Методическая статья

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/60329

⸱

25 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем надежный протокол для количественной оценки 40 соединений, участвующих в центральном метаболизме углерода и энергии в реакции синтеза белка без клеток. Смесь синтеза без клеток производная с анилином для эффективного разделения с использованием обратной фазы жидкой хроматографии, а затем количественно масс-спектрометрии с использованием изотопно обозначенных внутренних стандартов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтез белка без клеток (CFPS) является новой технологией в системах и синтетической биологии для производства белков in vitro. Однако, если CFPS собирается выйти за пределы лаборатории и стать широко распространенной и стандартной как раз вовремя технологии производства, мы должны понимать пределы производительности этих систем. На этот вопрос мы разработали надежный протокол для количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфата пути, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод использует внутренние стандарты, отмеченные 13C-анилин, в то время как соединения в образце производные с 12C-анилин. Внутренние стандарты и образец были смешаны и проанализированы с помощью обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS). Со-элютация соединений устранила подавление иона, позволив точно количественно определить концентрацию метаболитов на 2-3 порядка, где средний коэффициент корреляции составлял 0,988. Пять из сорока соединений были не отмечены анилином, однако они все еще были обнаружены в образце CFPS и количественно с помощью стандартного метода кривой. Хроматографический пробег занимает около 10 минут. В совокупности мы разработали быстрый и надежный метод разделения и точной количественной оценки 40 соединений, участвующих в CFPS в одном запуске LC/MS. Этот метод представляет собой комплексный и точный подход к характеристике метаболизма без клеток, так что в конечном счете, мы можем понять и улучшить урожайность, производительность и энергоэффективность систем, свободных от клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтез белка без клеток (CFPS) является перспективной платформой для производства белков и химических веществ, приложение, которое традиционно зарезервировано для живых клеток. Системы, свободные от клеток, получены из экстрактов сырой клетки и устраняют осложнения, связанные с ростом клеток1. Кроме того, CFPS обеспечивает прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без вмешательства клеточной стенки. Однако фундаментальное понимание пределов производительности процессов, свободных от клеток, отсутствует. Высокопроизводительные методы метаболитной количественной оценки имеют важное значение для характеристики метаболизма и имеют решающее значение для построения метаболических вычислительных моделей2,3,4. Общие методы, используемые для определения концентрации метаболита включают ядерный магнитный резонанс (NMR), Фурье трансинфракрасной спектроскопии (FT-IR), ферментнаосновения и масс-спектрометрии (MS)5,6,7 ,8. Однако эти методы часто ограничиваются их неспособностью эффективно измерять несколько соединений одновременно и часто требуют размера выборки, превышающее типичные реакции, свободные от клеток. Например, анализы на основе ферментов часто могут использоваться только для количественной оценки одного соединения в пробеге, и ограничены, когда размер выборки мал, например, в реакции синтеза белка без клеток (обычно работают по шкале 10-15 л). Между тем, ЯМР требует высокого изобилия метаболитов для обнаружения и количественной оценки5.  К этим недостаткам, методы хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (LC/MS) обеспечивают несколько преимуществ, включая высокую чувствительность и возможность измерения нескольких видов одновременно9; однако сложность аналитических исследований значительно возрастает по мере измерения количества и разнообразия видов. Поэтому важно разработать методы, которые в полной мере реализуют высокопроизводительный потенциал систем LC/MS. Соединения в образце разделены жидкой хроматографией и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии. Сигнал соединения зависит от его концентрации и эффективности ионизации, где ионизация может варьироваться между соединениями, а также может зависеть от матрицы образца.

