Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60323

⸱

31 октября 2019 г.

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование описывает микроскопический мониторинг пневмококка соблюдения фон Willebrand фактор строки, производимые на поверхности дифференцированных человеческих первичных эндотелиальных клеток под сдвига стресс в определенных условиях потока. Этот протокол может быть расширен до детальной визуализации конкретных клеточных структур и количественной оценки бактерий путем применения дифференциальных иммуностоинных процедур.

Аннотация

Взаимодействие стрептококковой пневмонии с поверхностью эндотелиальных клеток опосредовано в кровотоке через механочувствительные белки, такие как фактор фон Виллебранд (VWF). Этот гликопротеин изменяет свою молекулярную конформацию в ответ на стресс сдвига, тем самым подвергая обязательные участки для широкого спектра взаимодействий хозяина-лигада. В целом, культивирование первичных эндотелиальных клеток под определенным потоком сдвига, как известно, способствует специфической клеточной дифференциации и образованию стабильного и тесно связанного эндотелиального слоя, напоминающего физиологию внутренней слизистой оболочки кровеносных сосудов . Таким образом, функциональный анализ взаимодействий между бактериальными патогенами и сосудами-хозяевами с использованием механочувствительных белков требует создания насосных систем, которые могут имитировать физиологические силы потока, которые, как известно, влияют на поверхность сосудистых клеток.

Микрофлюидическое устройство, используемое в данном исследовании, обеспечивает непрерывную и бесприсрадаемую рециркуляцию жидкостей с определенной скоростью потока. Компьютерная система насоса воздушного давления применяет определенный стресс сдвига на эндотелиальных поверхностях клеток, генерируя непрерывный, однонаправленный и контролируемый средний поток. Морфологические изменения клеток и бактериальной привязанности могут микроскопически контролироваться и количественно в потоке с помощью специальных слайдов канала, которые предназначены для микроскопической визуализации. В отличие от инфекции культуры статических клеток, которая в целом требует фиксации образца до иммунной маркировки и микроскопических анализов, микрофлюидные слайды позволяют как флуоресценции на основе обнаружения белков, бактерий и клеточных компонентов после фиксации образца; серийное окрашивание иммунофлуоресценции; и прямое обнаружение на основе флуоресценции в режиме реального времени. В сочетании с флуоресцентными бактериями и специфическими флуоресценцией помечены антитела, эта процедура инфекции обеспечивает эффективную систему визуализации нескольких компонентов для огромного спектра научных приложений, связанных с сосудистыми процессами.

Введение

Патогенез пневмококковых инфекций характеризуется многогранным взаимодействием с разнообразием внеклеточных матричных соединений и компонентов гемостаза человека, таких как плазминоген и VWF1, 3,4,5,6,7,8. Мультидоменглиновая гликопротеина VWF служит ключевым регулятором сбалансированного гемостаза путем посредничества в наборе тромбоцитов и инкорпорации фибрина в месте образования сосудистого тромба9. Важность функционального, активного VWF для контроля кровотечения и заживления ран демонстрируетболезнь фон Виллебранд, распространенное наследственное кровотечение10.

Глобулярный VWF циркулирует в крови человека в концентрации до 14,0 мкг/мл11,10. В ответ на сосудистые травмы, локальный выпуск VWF эндотелиальных тел Вейбель Паладе (WBP) заметно увеличилось11,12. Предыдущие исследования показывают, что пневмококк приверженность человека эндотелиальных клеток и его производство порообразующего токсина пневмолиза значительно стимулирует светлую секрецию VWF13. Гидродинамические силы кровотока вызывают структурное открытие механоответственных доменов VWF. При норме потока 10 dyn/cm2 VWF мультимеризирует до длинных белковых струн длиной до нескольких сотен микрометров, которые остаются прикрепленными к субэндотелию10,12.

Чтобы понять функцию мультимеризированных струн VWF, генерируемых при стрессе сдвига при взаимодействии пневмококка с эндотелиальной поверхностью, был создан микрофлюидный подход к клеточной культуре. Использовалось микрофлюидное устройство с программно-управляемой системой насоса воздушного давления. Это позволило непрерывно, однонаправленное рециркуляции среды клеточной культуры с определенной скоростью потока. Таким образом, система применила определенный стресс сдвига на поверхности эндотелиальных клеток, которые оставались прикрепленными внутри специализированных слайдов канала. Этот подход позволил смоделировать силу сдвига в крови сосудистой системы человека, в которой строки VWF генерируются на дифференцированных эндотелиальных клетках при определенных постоянных условиях потока. Для этого эндотелиальные клетки культивировались в конкретных слайдах канала (см. Таблица материалов),которые были адаптированы для микроскопических анализов во время потока. Микрофлюидная насосная система обеспечивала высокоопределенную и контролируемую стрессовую ситуацию, необходимую для формирования расширенных струн VWF на сливочного эндотелиального клеточного слоя. После стимуляции VWF-секретации конфлентически выращенных человеческих пупочных клеток вены (HUVEC) гистаминовой добавкой, образование строки было вызвано применением сдвига стресс (я) 10 dyn/cm2. Стресс сдвига определяется как сила, действующая на клеточном слое. Он рассчитывается примерно в соответствии с Корниш и т.д. al.14 с уравнением 1:
figure-introduction-1

В тех случаях, когда стресс сдвига в dyn/cm2, вязкость в (dyn)/cm2, h q half of высота канала, w й половина ширины канала, и й s flowrate в mL/min.

