.
    2. Сбор крови для циркулирующих опухолевых клеток (CTC) обнаружения потока цитометрии.
    3. Урожай опухоли и органов, представляющих интерес (почки, легкие, печень, кишечник и селезенку) с использованием стерильной ткани уборки техники22. Исправить их в 4% параформальдегида на ночь для парафина воска встраивания.

2. CAM опухоли ксенотрансвтат модель

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти процедуры были адаптированы и изменены из ранее опубликованных протоколов23,24. Хронология этой процедуры показана на рисунке 1B. В этой статье представлен только обтекаемый протокол. Для получения подробных протоколов, пожалуйста, обратитесь к другой статье JoVE, опубликованной нашей группой25.

  1. Преинкубация: Инкубировать свежеотложенные, оплодотворенные куриные яйца в вращающемся яичном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и влажности 55-65% в течение 7 дней.
  2. Бросьте CAM и открытое окно (день развития 7):
    1. Найдите и пометьте воздушный мешок и вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 10-15% яйцеклеток удаляются, потому что они либо не оплодотворены, либо умирают в течение 7 дней после оплодотворения.
    2. Создайте новый воздушный мешок поверх отмеченной вены.
    3. Разграничить новый воздушный мешок, нанесите упаковочная ленту и положите яйца обратно в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть приостановлена здесь. Рекомендуется возобновить процедуры в течение того же дня, потому что воздушный мешок может двигаться.
    4. Откройте окно: Используя пару изогнутых микрорассечения ножницы и пару иглонононононов щипцы, вырезать 1,5 х 1,5 см круглое окно в оболочке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нарушение CAM указывается кровью и кусок CAM настоящее время на разрезе оболочки кусок.
    5. Запечатать отверстие прозрачной медицинской заправкой и поместить яйца в стационарный инкубатор при 37 градусах Цельсия и влажности 55%-65%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тот же инкубатор яйца, что и в шаге 2.1. Выключите ротатор, чтобы сделать его неподвижным.
  3. Проверка здоровья (день развития 9): Удалить мертвые яйца, а затем случайно группировать остальные яйца для имплантации опухолевых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, выживаемость на данный момент составляет около 80% от развития день 0.
  4. Прививка опухолевых клеток на недавно открытый CAM (день развития 10)
    1. Разбавить внеклеточный матричного раствора в два раза больше объема предварительно охлажденных RPMI 1640 (с L-глютамина). Отсоедините клетки RENCA и повторно приостановите в вышеуказанном растворе, чтобы достичь концентрации 2 х 104 ячеек/Зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 1:1 клеток VHL-WT:VHL-KO для неоднородных имплантатов и только VHL-WT для однородной имплантации.
    2. Чтобы предукрепить суспензию клеток, заполните 100 кЛ каждой клеточной смеси в 200 наконечниках пипетки и поместите их в клеточный инкубатор в течение 15 минут.
    3. Имплантировать 100 зл клеточной подвески для каждого яйца на поверхности CAM через окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые протоколы требуют царапин CAM до имплантации23. Это не обязательно для клеток RENCA, потому что они растут очень быстро.
  5. Выращивайте клетки на CAM в течение 10 дней и фотографируйте каждые 2 дня.
  6. Эвтанизировать и собирать опухоль, кровь и органы.
    1. В день развития 20 (опухолевый день 10), собирать кровь через хориоаллантоической вены с гепарина 10 мл шприца.
    2. Эвтанизировать эмбрионы, поставив их на лед в течение 15 минут.
    3. Урожай и взвешивание опухолей. Вскрыть легкие и печень с помощью стерильной ткани уборки техники, аналогичной той, которая используется для мышей22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Куры печени имеют две доли, которые являются первыми органами видели в брюшной полости. Не путайте их с легкими. Куриные легкие расположены под сердцем и перегородкой26. Успешная коллекция легких может быть подтверждена открытыми ребрами.
    4. Исправить опухоли и вскрытые органы в 4% параформальдегида ночь для парафина воска встраивания.
  7. Выщелачить цыплят.
    1. Чтобы обеспечить длительный период роста опухоли, продолжайте инкубацию в течение 21 дня и позвольте цыплятам вылупиться при 37 градусах Цельсия и не менее 60% влажности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Куры естественно люк после 21-го дня в течение 24 ч период времени, но иногда возникают проблемы штриховки сами по себе. В этом случае, растрескивание яичной скорлупы некоторые помогает. Важно для цыплят, чтобы завершить процесс вылупления в течение 24 ч, потому что они умрут от недостатка питательных веществ после этого.
    2. Выращивайте кур на животноводческой ферме (2017-102-01A) в течение 2 недель.
    3. На развитие 34 (опухоль день 24), эвтаназии птенцов с изофлуранинга с последующим вывихом шейки матки.
    4. Вскрыть легкие с помощью стерильной ткани уборки техники, аналогичной тем, которые используются для мышей22. Затем, исправить их в 4% параформальдегида на ночь для парафина воска встраивания.

3. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Все ткани секции и Н И E окрашивания было сделано в лаборатории translational патологии Core (TPCL) в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес.

  1. Выпекать слайды при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 20 минут и депарафинизировать 3x с помощью ксилена и регидратировать последовательно от 100% этанола до воды.
  2. Извлекайте антигены в цитратном буфере, варящемся в овощном пароходе в течение 25 мин.
  3. Применить 1% BSA для блокировки. Затем нанесите первичные антитела (анти-VHL, anti-HA, anti-flag) подготовленные на коэффициенте разбавления 1:200 в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  4. После мытья 3x с TBST (7 мин каждый), инкубировать слайды со вторичным антителом в 1:200 разбавления. Вымойте 3x с TBST (7 мин каждый) и применять DAB реагентов следуют гематоксилин контрпотирования.

4. Цитометрия потока

  1. Обработайте мышь или куриную кровь с помощью буфера лиза из красных кровяных телец (РБК) в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно елизирбкя РБК особенно важно при анализе крови CAM, потому что куриные РБК нуклеитные и не могут быть легко различимы в цитометрии потока с помощью переднего и бокового рассеяния.
  2. Запустите цитометрию потока на лицей крови и проанализируйте данные для выражения mStrawberry и EGFP.
  3. Установите основные ворота на основе переднего и бокового рассеяния, исключая мусор, мертвые клетки и неизлёзовые РБК.
  4. Установите флуоресценцию ворота на основе неокрашенных образцов и одного окрашенных элементов управления. Используйте анализ крови, загрунтованный с VHL-WT, VHL-KO, или немаркированные клетки RENCA в качестве одного окрашенных элементов управления и неокрашенных элементов управления, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Каждый эксперимент был выполнен по крайней мере в 3 x, если не указано иное. Данные представлены в виде среднего стандартного отклонения (SD). Значение определялось парным, Студенческим Т-тестом, когда было две группы или односторонней ANOVA, когда было три или более групп. Для установления значимости использовалось отсечку p-значения 0,05.