Достижение той же эффективности ионизации между образцом и стандартами является сложной задачей при использовании LC/MS для количественной оценки анализов. Кроме того, количественная оценка становится все более сложной задачей с метаболитным разнообразием из-за расщепления сигналов и неоднородности в сродстве протона и полярности10. Наконец, матрица совместного использования образца может также влиять на эффективность ионизации соединений. Для решения этих проблем метаболиты могут быть химически производными, увеличивая разрешение разделения и чувствительность систем LC/MS, одновременно уменьшая расщепление сигнала в некоторых случаях10,11. Химическая произвена работает путем пометки конкретных функциональных групп метаболитов, чтобы настроить их физические свойства, такие как заряд или гидрофобность для повышения эффективности ионизации11. Различные метки могут быть использованы для целевых различных функциональных групп (например, амины, гидроксилы, фосфаты, карбоксиловая кислоты и т.д.). Анилин, один из таких агентов производной, цели нескольких функциональных групп одновременно, и добавляет гидрофобный компонент в гидрофильных молекул, тем самым увеличивая их разделение резолюции исигнал12. Для решения эффекта подавления ко-элюлинга матрицы Ян и его коллеги разработали методику, основанную на маркировке групповых специфических внутренних стандартных технологий (GSIST), где стандарты маркируются 13-c-изотопов анилина и смешиваются с образцом 12,13. Метаболит и соответствующий внутренний стандарт имеют одинаковую эффективность ионизации, поскольку они совместно элютируются, и коэффициент их интенсивности может быть использован для количественной оценки концентрации в экспериментальной выборке.

В этом исследовании мы разработали протокол для обнаружения и количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфатпуть, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод основан на подходе GSIST, где мы использовали 12C-анилин и 13C-анилин для тегов, обнаружения и количественной оценки метаболитов с помощью обратной фазы LC/MS. Линейный диапазон всех соединений охватывал 2-3 порядка величины со средним коэффициентом корреляции 0,988. Таким образом, метод является надежным и точным подходом к допросу клеточного метаболизма, и, возможно, цельноклеточных экстрактов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка реагентов для анилиновых пометок

  1. Подготовьте анилинный раствор 6 M на уровне pH 4.5. Работая в капюшоне, смешайте 550 л анилина с 337,5 л воды класса LCMS и 112,5 л соляной кислоты (HCl) в центрифуговой трубке. Вихрь хорошо и хранить при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анилин может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 2 месяцев.
    ВНИМАНИЕ: Анилин является высокотоксичным и должны работать с в дым капот. Гидрохлорная кислота очень коррозионная
  2. Подготовьте анилинный раствор 6 M 13C на pH 4.5. Смешайте 250 мг 13C 6-анилин с 132 л воды и 44 Л 12 М HCl. Вихрь хорошо и хранить при 4 градусах Цельсия.
  3. Приготовьте 200 мг/мл N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодимид гидрохлорид (EDC) раствор. Растворите 2 мг EDC в 10 л воды для каждого образца, который должен быть помечен и вихрь хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: решение EDC должно быть подготовлено в тот же день, что и реакция. EDC выступает в качестве катализатора для произвобления соединений с анилин12.

2. Подготовка стандартов

  1. Сделайте отдельные стоковые растворимые в воде lc/MS класса(таблица 1).
  2. Подготовка внутреннего стандартного акционерного решения
    1. Комбинат всех соединений, за исключением никотинамида аденин динуклеотид (NAD), никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADP), флавин аденин динуклеотид (FAD), ацетил коэнзим А (ACA), и глицерол 3-фосфат (Gly3P), с соответствующими объемами создать 2 мМ бульонный раствор всех соединений.
  3. Объедините NAD, NADP, FAD, ACA и Gly3P с соответствующими объемами для создания акционерного решения объемом 2 мМ.