Результат уравнения 1 зависит от различных высот и ширины различных используемых слайдов (см. Таблица материалов). В этом исследовании был использован слайд канала Luer в 0,4 мкм, в результате чего коэффициент камерного слайда составил 131,6 (см. формулу 2).
figure-introduction-2

Вискозность среды при 37 градусах Цельсия составляет 0,0072 дина/см2 и использовался стресс сдвига 10 dyn/cm2. Это привело к скорости потока 10,5 мл/мин (см. формулу 3).
figure-introduction-3

Здесь подробно описана адаптация и продвижение процедуры культивирования микрофлюидных клеток с использованием однонаправленной системы ламинара для исследования и визуализации механизмов бактериальной инфекции в сосудистой системе хозяина. Поколение строк VWF на эндотелиальных слоях также может быть стимулировано с помощью других насосных систем, которые способны применять непрерывный и устойчивый стресс сдвига15.

После культивирования первичных эндотелиальных клеток для слияния в потоке и стимуляции формирования струнных VWF, пневмококки, выражающие красный флуоресценционный белок (RFP)16 были добавлены в эндотелиальный клеточный слой под постоянным микроскопическим контролем. Привязка бактерий к струнам VWF на поверхности эндотелиальных клеток была микроскопически визуализирована и контролироваться в течение трех часов в режиме реального времени с помощью флуоресцентных антител, маркированных VWF. При таком подходе, роль VWF как кофактор адгезии содействия бактериальной привязанности к сосудистому эндотелия была определена8.

В дополнение к микроскопической визуализации секреции белка и конформационных изменений, этот метод может быть использован для мониторинга отдельных шагов процессов бактериальной инфекции в режиме реального времени и количественное количество прикрепленных бактерий в разных точках времени Инфекции. Специфическая система насоса, управляемая программным обеспечением, также обеспечивает возможность культуры эндотелиальных ячеек в определенных условиях постоянного потока на срок до нескольких дней и обеспечивает определенную инкубацию импульсного среднего потока. Кроме того, этот метод может быть применен с использованием различных типов клеток. Адаптация протокола окрашивания также позволяет обнаруживать и визуализировать бактерии, интернализированные в эукариотические клетки.

Данная рукопись описывает этот передовой экспериментальный протокол, который может быть использован в качестве определенного, надежного и воспроизводимого подхода для эффективной и универсальной характеристики патофизиологических процессов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Микрофлюидная культивация клеток осуществлялась с помощью коммерческих первичных эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVEC). Компания изолировала клетки с информированным согласием донора. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Doctors Chamber федеративного государства Баден-Вюртемберг с номером 219-04.

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу материалов для протокола поставок.

1. Предкультивация первичных эндотелиальных клеток

  1. Оттепель замороженный глицерол флакон, содержащий 1 х 105 первичных HUVEC от трех различных доноров мягко при 37 градусов по Цельсию и семян клеток в 7 мл предварительно прогретых эндотелиальных клеток среды роста (ECGM, готовы к использованию с добавками) в 25 см2 клеточной колбы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные эндотелиальные клетки теряют способность дифференциации после более чем 5 циклов распространения. Таким образом, только клетки с менее чем 5 проходов могут быть использованы, если высокие оценки дифференциации клеток не требуется.
  2. Культивировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере CO2 5% в течение 60 минут, чтобы позволить поверхностное крепление и обменять среду культуры клеток ECGM, чтобы избавиться от остатков от криоконсервации.
  3. Продолжайте культивировать клетки при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2 до тех пор, пока они не образуют подковорный слой клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HUVEC не должен расти до сливаемого слоя, так как плотные контакты клеток предотвращают образование стабильного клеточного слоя позже в потоке.

2. Прекультация стрептококковой пневмонии

ВНИМАНИЕ: Streptococcus пневмонии является биобезопасности уровня 2 агента и разрешается культивироватьтолько только в биобезопасности уровня 2 лабораторий. Используйте чистую скамейку, классифицированную для безопасности уровня 2 для всех бактериальных процедур, строго избегайте образования аэрозолей и используйте центрифугу с защитой аэрозолей для отложений бактерий.