Ортотопически имплантированные клетки RENCA успешно росли на мышах почек, что подтверждае...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для многих пациентов с эпителиальными злокачественными новообразованиями метастазы в жизненно важные органы являются основной причиной смертности. Поэтому необходимо найти основной механизм и новый путь терапии метастатических заболеваний. К сожалению, не хватает соответствующих метастатических моделей животных ccRCC. Задача в значительной степени связано с невозможностью воссоздать ccRCC у мышей, несмотря на поколение многочисленных трансгенных почек эпителия-ориентированных Моделей выкидок вымыv VHLмы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована за счет гранта UCLA JCCC семян, UCLA 3R грант, UCLA CTSI, и UC TRDRP (LW). Мы благодарим Доклинический Центр визуализации Института Крамп, TPCL и отдел лабораторной медицины для животных Калифорнийского университета (DLAM) за помощь в экспериментальных методах. Поток цитометрии была выполнена в UCLA Джонсон Всеобъемлющий онкологический центр (JCCC) и Центр по исследованию СПИДа поток цитометрии Основной фонд, который поддерживается Национальными институтами здравоохранения награды P30 CA016042 и 5P30 AI028697, а также JCCC, UCLA Институт СПИДа, Дэвид Геффен школы медицины в Калифорнийском университете, UCLA канцлера. Статистические консультации и услуги анализа данных были предоставлены UCLA CTSI биостатистика, эпидемиология, и научно-исследовательский дизайн (BERD) Программа, которая поддерживается NIH / Национальный центр по продвижению трансляционной науки UCLA CTSI Грант номер UL1TR001881.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсина, 0,1% ЭДТА в HBSS без кальция, магния и бикарбоната натрияCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N/18
антитело против VHLAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 Инсулиновые шприцыBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Использование и PrecisionGlide иглы для подкожных инъекцийFisher Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-люциферин Firefly, соль калияGoldbioLUCK-1G
DPBS без кальция и магнияGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Моноклональное антитело (FG4R)eBioscience14-6681-82
цилиндрамиэтанола 200 proof43196-11Приготовление 70% в воде
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, одобренная Министерством сельского хозяйства США регионыFisher Scientific10-437-028
Остроконечные ножницы для препарированияFisherbrand Fisher Scientific08-940
Стерильные ватные шарики Fisherbrand FisherScientific22-456-885
FisherbrandВысокоточный прямой конический пинцет/щипцы для ультратонкой точкиFisher Scientific12-000-122
Микроцентрифужные пробирки FisherbrandPremium: 1,5 млFisher Scientific05-408-129
формальдегида, 4%, буферный, pH 6,9 (около 10% раствора формалина), для гистологииMilliporeSigma1.00496.5000
Шприц Hamilton по индивидуальному заказуHamilton8040825 µ L, Модель 702 SN, Калибр: 30, Тип точки: 4, Угол: 30, Длина иглы: 17 мм
HA-зонд Антитело (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
ГемоцитометрHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Инкубатор Комбо НаборИнкубатор СкладHB1588D
Изотезия (Изофлуран) растворHenry Schein Animal Health1169567762
Система визуализации IVIS Lumina II in vivoPerkin Elmer
Matrigel GFR Мембранная матрицаCorningC354230
Medline Хирургическая драпировка для инструмента, прозрачный клей, 24" x 18"Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Фракция V [Бычья сыворотка альбумин] Изоляция от теплового шокаMilliporeSigma2910-25GM
Пенициллин-стрептомицин Соллюция, 100X, 10 000 МЕ Пенициллин, 10 000 мкг/мл стрептомицинFisher ScientificMT-30-002-CI
Пентобарбитал натрияSigma Aldrich57-33-0Получить 1% в физиологическом
растворе пероксидазу AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Пероксидаза AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Раствор повидона-йода USP, 10% (w/v), 1% (w/v) доступный йод, для лабораторного использованияRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromycin dihydrochloride гидрат, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X с L-глутаминомCorning10040CV
Scientific 96-луночные пластины без юбки, низкопрофильныеFisher ScientificAB-0700
SHARP, для P-200, 200 и микро; l, 960 (10 стоек по 96)Thomas Scientific1159M40
Транспортировочная лента, многоцелевая, 1,89" x 109,4 ярда, коричневый, упаковка из 6 рулоновOffice Depot220717
шовный материалEthiconJ385H
Tegaderm Прозрачная повязка Оригинальный стиль рамы 2 3/8" x 2 3/4"Moore Medical1634
Термо-куриная подогреваемая прокладкаK& H manufacturing1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 стенка (50 футов)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9-опосредованный нокаут VHL, затем лентивирально меченный EGFP с флажковой маркировкой и люциферазой светлячка
VHL-WTлентивирально меченный флуоресцентным белком mStrawberry с маркировкой HA и люциферазой
светлячкаWorld Precision Instrument ЩИПЦЫ IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Набор автозажимов для ранBraintree scientific, inc.АСУ КИТ
Ксилолы (гистологические), Фишер ХимикФишер СайентификХ3С-4
555899Управление раствор прецизионные барьерные наконечники

Ссылки

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VHLCRISPR

Похожие статьи