3. Подготовка образца(рисунок 1)

  1. Утолить и осаждать белки в реакции синтеза белка без клеток, добавляя в реакцию равный объем ледяного 100% этанола. Центрифуги образца при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию. Перенесите супернатант в новую центрифужную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 градусах по Цельсию в этот момент и анализироваться в более позднее время

4. Реакция маркировки

  1. Выборка маркировки с 12C-анилином
    1. Передача 6 л образца в новую центрифужную трубку и довести объем до 50 зл сводой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер выборки может зависеть от конкретной реакции CFPS.
    2. Добавьте 5 л из 200 мг/мл EDC раствора.
    3. Добавьте 5 зл из 12C-анилина раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анилиное решение разделяется на две фазы. Хорошо перемешайте, прежде чем добавить к реакции.
    4. Вихрь реакция с нежной тряской в течение 2 ч при комнатной температуре.
    5. После 2 ч, удалить трубки из шейкера и добавить 1,5 л триэтиламин (TEA) к реакции в дым капот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Триэтиламин повышает рН раствора, который останавливает реакцию анилина и стабилизирует соединения.
      ВНИМАНИЕ: Триэтиламин является токсичным и вызывает раздражение глаз и дыхательных путей.
    6. Центрифуга при 13500 х г в течение 3 мин.
  2. Маркировка внутренних стандартов с 13C-анилином
    1. Разбавить раствор внутреннего запаса до 80 мкм с окончательным объемом 50 л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация внутренних стандартов может быть скорректирована с уровнями, близкими к экспериментальной выборке.
    2. Добавьте 5 л из 200 мг/мл EDC раствора.
    3. Добавьте 5 зл из 13C-анилина раствора.
    4. Вихрь реакция с нежной тряской в течение 2 ч при комнатной температуре.
    5. После 2 ч, удалить трубки из шейкера и добавить 1,5 л TEA к реакции в дым капот.
    6. Центрифуга при 13500 х г в течение 3 мин.
  3. Объединение помеченных внутренних стандартов и отмеченных образцов
    1. Смешайте 25 Зл из 12C-анилина помеченных образца с 25 Зл из 13C-анилин помечены стандартные.
    2. Передача на флакон авто-сэмплер и анализ по процедуре LC/MS.
  4. Создание стандартной кривой для метаболитов с немаркированными квагарами
    1. Разбавить запасной раствор немаркированных метаболитов (NAD, NADP, FAD, ACA и Gly3P) до конечной концентрации 320 мкм, 80 мкм, 20 мкм и 5 мкм с объемом 50 мл.
    2. Добавьте 5 л из 200 мг/мл EDC раствора.
    3. Добавьте 5 зл из 12C-анилина раствора.
    4. Вихрь реакция с нежной тряской в течение 2 ч при комнатной температуре.
    5. После 2 ч, удалить трубки из шейкера и добавить 1,5 л TEA к реакции в дым капот.
    6. Центрифуга при 13500 х г в течение 3 мин.
    7. Передача супернатанта на флакон авто-сэмплер и анализ по процедуре LC/MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неотмеченные метаболиты следуют той же процедуре, что и образец для репликации матрицы образца, чтобы сохранить аналогичную эффективность ионизации.