  1. Прививать Колумбийской крови агар пластины с Streptococcus пневмонии клинической изоляции ATCC11733, полученных из глицерола запасопостоянно хранится при -80 градусов по Цельсию и культивировать агар пластины на ночь при 37 КК и 5% CO2.
  2. Приготовьте 40 мл жидкого бульона Тодда Хьюитта, дополненного 1% дрожжевой экстрактом (THY) и 15 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS) pH 7.4, для выращивания бактерий и стирки.
  3. Используйте стерильную трубку для выращивания бактерий и привить бульон жидкой культуры с бактериальной массой. Контролируйте количество прививки с помощью фотометрического измерения 1 мл aliquots на 600 нм против непривитого жидкого бульона в качестве эталона. Заполните бактериальную массу в жидкий бульон, пока он не достигнет оптической плотности на 600 нм (OD600) 0,15.
  4. Инкубировать привитый жидкий бульон без тряски при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 и определить OD600 каждые 30 минут, измеряя 1 мл аликвотсов с помощью пластиковых кювет.
  5. Как только бактериальная культура достигла OD600 0.4, что соответствует экспоненциальной фазе роста, центрифуга бактериальной культуры подвески в течение 10 минут при 1000 х г при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте пневмококковой культуры достичь OD600 из более чем 1,0, потому что высокая плотность культуры пневмококка, как известно, вызывают бактериальный автолиз, который может повлиять на общую бактериальную пригодность.
  6. Отрежь бактериальный осадок мягко с 10 мл PBS и осадки снова в течение 10 минут на 1000 х г на RT.
  7. Отрежь промытый бактериальный осадок мягко в 1 мл PBS и определить OD600 из 10 л бактериальной суспензии с использованием 1 мл PBS в качестве эталона.
  8. Отрегулируйте количество бактерий в PBS до OD600 из 2.0. Согласно ранее определяемым бактериальным подсчетам, OD600 из 2.0 соответствует 2 x 109 единицам колонии (CFU). Немедленно приступаем к инфекционной процедуре для профилактики бактериального аутолиза.

3. Эндотелиальная клеточная культивация HUVEC в микрофлюидных условиях

  1. Отсоедините первичные эндотелиальные клетки от колбы клеточной культуры контролируемым протеолиза. Выполните следующие шаги в стерильной среде с помощью чистой скамейки. Подготовьте объем 15 мл стерильных PBS для стирки.
    1. Удалите ECGM из подковотенно выращенного слоя HUVEC и промойте слой клетки с помощью серологического пипетки, чтобы избавиться от среды клеточной культуры.
    2. Инкубировать промытый HUVEC с 3 мл 37 C преронный раствор диссоциации клеток для отслоения клеток в течение 5 минут при 37 градусах Цельсия. Наблюдайте за отрядом протеолитических клеток с помощью микроскопического мониторинга каждую минуту.
    3. Pipette отдельной подвески клетки в трубку, содержащую 7 мл ECGM дополнены 2% плода икроножной сыворотки (FCS) для остановки протеолиза и осадка клеток в течение 3 мин при 220 х г на RT.
    4. Удалите супернатант и повторно ездовые HUVEC в 250 Зл ЭКГМ дополнен 5% FCS и 1 mM MgSO4. Используйте 10 qL суспензии клетки для подсчета клеток с помощью камеры подсчета клеток Neubauer и настроить количество клеток до 4 х 106 ячеек/мЛ ECGM дополнены 5% FCS и 1 mM MgSO4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента потока потребуется 30 мл среды ECGM, дополненной 5% FCS и с 1 мМ MgSO4. Отсюда на этой средней композиции называется ECGMS-средний. Увеличение концентрации FCS в среде культуры от 2% до 5% поддерживает вложение клеток и жизнеспособность клеток HUVEC, посеянных в слайде канала. Средние добавки FCS и MgSO4 существенно стабилизируют клеточное крепление HUVEC в условиях сдвига стресса.
  2. Семена и культивировать HUVEC в слайде канала. Работайте в стерильной среде с помощью чистой скамейки. Клетки будут культивироваться под напряжением сдвига в течение 2 дней, а затем инфекции с бактериями и микроскопического мониторинга еще 2 ч.
    1. Уравновесить слайд канала, перфузии установить 1,6 мм в диаметре и 50 см в длину, aliquot ECGMS-средний, и Луер канал слайд 0,4 мкм в высоту, для 24 ч в инкубаторе с 5% CO2 атмосферы при 37 градусов по Цельсию, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура рекомендуется дегазировать пластиковое оборудование и предварительно разогреть среду, перфузионные трубки и резервуары. Если материалы или жидкости хранились на РТ или в холодильнике, газы, растворенные в пластике и жидкостях, будут выделяться при нагревании в инкубаторе во время эксперимента. Затем появятся пузырьки газа. Дегазации всех пластиковых компонентов до эксперимента устранит этот эффект. Каждый раз, когда система вынимся из инкубатора, процесс поглощения газа начинается снова. Таким образом, работать быстро на RT и никогда не оставляйте жидкости блок за пределами инкубатора в течение более длительных периодов времени.
    2. Используйте пипетку для введения 100 л стерильной фильтрованного свиного желатина в растворе PBS в один из резервуаров переживаемого скольжения канала. Инкубировать желатин-раствор на 1 ч при 37 градусах Цельсия и промыть канал слайда 1 мл PBS в стерильных условиях с помощью шприца 1 мл Luer.
    3. Поместите слайд канала с покрытием желатина на тонкой полистирола или пенополистирола пластины, чтобы предотвратить падение температуры слайда. Добавьте в слайд 100 qL из подвески 4 x10 6/мЛ HUVEC с шприцем 1 мл Luer.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение слайда канала на холодной металлической поверхности чистой скамейки может снизить температуру слайда дно, тем самым генерируя холодный стресс эндотелиальных клеток. Во время клеточной трубы удерживайте слайд немного вверх, чтобы пузырьки воздуха поднимались и исчезали изнутри слайда.
    4. Инкубировать слайд канала с HUVEC в течение 60 минут при 37 КС и 5% CO2 и заполнить средние резервуары на обоих концах слайда канала с 60 QL ECGMS-средний каждый. Инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
  3. Отрегулируйте микрофлюидный насос и настройки программного обеспечения.
    1. Подключите уравновешиваете перфузионный набор к насосному агрегату, заполните 13,6 мл ECGMS-среднего, и запустите программное обеспечение для управления насосом. Выберите адекватный набор перфузии и тип камерной слайда, используя окна прокрутки вниз в меню настроенного жидкого блока. Выберите 0.007 (dyn's/cm2)в программном обеспечении для средней вязкости. (Обратитесь к настройкам программного обеспечения насоса давления, отмеченным красными стрелками на дополнительной рисунке 1).
    2. Вне инкубатора соедините стеклянную бутылку, наполненную сушкой кремнезема, к трубам давления воздуха (см. Рисунок 1, Всет 3). Воздух насоса давления циркулирует между резервуарами перфузии и насосом и должен быть сухим перед повторного входом в насосное устройство. Выберите Параметры потока в меню программного обеспечения, установите давление до 40 мбар, и промойте трубки насоса с жидкой средой, запустив непрерывный средний поток. (Эти настройки также указаны красными стрелками на дополнительной рисунке 1).