5. Настройка процедуры LC/MS

  1. Подготовка растворителей
    1. Приготовьте 5 мМ трибутиламин (TBA) aqueous раствор, скорректированный на рН 4,75 с уксусной кислотой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TBA в мобильной фазе помогает аналитикам достичь хорошего разрешения и разделения14.
    2. Подготовка 5 мМ TBA в ацетонитриле (ACN).
    3. Приготовьте растворитель для мытья с 5% водой и 95% ACN.
    4. Подготовка очистки растворителя с 95% воды и 5% ACN.
  2. Настройка условий MS
    1. Установите масс-спектрометр в отрицательный ионный режим с температурой зонда 520 градусов по Цельсию, отрицательным капиллярным напряжением -0,8 кВ, положительным капиллярным напряжением 0,8 кВ, и установите программное обеспечение для получения данных на уровне 5 баллов/с.
    2. Установите выбранные ионные записи (SIR) для каждого метаболита с указанными значениями конуса и массой над зарядом (м/z). Смотрите таблицу 1.
  3. Инициализация LC/MS в соответствии с инструкциями производителя
    1. Основные линии растворителя в диспетчере растворителя в течение 3 мин.
    2. Прайм растворитель для мытья (5% воды, 95% ACN) и очищают растворитель (95% воды, 5% ACN) для 15 s для 5 циклов.
    3. Установите диспетчер апроб до 10 градусов по Цельсию.
    4. Установите столбец C18 (1,7 мм, 2,1 мм x 150 мм) и инициализировать колонку со 100% ACN на 0,3 мл/мин в течение 10 минут.
    5. Состояние колонны на 95% воды и 5% ACN на 0,3 мл/мин в течение 10 минут до введения растворителей с буферами.
    6. Состояние колонки на 95% растворителя A (5мМ TBA aqueous, pH 4.75) и 5% растворителя B (5 мМ TBA в ACN) на 0,3 мл/мин в течение 10 мин.
    7. Настройка протокола градиента с elution, начиная с 95% растворителя A и 5% растворителя B, поднятого до 70% растворителя B за 10 мин, поднятого до 100% растворителя B за 2 мин и удерживаемого при 100% растворителе B в течение 3 мин. Возвращение к первоначальным условиям (95% растворителя A A , 5% растворитель B) более 1 мин и удерживайте в течение 9 мин, чтобы повторно уравновесить столбец.
    8. Состояние столбца с протоколом градиента 3 раза до любых инъекций на столбец.
  4. Инъекционная пробы и стандарты
    1. Введите 5 зЛ образца в столбец и приобретете соответствующую интенсивность ионных м/з для 12C-анилина отмеченный образец.
    2. Введите 5 зл и того же образца снова, но на этот раз приобрести интенсивность м / z иондля 13C-анилин тегами стандартов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наша система LC/MS не может приобретать как 12C, так и 13C/z интенсивности в указанных временных окнах SIR, так как это слишком много данных, чтобы приобрести в указанном временном окне. Поэтому мы вводим один и тот же образец дважды.
    3. Вводят немаркированные стандарты метаболита от самой низкой концентрации до самой высокой и фиксируют соответствующую интенсивность ионных м/з.

6. Количественная оценка

  1. Создание метода экспорта
    1. В программном обеспечении для сбора данных, выберите файла (new Method)
    2. Укажите имя файла, например AnilineTagging -Дата.
    3. Проверьте файл Экспорт ASCII и выберите каталог для экспорта текстового файла.
    4. В типе отчетавыберите Резюме для всех.
    5. В Делимитеры,для колонки выберите ,. Для строки, выберите «cr», если ».
    6. В таблице, выберите Экспорт, а затем отобразить таблицу, чтобы включить SampleName, Область, Высота, Количество и единицы.
    7. Сохранить метод экспорта.
  2. Количественная оценка метаболитов с внутренними стандартами с использованием программного обеспечения для сбора данных
    1. Под вкладкой «Образец наборов» нажмите на соответствующий запуск LC/MS и выберите View в качестве
    2. Выберите все каналы SIR для 13C-анилин внутренних стандартов одной инъекции, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Обзор.
    3. Если окно LC Processing Method Layout не отображается автоматически, перейдите в View
    4. В обработке метода Layout, перейдите на вкладку интеграции и установить ApexTrack в качестве алгоритма.
    5. Перейти к вкладке Сглаживание и установить тип среднего и уровня сглаживания до 13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любой уровень сглаживания может быть выбран, до тех пор, пока он соответствует во всех образцах.
    6. Во вкладке MS Channel отработка обработки MS 3D.
    7. В окне канала SIR интегрируйте каждый пик, один канал за один раз. Как только пик интегрирован, перейдите к Опционам (gt; Заполните от результата, и детали пика будут заполнены во вкладке Компоненты.
    8. После того, как все каналы SIR были оценены, сохраните метод обработки и закройте окно.
    9. Выберите все каналы SIR 13C-анилин и 12C-анилин помечены образца, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс.
    10. Проверьте окно процесса, выберите Метод обработки ивыберите только что сохраненный метод обработки. Также проверьте поле Экспорта, выберите метод экспорта и выберите сохраненный метод экспорта, созданный ранее. Нажмите OK.
    11. Откройте экспортированный текстовый файл с помощью Excel и вычислите концентрацию неизвестного соединения с помощью:
      figure-protocol-1
      где Cx,i является концентрация неизвестного образца для метаболита я,Х, я является интегрированной области неизвестного метаболита я,StD, я является интегрированной области внутреннего стандарта метаболита я, Cstd, я концентрация внутреннего стандарта метаболита i, и D является фактором разбавления.
  3. Количественная оценка метаболитов со стандартной кривой
    1. Под вкладкой «Образец наборов» нажмите на соответствующий запуск LC/MS и выберите View в качестве
    2. Выберите все каналы SIR для немаркированных стандартов одной инъекции, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Обзор.
    3. Если окно LC Processing Method Layout не отображается автоматически, перейдите в View
    4. В обработке метода Layout перейдите на вкладку Интеграция и установите ApexTrack в качестве алгоритма.
    5. Перейти к вкладке Сглаживание и установить тип среднего и уровня сглаживания до 13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любой уровень сглаживания может быть выбран, до тех пор, пока он соответствует во всех образцах.
    6. Во вкладке MS Channel отработка обработки MS 3D.
    7. В окне канала SIR интегрируйте каждый пик, один канал за один раз. Как только пик интегрирован, перейдите к Опционам (gt; Заполните от результата, и детали пика будут заполнены во вкладке Компоненты.
    8. После того, как все каналы SIR были оценены, сохраните метод обработки и закройте окно.
    9. Под вкладкой Sample Sets нажмите правое нажатие на набор образцов и выберите Alter Sample.
    10. Выберите Сумму в новом окне.
    11. Выберите копию из метода Process и выберите только что сохраненный метод процесса.
    12. Введите концентрацию каждого метаболита для каждого флакона и введите единицу в качестве lt;qM для каждого компонента (или соответствующего блока) и выберите OK.
    13. Выберите образец набор еще раз, правый клик, Посмотреть как
    14. Выберите все каналы SIR неотмеченных метаболитов для стандартов, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс.
    15. Проверьте поле Process и выберите метод обработки. Выберите подходящий метод обработки и нажмите OK.
    16. Выберите каналы SIR для всех метаболитов без метки для образцов, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс.