    3. Программа желаемого сдвига циклов стресса культивирования потока. Начните с 5 dyn/cm2, контролировать сбалансированный резервуар pumpinng и заверить, что никакие пузырьки воздуха циркулируют в насосной системе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение стены сдвига в слайде канала зависит от скорости потока и вязкости перфузионной среды. При использовании другой насосной системы, пожалуйста, обратитесь к уравнениям, описанным во введении, чтобы установить скорость потока генерации желаемого уровня стресса сдвига. Описанные параметры соответствуют скорости потока 5,42 мл/мин. (Примерный снимок экрана, показывающий адекватные параметры потока в программном обеспечении насоса давления показано на дополнительной рисунке 2).
    4. Остановите циркуляцию потока в программном обеспечении управления насосом и удерживайте средний поток в перфузионных трубках, зажимая трубки вблизи соединений Luer. Подключите слайд канала, тем самым избегая пузырьков воздуха, и поместите жидкости единицы с подключенным каналом слайд в CO2 инкубатора на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Начните стресс сдвига на 5 dyn/cm2 в течение 30 минут, чтобы плавно адаптировать клетки к силам, генерируемым стрессом сдвига, прежде чем ускорять уровень стресса сдвига (см. Дополнительная рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы пузырьки воздуха не остались в системе трубки или в слайде после подключения к трубной системе, потому что движение пузырьков воздуха в потоке может привести к отслоению клеток.
    5. Ускорьте напряжение сдвига до 10 dyn/cm2 (которые соответствуют 10.86 mL/min в этой установке потока) и инкубировать скольжение канала в непрерывном усилии сдвига для 48 h в малом инкубаторе CO2 при 37 C и 5% CO2 для того чтобы позволить дифференциацию клетки ( соответствующее программное обеспечение settinngs указаны с красными стрелками в дополнительной рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HUVEC, как правило, отсоединяются от поверхности канала, если культивирование потока непосредственно начинается на 10 dyn/cm2. Клетки остают прикрепленными к поверхности камеры если культивирование потока начато с более менее усилием сдвига используя 5 dyn/cm2 на минимум 30 min после дова с последующим увеличивая усилие сдвига медленно до пожеланных 10 dyn/cm2. Напряжение сдвига 10 dyn/cm2 является минимальным значением в этой настройке перфузии, необходимой для формирования строкИ VWF.
    6. После 24 ч микрофлюидных культивирования клеток, остановить средний поток с программным обеспечением управления насосом именно тогда, когда сбалансированный средний уровень достигается в обоих средних резервуаров. Поместите жидкостное устройство в чистую скамейку и удалите 10 мл циркулирующей среды выращивания перфузийных резервуаров с помощью серологического пипетки размером 10 мл. Добавьте 10 мл ECGMS-medium в резервуары, чтобы обновить среду, поместите жидкостной блок обратно в инкубатор CO2 при 37-C и 5% CO2,и перезапустите культивирование жидкости с помощью программного обеспечения для управления насосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция насоса давления может быть внезапно нарушена лабораторными машинами, такими как крупные центрифуги, которые могут создать сильное возмущение магнитного поля. Это внезапное нарушение может привести к отслоению клеток. Позаботьтесь о том, чтобы такие машины не были активны вблизи насоса давления во время эксперимента.
    7. Начните предощение температурной инкубационной камеры, покрывающей стадию флуоресцентного микроскопа до 37 градусов по Цельсию для уравновешенности температуры 24 ч до микроскопической визуализации. После того, как микроскоп предварительно разогрет, начните управление программным обеспечением микроскопа и отрегулируйте основные настройки для микроскопического мониторинга флуоресценции, выбрав соответствующие настройки фильтра (540 нм/590 нм для обнаружения бактерий, выражающих RFP и 470 нм/515 нм для обнаружения флуоресцентных выбросов антител, конъюгированных VWF). Предопрогрейте дополнительную отопительную камеру для инкубации жидкого блока при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анализа инфекции и микроскопического мониторинга температуры слайда канала и циркулирующей среды не должно существенно уменьшаться, так как это будет генерировать холодную нагрузку на клетки. В целом, размер температурных камер, покрывающих стадию микроскопа, недостаточен для покрытия всего жидкого блока. Поэтому рекомендуется использовать дополнительную отопительную камеру, предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию.
    8. Для микроскопической визуализации поместите жидкостную единицу в 37-C предварительно разогретую нагревательную камеру и поместите слайд канала на стадию предтеплого микроскопа 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для микроскопической визуализации, жидкости единицы и слайд канала должны быть удалены из инкубатора CO2 из-за ограниченной длины перфузионных труб. Если время заражения и микроскопический мониторинг длиной более 180 мин требуется за пределами 5% CO2 атмосферы для pH буферизации, рН-буферизированной среды должны быть использованы для микрофлюидирования культивирования.
    9. Контролируйте морфологию клеток и целостность слоя HUVEC до введения гистамина и бактерий в циркуляцию потока на протяжении всего времени эксперимента по течению и после окончания эксперимента по течению с помощью яркого полевого режима микроскопа.

4. Индукция VWF-релиз а визуализация мультимеризованных струн VWF

  1. Поддерживайте настройки потока, потому что напряжение сдвига 10 dyn/cm2 необходимо для того чтобы вызвать multimerization VWF к длинним шнурам up to 200 MDa. Побудить выпуск VWF из эндотелиальной WPB путем введения 136 Л гистаминового стока 100 мМ в ECGMS-средний, циркулирующих в перфузионных труб ахсеях с помощью порта инъекций. Окончательная концентрация гистамина в плавающей среде составит 1 мМ. Если нет порта инъекций, гистамин может быть добавлен альтернативно путем pipetting в среду резервуаров насоса.
  2. Для обнаружения иммунофлуоресценции мультимеризированных струн VWF, остановить поток, когда сбалансированный средний уровень в резервуарах достигается, и вводить 20 мкг VWF-специфических FITC-конъюгированных антител в объеме 200 ЛЛ PBS (pH 7.4) в циркулирующих 13,6 мл ECGMS-средний с использованием порта впрыска. Если нет порта инъекций, антитела могут быть добавлены альтернативно путем pipetting в среду резервуаров насоса. Это приводит к окончательной концентрации антител 1,3 мкг/мл.
  3. Для микроскопического сканирования нескольких полей зрения в течение короткого времени используйте флуоресценцию микроскопа с устройством флуоресценции Ксенона мощностью 30% и эпифлуоресценцией. Мониторинг формы и морфологии слоя HUVEC с помощью режима яркого поля для выбора репрезентативных ячеек, подходящих для визуализации VWF-строк.
  4. Для визуализации зеленых флуоресцентных строк VWF выберите цель масла 63x/1.40 и фильтр обнаружения 470 нм в меню флуоресценции программного обеспечения микроскопа (LasX). Создавайте снимки стекол, по крайней мере, 50 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит приблизительно 10 морфологически нетронутых HUVEC. Для количественной оценки зеленых флуоресцентных строк VWF в разных точках времени, сканирование нескольких полей зрения.

5. Микроскопическая оценка бактериальной привязанности к VWF-струнам в потоке в режиме реального времени

  1. Количественное пневмококкическое крепление к струнам VWF, генерируемым на поверхностях клеток HUVEC с помощью обнаружения иммунофлюоресценции.
    1. Держите поток и впрысните 1,35 x 108 CFU/mL RFP-expressing пневмококки в максимальном объеме 1 мл в ECGMS-среду с помощью порта инъекций. Кроме того, пипетка бактерий в среду в резервуаре насоса. Перезапустите напряжение сдвига на 10 dyn/cm2 для того чтобы позволить бактериям распространить внутри системы насоса.
    2. Выберите цель погружения масла 63x для увеличения микроскопа и отрегулируйте настройки флуоресценционного фильтра в программном обеспечении микроскопа к RFP-каналу (540 нм фильтр обнаружения) для обнаружения пневмококки RFP.
    3. Для количественной оценки бактериальной привязанности к струнам VWF, остановить поток и создать снимки, по крайней мере 30 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит около 10 морфологически нетронутыми HUVEC, и подсчитать количество пневмококков.
    4. Для оценки данных используйте алгоритм однофакторной статистики ANOVA, за которым следует пост-специальный двуххвостый неспаренный выборочный тест для детального статистического сравнения. Значения P lt;0.05 были сочтены статистически значимыми.

6. Микроскопическая оценка бактериальной привязанности к VWF-струнам после фиксации образца

  1. Пробуйте фиксацию до окрашивания иммунофлюоресценции.
    1. Остановите поток, удалите 10 мл ECGMS-medium из резервуаров насоса и добавьте 10 мл PBS, дополненного 5% параформальдегидом (PFA). Пусть раствор PFA циркулирует в течение 10 мин при стрессе сдвига 10 dyn/cm2.
    2. Отключите слайд канала от насосного блока.
  2. Блокируйте неспецифические узлы на поверхности клетки и выполняйте иммунообнаружение струнных VWF и прикрепленных бактерий.
    1. Приготовьте 4 мл стирального раствора, содержащего 100 мМ Na2CO3 (pH 9.2), дополненного 4% сахарозой для всех стирки. Подготовьте 1 мл блокирующего раствора, содержащего 100 мМ Na2CO3 (pH 9.2), дополненного 4% сахарозой и 2% бычьего сывороточных альбумина (BSA) для блокировки неспецифических связывающих сайтов.
    2. Вымойте PFA-инкубатор слайд 3x с помощью 1 мл Luer шприц вводить 200 л стирального раствора и инкубировать слайд в течение 120 минут на RT с 200 л блокирующего раствора.
    3. Приготовьте 4 мл другого блокирующего раствора, содержащего 100 мМ Na2CO3, (pH 9.2) дополненный 4% сахарозой и 0,5% BSA для разбавления антител. Используйте 200 зл этого блокирующего раствора, чтобы разбавить пневмококк-специфический кроличья антисыворотку 1:100. Используйте 200 qL этого блокирующего раствора, чтобы разбавить антитела для мыши, специфичную для VWF, чтобы сделать концентрацию антител, специфичную для VWF, в 4 мкг/мл. Разбавить AlexaFluor488-конъюгированные вторичные антитела из 2 мг/мл бульонного раствора 1:100 в 200 л PBS (pH 7.4) для получения конечной концентрации 20 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных параметрах иммунофлуоресценции обнаружение антител дает оптимальные результаты, когда антитела были разбавлены в вышеупомянутом щелочном карбонатном буфере. На основе предыдущих результатов, рекомендуемые блокирующие решения и количество антител подходят для многих приложений. Однако различные эксперименты могут потребовать индивидуальной оптимизации комбинации антител, концентрации антител, времени инкубации и конституции блокирующего буфера. В качестве альтернативы может быть подходящей или даже предпочтительной в качестве инкубационного буфера фосфатно-буферная система с нейтральным диапазоном рН. В случае слабых сигналов флуоресценции, концентрация вторичных антител должна быть увеличена. При обнаружении слишком большого количества неспецифического фонового шума флуоресценции следует увеличивать количество блокирующих веществ.
    4. Для VWF-иммунофлуоресценции окрашивания, мыть слайд канала с помощью 1 мл Luer шприц путем введения 200 злимост стирального раствора 3x и инкубировать слайд с 1:50 разбавленных VWF-специфических антител в течение 30 минут на RT. Потом, мыть слайд канала снова 3x с 200 L стирального раствора и инкубировать слайд с 1:100 разбавленных AlexaFluor488-конъюгированных мыши конкретных антител в течение 30 минут на RT. Наконец, мыть слайд канала снова 3x с 200 зл и раствором для мытья.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лексутор-фторофоры чувствительны к отбеливанию. Таким образом, слайд должен быть защищен, сохраняя его в темной камере во время инкубационных шагов с флюорофором-конъюгированных антител.
    5. Для иммунообнаружения пневмококков, инкубировать слайд с 1:100 разбавленных пневмококк-специфических антитела кролика кролика в течение 30 минут на RT. После этого, мыть слайд канала 3x с 200 злицы стирального раствора и инкубировать слайд с 1:100 разбавленной AlexaFluor568-конъюгированных кролика конкретных антител в течение 30 минут на RT. Вымойте канал слайд снова 3x с 200 злител мытье раствора.
    6. Чтобы испачкать клеточный актин цитоскелет флуоресцентным фаллоидином, пронизайте HUVEC путем инкубации с 120 зл и 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут на RT. Вымойте канал слайд 3x с 200 л стирального раствора и инкубировать слайд с 120 мл 1:1,000 разбавленной AlexaFluor350-конъюгированный фаллоидин. Этот инкубационный шаг позволит визуализировать полимеризованный актин цитоскелет и позволит контролировать форму клетки и возможные вызванные стрессом морфологические изменения.
    7. Вымойте канал слайд 3x с 200 зл стирки раствора. Наконец, мыть слайд 4x с 200 Л л ddH2O и визуализировать зеленые флуоресцентные строки VWF, красные флуоресцентные бактерии, и синий флуоресцентный актовый цитоскелет с использованием соответствующих настроек фильтра на флуоресценционный микроскоп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Культирование первичного HUVEC в постоянном однонаправленном потоке приводит к образованию сливательного и плотно упакованного клеточного слоя, который способствует генерации клеточных WPB, наполненных механочувствительным VWF13,14. Этот протокол описывает использование насоса давления воздуха на основе, беспульсивный рециркуляции системы для анализа инфекции, которая требует имитации сдвига стрессовой ситуации в крови человека.

Эта си...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Моделирование бактериального взаимодействия с механочувствительными белками-хостами, такими как VWF, требует сложной системы культуры клеток, которая позволяет генерировать определенный, однонаправленный и непрерывный поток жидкостей, тем самым создавая надежный стресс сдвига . Уже описано несколько микрофлюидных насосных систем. Всеобъемлющий обзор от Bergmann et al. обобщает ключевые аспекты различных двух- и трехмерных моделей клеточной культуры17.

Микрофлюидическая ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Проект финансировался DFG (BE 4570/4-1) в S.B.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл люэровского шприцаFisher Scientific10303002объемом 1 мл для инъекций желатина с использованием люэровского соединения предметных стекол
2 мл люэровского шприцаSarstedt9077136Для закачки/введения жидкостей в люэровские соединения камеры канала слайдов
AccutaseeBioscience теперь thermo fisher00-4555-56смесь протеаз используется для бережной отслойки эндотелиальных клеток
AlexaFluor350-конъюгированный фаллоидинAbcamab176751концентрация отсутствует у производителя, стокового раствора достаточно на 300 tet, компания рекомендует использовать 100 &микро; L разведения 1:1,000, синяя флуоресценция (настройки DAPI-фильтра)
AlexaFluor488-конъюгированное антитело против мышикозьего происхождения Thermo Fisher SientificA11001стоковая концентрация: 2 мг/мл для иммуноокрашивания VWF человека в микрофлюидном стекле после фиксации PFA, зеленая флуоресценция
AlexaFluor568-конъюгированное козье антитело против кроликаThermo Fisher ScientificA-11011стоковая концентрация: 2 мг/мл для иммуноокрашивания пневмококков в микрофлюидных предметных стеклах после фиксации pFA, красная флуоресценция
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210комплексная бактериальная культуральная среда
Бычья сыворотка альбумин (БСА)Sigma AldrichA2153-25Gсолюбилизированная, для приготовления блокирующего буфера
Клеточные культуральные колбы с фильтромTPP90026субкультивирование HUVEC в колбах для клеточных культур без оболочки размером 25 см<суп>2 поверхность
Центрифуга Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304отжим бактерий (объемом >2 мл)
Центрифуга Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314отжим эукариотических клеток
Центрифуга Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 M
ХлорамфениколCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2используется в концентрации 0,2 мг/мл для культивирования пневмококков, преобразованных с помощью генетической конструкции, несущей красный флуоресцентный белок, и ловушки сопротивления хлорамфениколу кассета
Зажим для перфузионной трубкиibidi10821для удержания жидкости в трубке, соединяющей предметное стекло с насосной системой
CO2-инкубаторFisher ScientificMIDI 40размер инкубатора идеально адаптирован к размеру жидкостного блока с подключенным канальным слайдом и использовался для культивирования в потоке при 37 °°; C и 5% CO2
CO2-инкубаторSanyoMCO-18 AICдля инкубации бактерий и клеток в определенной атмосфере при 5% CO2 и 37&dg; C
Колумбийские агаровые пластиныBecton Dickinson GmbHPA-254005.06комплексная питательная среда на основе агара для S. pneumoniae с добавлением 7% овечьей крови
КомпьютерDellLatitude 3440Comuter с программным
обеспечением насоса Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM)LeicaDMi8Инверсионный микроскоп со предметным столиком, закрытым нагреваемой камерой, и с флуоресцентным блоком, оснащенным флуоресцентным фильтром, ксеноновым источником света (SP8, DMi8) и DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 мегапикселя)
Di Гидрофосфат калия (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1используется для буфера PBS
Сушильный материалMerck101969оранжевые кремнеземные шарики для сушки используются в стеклянной бутылке с трубкой адаптера
ECGM добавка MixPromocellC-39215добавка смесь для ECGM -среда, необходимая для прекультивирования эндотелиальных клеток: 0,02 мл/мл Фетальная сыворотка теленка, 0,004 мл/мл добавка для роста эндотелиальных клеток, 0,1 нг/мл эпидермальный фактор роста, 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 90 и микро; г/мл гепарина, 1 & микро; г/мл Гидрокортизона
ECGMSPromocellC-22010ECGM с добавлением 5 % [w/w] FCS и 1 мМ MgSO4 для повышения адгезии клеток
Среда для роста эндотелиальных клеток (ECGM, готовая к применению)PromocellC-22010культуральная среда HUVECs, уже дополненная всеми компонентами смеси добавок
Фетальная сыворотка теленка (FCS)биохром теперь MerckS 0415добавка для клеточной культуры, используемая для анализа инфекций
FITC-конъюгированное козье антитело к человеку VWFAbcamab8822стоковая концентрация: 10 мг/мл, для иммунодетекции глобулярных и мультимеризованных VWF в потоке
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit для культивирования в потоке
Желатин (свиной)Sigma AldrichG-1890-100gдля предварительного покрытия поверхности микрослайдового канала
Гистамин дигидрохлоридSigma AldrichH-7250-10MGдля индукции секреции VWF из эндотелия Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042первичные эндотелиальные клетки от объединенного донора, хранящиеся в крипкоконсервации в жидком азоте
VWF-специфическое антитело человека, полученное из мыши (моноклональное)Santa Cruzsc73268концентрация запаса: 200 & микро; г/мл для иммуноокрашивания VWF в микрофлюидном предметном стекле после фиксации PFA
Инъекционный портibidi10820для инъекции гистамина или бактерий в трубку резервуара во время циркуляции потока
Световой микроскопZeissAxiovert 35Mинверсный световой микроскоп для контроля отделения эукариотических клеток и подсчета клеток с использованием 40-кратного водяного объектива, обеспечивающего 400-кратное увеличение
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176физически модифицированные слайды для флудного выращивания (μ – Слайд I0,4Luer с высотой канала 0,4 мм, объемом канала 100 мкм; L, площадь роста 2,5 см и площадь покрытия 25,4 см2) подходит для всех видов проточного анализа, физическая обработка создает гидрофильную и адгезионную поверхность.
Сульфат магния (MgSO4, негидратированный)Sigma AldrichM7506-500GДля приготовления среднего
микрофлюидного насосаECGMS ibidi10905воздушного насоса
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH& Co KG40442002микроскопическая счетная камера для HUVECs
Параформальдегид 16% (PFA)Электронная микроскопия Sciences15710-Sдля сшивки образцов
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green имеет диаметр трубки 1,6 мм, длину трубки 50 см, общий рабочий объем 13,6 мл, объем мертвой пробирки 2,8 мл и размер резервуара 10 мл. В сочетании с µ-слайдом L0.4Luer, на 37 ° C и вязкость 0,0072 дин x см<суп>2 диапазон расхода от 3,8 мл/мин до 33,9 мл/мин и напряжение сдвига от 3,5 дин/см<>2 до 31,2 дин/см<суп>2 с длиной 50 см для микрофлюидного
фосфатно-солевого буфера (PBS)раствор готовили с использованием следующих химических веществ: 0,2 г/л KCl, 1,44 г/л Na2HPO4, 0,24 г/л KH2PO4 , pH 7,4
Пластиковые кюветыSarstedt67,741(2 x optic) для измерения наружного диаметра при длине волны 600 нм
Специфическая антисыворотка PneumococcusPinedaвыращена у кроликов с использованием термоинактивированных Streptococcus pneumoniae NCTC10319 и D39, очищенных IgG с использованием протеинА-сефарозной колонки.
полистирола или пенополистиролаэто мера предосторожности для избежания холодового стресса на клетках, посеянных в предметных стеклах канала. Можно использовать любой тип пенополистирола, например, упаковочный материал для коробки. Тарелка может быть толщиной 0,5 см и иметь размер 20 см<суп>2.
Хлорид калия (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ6781.1используется для PBS
Программное обеспечение для управления буферным насосом (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Компьютерное программное обеспечение для управления нагнетательным насосом, настройки условий потока и начала/окончания потока
Реакционные пробирки 1,5/2,0 млSarstedt72.706/ 72.695.500необходимы для разведения антител
Реакционные пробирки с 50 мл объемSarstedt6,25,48,004
RFP-экспрессирующие пневмококкиНациональная коллекция типовых культур, Общественное здравоохранение Англии10,319Streptococcus pneumoniae серотипа 47 экспрессирующие RFP слитые с интегрированным в геном агистоноподобным белком
Серологические пипетки 5, 10 млSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025для пипетирования больших объемов
Карбонат натрия (Na2CO3, без воды)Sigma Aldrich451614-25Gдля приготовления 100 мМ буфера карбоната натрия
дигидрофосфата натрия (2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2используется для PBS
буферного спектрального фотометра Libra S22Biochrom80-2115-20измерение оптической плотности (OD) бактериальной суспензии при длине волны 600 нм
SucroseSigmaAldrich S0389-500Gдля приготовления блокирующего буфера
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLИспользуется в концентрации 0,1% в конечной концентрации, разведенной в dH20 для пермеабилизации эукариотических клеток после фиксации PFA
Экстракт дрожжейoxoidLP0021бактерии культивируются в добавке THB с 1% [w/w] дрожжевого экстракта = полная среда для культивирования бактерий THY
Плита из

Ссылки

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HUVECVWF
Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.