    17. Проверьте поле Process, выберите метод обработки и выберите только что сохраненный метод обработки. Также проверьте поле Экспорта, выберите метод экспорта и выберите сохраненный метод экспорта, созданный ранее. Нажмите OK.
    18. Количественное оснащение метаболитов стандартной кривой и экспорт результатов в текстовый файл в указанный каталог.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве доказательства концепции мы использовали протокол для количественной оценки метаболитов в системе CFPS на основе кишечной палочки, выражающей зеленый флуоресцентный белок (GFP).  Реакция CFPS (14 л) была утоплена и депротеинизирована этанолом. Образец CFPS был затем помечен 12C-анилин, в то время как стандарты были помечены 13C-анилин. Помеченный образец и стандарты затем были объединены и введены в LC/MS(рисунок 1). Протокол обнаружил и количественн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системы, свободные от клеток, не имеют клеточной стенки, поэтому существует прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без необходимости сложной подготовки образцов. Тем не менее, было проделано очень мало работы по разработке тщательных и надежных протоколов для количественного допроса систем реакции, свободных от клеток. В этом исследовании мы разработали быстрый, надежный метод количественной оценки метаболитов в клеточных смесях реакции и, возможно, в цельноклеточных экстрактах. Индивидуальная колич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанная работа была поддержана Центром по физике метаболизма рака через премию Номер 1U54CA210184-01 от Национального института рака (https://www.cancer.gov/). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения. Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12C АнилинSigma-Aldrich242284Анилин 12C
13C меченый анилинSigma-Aldrich485797Анилин 13C6
3-фосфоглицериновая кислотаSigma-AldrichP88773PG
Уксусная кислотаFisherScientificAC222140010ACE
Ацетонитрил, LCMSJT BAKER9829-03ACN
Ацетил-коэнзим АSigma-AldrichA2056ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μ M, 2,1 x 150 мм КолонкаВоды186002353Колонка
АденозиндифосфатSigma-AldrichA2754
ADP АденозинмонофосфатSigma-AldrichA1752AMP
АденозинтрифосфатSigma-AldrichA2383
АТФ Альфа-кетоглутаратSigma-AldrichK1128aKG
ЦитратSigma-Aldrich251275CIT
ЦитидиндифосфатSigma-AldrichC9755
CDP ЦитидинмонофосфатSigma-AldrichC1006
CMP ЦитидинтрифосфатSigma-AldrichC9274CTP
D-глицеральдегид 3-фосфатSigma-Aldrich39705
GAP Эритроза 4-фосфатSigma-AldrichE0377E4P
ЭтанолSigma-AldrichEX0276
EtOH Fisher Scientific accuSpin Micro 17 ЦентрифугаFisherScientificФлавин
адениндинуклеотидSigma-AldrichF6625
FAD Фруктоза 1,6-бисфосфатSigma-AldrichF6803F16P
Фруктоза 6-фосфатСигма-ОлдричF3627F6P
ФумаратСигма-ОлдричF8509FUM
Глюконат 6-фосфатSigma-AldrichP78776PG
ГлюкозаSigma-AldrichG8270GLC
Глюкоза 6-фосфатSigma-AldrichG7879G6P
Глицерин 3-фосфатSigma-AldrichG7886Gly3P
ГуанозиндифосфатSigma-AldrichG7127GDP
ГуанозинмонофосфатSigma-AldrichG8377GMP
ГуанозинтрифосфатSigma-AldrichG8877GTP
Соляная кислотаSigma-Aldrich258148HCl
изоцитратSigma-AldrichI1252ICIT
ЛактатSigma-AldrichL1750LAC
MalateSigma-Aldrich02288MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix KitArborBiosciences507024Синтез бесклеточного белка
N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимида гидрохлоридSigma-Aldrich03449EDC
Никотинамид адениндинуклеотидSigma-Aldrich43410
NAD Никотинамид адениндинуклеотид фосфатSigma-AldrichN5755NADP
Никотинамид адениндинуклеотид фосфат восстановленныйSigma-Aldrich481973NADPH
Никотинамид адениндинуклеотид восстановленныйSigma-AldrichN8129NADH
оксалацетатSigma-AldrichO4126OAA
ФосфоенолпируватSigma-AldrichP0564
PEP PyruvateSigma-AldrichP5280
PYR Рибоза 5-фосфатSigma-AldrichR7750R5P
Рибулоза 5-фосфатКарбоСинтMR45852RL5P
Седохептулоза 7-фосфатКарбоСинтMS07457S7P
СукцинатСигма-ОлдричS3674SUCC
ТрибутиламинSigma-Aldrich90780TBA
ТриэтиламинFisherScientificO4884TEA
сверхчистая водаFisherScientific10977-015вода
УридиндифосфатSigma-AldrichU4125
UDP Уридин монофосфатSigma-AldrichU6375UMP
Уридин трифосфатSigma-AldrichU6625UTP
VWR Сверхмощный вихревой VWRVortex
Water, LCMSJT BAKER9831-03WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quatarary Solvent ManagerWatersLCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTNWatersLCMS
Воды Acquity Qda детекторводыLCMS
Waters Empower 3Водноепрограммное обеспечение
Воды LCMS Total Recovery Флаконводой186000384cLCMS Флакон
с

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012(2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи