Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Органоидные культуры простаты как инструменты для перевода генотипов и мутационных профилей в фармакологические ответы

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60346

⸱

24 октября 2019 г.

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для изучения фармакологических реакций в эпителиальных органоидах простаты. Органоиды очень напоминают биологию виво и резюмировать генетику пациентов, делая их привлекательными модельных систем. Органоиды простаты могут быть установлены из дикого типа простаты, генетически модифицированных моделей мыши, доброкачественных тканей человека, и передовых рака простаты.

Аннотация

Здесь представлен протокол для изучения фармакодинамики, потенциала стволовых клеток и дифференциации рака в эпителиальных органоидах простаты. Органоиды простаты являются андрогенов отзывчивые, трехмерные (3D) культуры, выращенные в определенной среде, которая напоминает простатический эпителий. Органоиды простаты могут быть созданы из диких и генетически модифицированных моделей мыши, доброкачественных тканей человека, и передовых рака простаты. Важно отметить, что полученные организмом пациенты очень похожи на опухоли в генетике и биологии опухолей in vivo. Кроме того, органоиды могут быть генетически манипулировать с помощью CRISPR/Cas9 и shRNA систем. Эти контролируемые генетики делают органоидную культуру привлекательной в качестве платформы для быстрого тестирования влияния генотипов и мутационных профилей на фармакологические реакции. Однако экспериментальные протоколы должны быть специально адаптированы к 3D-природе органоидных культур для получения воспроизводимых результатов. Описаны здесь подробные протоколы для выполнения посевных анализов для определения способности органоидного образования. Впоследствии, этот доклад показывает, как выполнять медикаментозное лечение и анализировать фармакологические реакции с помощью измерений жизнеспособности, изоляции белка, и изоляции РНК. Наконец, протокол описывает, как подготовить органоиды для ксенотрансплантации и последующих анализов роста in vivo с использованием подкожной прививки. Эти протоколы дают высоковоспроизводимые данные и широко применимы к системам 3D-культуры.

Введение

Лекарственная устойчивость является одной из основных клинических проблем в лечении рака. Метастатический рак предстательной железы (PCa) лечение в первую очередь направлено на андроген-сигнальных оси. Антиандрогенная терапия нового поколения (например, энзалутамид и абиратерон) показали большой клинический успех, но практически все PCa в конечном итоге прогрессирует в направлении андрогенно-независимого состояния, или кастрации устойчивый рак предстательной железы (CRPC).

Недавнее геномное и транскриптомическое профилирование CRPC показало, что существует три общих механизма резистентности при раке предстательной железы: 1) активация мутаций, приводящих к восстановлению андрогенных рецепторов (AR), сигнализирующих1; 2) активация шунтирования сигнализации, как это можно прославить в доклинической модели для устойчивости антиандрогенной терапии следующего поколения, при которой активация глюкокортикоидного рецептора (ГР) может компенсировать потерю AR сигнализации2; и 3) недавно выявленный процесс пластичности линии, в котором опухолевые клетки приобретают устойчивость, переключая линии от типа клеток, зависимых от цели препарата, к другому типу клеток, который не зависит от этого (который, в PCa, представлен как AR-отрицательный и/или нейроэндокринное заболевание (NEPC)3,4. Однако молекулярные механизмы, вызывающие лекарственную устойчивость, не изучены. Кроме того, приобретенная устойчивость к антиандрогену может привести к терапевтической уязвимости, которую можно использовать. Поэтому важно оценить реакцию препарата в модельных системах, имитирующих фенотипы и генотипы пациентов.

Органоиды простаты являются органотипическими культурами, выращенными в 3D-белковой матрице с определенной средой. Важно отметить, что органоиды простаты могут быть установлены из доброкачественных и раковых тканей мурин или человеческого происхождения, и они сохраняют фенотипические и генотипические особенности, найденные в vivo5,6. Важно отметить, что как анти-андроген чувствительных PCa и CRPC клетки представлены в текущем компендиуме органоидов. Кроме того, органоиды простаты легко генетически манипулируют с помощью CRISPR/Cas9 и shRNA5. Таким образом, органоиды простаты являются подходящей моделью системы для тестирования лекарственных реакций и выяснений механизмов резистентности. Здесь описан подробный протокол для проведения тестирования на наркотики и анализа фармакологических реакций с использованием органов простаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Вся работа, описанная в этом протоколе, была выполнена с ранее установленными муринорганидами и органоидами, полученными от пациента. Все работы на животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Научно-исследовательского животного ресурсного центра Мемориального онкологического центра Слоун Кеттеринг (IACUC: 06-07-012). Все ткани, полученные из числа пациентов, были собраны в соответствии с правилами и положениями онкологического центра Memorial Sloan Kettering (IRB: 12001).

1. Средняя и буферная подготовка

  1. Оттепель подвалм мембранной матрицы (например, Matrigel) на 4 кв с ночь перед началом эксперимента. Держите его на льду во время использования.
  2. Поместите культурные тарелки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч до экспериментов. Это поможет подвалу мембраны матричного купола (в дальнейшем называют матричной купол) для полимеризации. Органоиды для покрытия описаны в шаге 2.1.2.
  3. Подготовка органоидной среды в соответствии с установленным протоколом5.
  4. Подготовьте органоидную среду без добавления эпидермального фактора роста (EGF; см. Таблица материалов для компонентов). EGF подавляет транскрипционный выход AR и придает устойчивость к антиандрогену5.
  5. Подготовка Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это средства массовой информации используется для ингибирования ферментативного пищеварения с заменой трипсина в разделах 2-4.
  6. Подготовка лекарственных растворов в соответствии с протоколом производителя. Для enzalutamide/mdv3100 (далее называют анти-андроген второго поколения), подготовить запас раствор 100 мкм в диметил сульфодоксид (DMSO). Запас ы может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев и не должен быть свежим.

2. Изоляция, ферментативное пищеварение и создание органоидов

  1. Изолировать органоиды простаты из мыши или ткани человека в соответствии с ранее установленными протоколами5,7. Краткое описание приведено ниже.
    1. Фарш и ферментативно переваривают ткани простаты для получения одноклеточной суспензии. В этом эксперименте для переваривания 5 мг/мл коллагеназа II типа ADMEM/F12 использовалась для переваривания 50 мг ткани предстательной железы.
    2. Собирайте клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин, подсчитайте клетки, переприостановите их в подвальной мембранной матрице, и пластине при соответствующей плотности5,7 в матричных куполах на предварительно разогретых органоидных плитах культуры (покрытие метод показан на рисунке 1A).
    3. Разрешить купола затвердеть и добавить средства массовой информации на вершинах куполов, так что они полностью покрыты.
  2. Выращивайте органоиды до нужного количества для применения ниже по течению. Номер ячейки может быть определен стандартными методами подсчета. Дополнительную информацию о плотности можно узнать в специальном разделе протокола для приложения.
  3. Используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить. Когда мембранная матрица подвала полностью нарушена, перенесите подвеску на коническую трубку 15 мл. Не размещайте более 10 куполов на одну коническую трубку 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  4. Снимите супернатант и промойте клеточные гранулы 5 мл PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  5. Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин с тряской при 37 градусах Цельсия. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FBS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  6. Нарисуйте супернатант и resuspend в 1 мл PBS.
  7. Фильтр подвески с фильтром 40 мкм для обеспечения одной подвески ячейки. Количественная оценка номера ячейки с помощью гемоцитометра или эквивалентного прибора подсчета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение жизнеспособных одиночных ячеек трудно, используйте сортировку потока для получения одноклеточного раствора.

3. Оценка способности органоидного образования

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить процент клеток, которые могут генерировать органоид, посевной анализ может быть выполнен в качестве прокси для стволовых / прародитель потенциал. Способность органоидного образования также важна для определения числа клеток для анализов жизнеспособности.

  1. Разбавить клеточную суспензию, полученную в шаге от 2,7 до 100 клеток на 10 л суспензии, с помощью органоидной среды, содержащей ингибитор 10 мкм рокиназы Y-27632.
  2. Перенесите 1100 ячеек (110 л суспензии) в новую коническую трубку.
  3. Добавьте 285 л мембранной матрицы и переприостановите клетки. Это приведет к концентрации матрицы в 70%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление мембранной матрицы подвала во время посева значительно уменьшает изменение размера купола, вызванное вязкостью белковой матрицы.
  4. Семенные клетки в 35 мтричных куполах в предварительно разогретой 24 скважине, в результате чего 200 клеток/колодца. Плита 3-5 репликирует на образец (также см. метод покрытия на рисунке 1А и шаг 2.1.2).
  5. Чтобы убедиться, что клетки остаются в пределах матричного купола, переверните пластину и поместите ее в клеточный инкубатор, чтобы укрепить мембранную матрицу подвала.
  6. Через 10 минут выньте пластину из инкубатора и добавьте среду, содержащую ингибитор киназы Rho.
  7. Освежать среду каждые 2 дня. Через 7 дней, количественное количество органоидов. Держите ингибитор Родкиназы в средствах массовой информации на протяжении всего эксперимента.
  8. Подсчитайте количество органоидов, установленных на купол, и вычислите процент органоидов, образуювшихся из общего числа клеток, покрытых (200 клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные отношения учреждения варьируются от 3%-60% в зависимости от типа клеток и генотипа.

4. Определение фармакологических реакций органоидов

  1. Продолжая со ступени 2.7, семена 1000-10000 клеток в матричном куполе. Используйте эффективность образования органоидов и скорость роста в качестве прокси для определения конечного номера ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые номера клеток приведены в таблице 1. Используйте от трех до пяти репликаций на условие в анализе. Используйте окончательную концентрацию 70% подвальной мембранной матрицы, чтобы уменьшить ошибки трубаций, вызванные вязкостью.
  2. Семя 35 зл и пляскивных куполов в 24 хорошо пластины и пусть купола затвердеть, как это делается в разделе 3 (также см. метод покрытия на рисунке 1И шаг 2.1.2). Добавьте среду, содержащую ингибитор родкиназы и препарат выбора. Этот метод может быть применен ко всем препаратам, но в этом протоколе, анти-андроген второго поколения используется на 10 мкм для примера. Чтобы определить половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50), выполнить бревенчатый 10 инкрементный, и в качестве контроля, использовать транспортное средство, в котором препарат был растворен.
  3. Освежать среду каждые два или три дня и анализировать органоиды на 7-й день, чтобы определить фармакологическую реакцию препарата. Временные точки могут варьироваться в зависимости от выбора эксперимента и препарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды не должны быть trypsinized для выполнения этих анализов.
  4. Чтобы сохранить органоиды нетронутыми, используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы.
  5. Когда мембранная матрица подвала полностью нарушена, перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Не передавайте более 10 матричных куполов на коническую трубку 15 мл.
  6. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Снимите супернатант и промойте 5 мл PBS.
  7. Приостанавливай органоиды в 1 мл PBS и нарушить органоиды с помощью тритурации и стекла Пастер пипетка.
  8. Количества фрагментов органоидов. Семена 5 реплицируют 100 органоидных фрагментов, описанных в шаге 2.1.2.
  9. Выполните результаты переживаний клеток, описанные ниже в разделе 7.

5. Изоляция РНК от органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные методы на основе столбцов дают хорошее количество и качество РНК. Для обеспечения хорошего количества РНК, используйте как минимум один купол на образец; однако рекомендуется использовать три купола, которые могут быть посеяны в одном колодце из 12 хорошо пластины.

  1. Добавить ке-меркаптоэтанол (1%) к буферу лютатиона лиза в комплекте изоляции РНК.
  2. Нарисуйте среду из мембранных куполов подвала, содержащих органоиды, и добавьте 750 зл. Пипетка вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Убедитесь, что все мембраны подвала матрицы была распущена.
  3. Добавьте 750 л 70% этанола и перемешайте путем пипетки. Затем перенесите 700 л смеси в столбец, центрифугу при 12 000 х г в течение 1 мин и повторите с остатком лизата.
  4. Выполните моющие и на колонке DNase лечения в соответствии с инструкциями производителя. Elute РНК в 30-50 Л без РНЗа воды.
  5. Измерьте концентрации с помощью флюорометра при OD 260 нм и 280 нм и храните при -80 градусах по Цельсию или продолжайте использовать приложения вниз по течению.

6. Белковая изоляция от органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции белка, подготовить стандартный буфер RIPA, содержащий фосфатазы и ингибиторы протеазы (Таблица материалов). Рекомендуется использовать по крайней мере три купола, которые могут быть посеяны в одном 12 скважины.

  1. Используя пипетку P1000, оформить среду из клетки с подвалом мембранных куполов, содержащих органоиды и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы.
  2. При полном нарушении перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  3. Снимите супернатант и промойте 5 мл ледяного PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  4. Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин при встряхивании при 37 градусах Цельсия.
  5. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FCS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постцентрифугация, не подвал мембранной матрицы должны быть видны в гранулы.
  6. Снимите супернатант и промойте 5 мл ледяного PBS. Снимите супернатант и перенапрягия клеточные гранулы в 300 злицисном буфере с помощью пипетки P1000, а затем перенесите в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
  7. Инкубировать на льду в течение 10 мин, а затем sonicate 2x на 30 с каждый при охлажденной воде с температурой 4 градусов по Цельсию. Поместите трубку обратно на лед и выполнять количественную оценку белка с помощью стандартных методов.
  8. Денатурная белка путем добавления сульфата натрия додецил (SDS), содержащего погрузочный краситель и кипятить в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Храните lysates при -80 градусах по Цельсию или продолжайте работать с приложениями ниже по течению.

7. Переживание клеточной жизнеспособности с помощью органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток может быть оценена с помощью коммерчески доступного набора для оценки жизнеспособности клеток и люминометра. Подготовка буферов в соответствии с инструкциями производителя. Рекомендуется пять репликаций на одно условие: одна реплика, состоящая из одного мембранного купола мембраны 35 Л в одном колодце 24 скважины.

  1. Нарисуйте среду органоидной культуры, стараясь оставить матричные купола нетронутыми.
  2. Добавьте 65 КЛ PBS и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить матричный купол.
  3. Добавьте 100 кл.л. буфера набора асссеев жизнеспособности ячейки и повторно приостановите путем пипеттинга.
  4. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут с встряхиванием.
  5. Передача 100 л смеси на непрозрачную пластину, подходящую для светинометра, и выполняйте чтение в соответствии с инструкциями производителя для набора для асссы для системы ассеции жизнеспособности клеток.

8. Подготовка органоидов для ксенотрансвтинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды также поддаются для подкожной прививки как иммунных скомпрометированных животных, а также, изогенных мышей. Для обеспечения вводили органоиды различаются in vivo, этикетки органоидов с составно выражающим флюорофор5. Рекомендуется провести экспериментальный эксперимент по прививке с использованием 5 х 105 клеток до 2 х 106 клеток на инъекцию, с шагом 5 х 106 клеток, так как эффективность прививки варьируется между органоидными линиями.

  1. Используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы. При полном нарушении перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не передавайте более 10 матричных куполов на коническую трубку 15 мл.
  2. Нарисуйте супернатант и промыть 5 мл PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  3. Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин при встряхивании при 37 градусах Цельсия.
  4. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FBS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
  5. Нарисуйте супернатант и resuspend в 1 мл PBS. Фильтр подвески с фильтром 40 мкм для обеспечения одной подвески ячейки. Количественная оценка клеток с использованием стандартных методов.
  6. Спин вниз и повторной концентрации клеток в ИНГибитор PBS и Ро до концентрации 2 х 106 клеток на 100 QL (см. Таблица 2 для концентрации клеток и абсолютное число клеток, необходимых для различных концентраций). Используйте равный объем подвальной мембранной матрицы для создания 1:1 подвески. Поместите подвеску на лед.
  7. Вводить клетки в соответствии со стандартными протоколами и контролировать рост ксенотрансплантата с помощью стандартных методов8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективность посева
Способность органоидного образования определяется фенотипом и генотипом. Базальные клетки дикого типа (WT) показали превосходную способность органоидного образования (30%-40%) по сравнению с светящимися клетками (3%) (Рисунок 1А). После органоидного установки способность к образованию резко возросла. Как правило, 25%-30% клеток, полученных из органоида WT может образовывать новыйор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе устойчивости к антиандрогену, и обнаружение потенциальных терапевтических уязвимостей требует тестирования фармакологических реакций в модельных системах, имитирующих рак простаты. Описано здесь подробный протокол для надежного анализа фармакологических реакций в пациента полученных и генетически модифицированных органов простаты и подготовки этих органоидных образцов для применения вниз по течению.

В этом протоколе есть два важных шага. Во-п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

C.L.S входит в совет директоров Novartis; является соучредителем компании ORIC Pharmaceuticals и соучредителем энзалутамид и апалутамида; является научным консультантом Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, КСЗ, Петра и PMV; и является соучредителем компании Seragon, приобретенной Genentech/Roche в 2014 году. W.R.K. является коизобретателем и патентообладателем органоидной технологии.

Благодарности

K.P. поддерживается NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. поддерживается HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; и Консорциум рака Старра. W.R.K. поддерживается Голландским онкологическим фондом/KWF Buit 2015-7545 и Фондом рака предстательной железы PCF 17YOUN10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A83-01Tocris2939Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 200 нМ
ADMEM/F12Gibco/Life technologies12634028Органоидный средний компонент
B27Gibco/Life technologies17504-044Органоидный средний компонент
Клеточные культуральные планшетыFisher657185
Титр клеток GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 1 нМ
ДМСОFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 50 нг/мл для мыши, 5 нг/нл для человека
FGF10Peprotech100-26Специфический для человека органоидный средний компонент: Конечная концентрация 10 нг/ ml
FGF2Peprotech100-18BСпецифический для человека компонент органоида среда: Конечная концентрация 5 нг/мл
GlutamaxGibco/Life technologies35050079Органоидный средний компонент
HEPESMADE IN-HOUSEН/ДОрганоидный средний компонент: Конечная концентрация 10 мМ
Матригель (Сниженный фактор роста & Фенол красный свободный)CorningCB-40230CОрганоидный средний компонент
N-ацетилцистеинSigma-AldrichA9165Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 1,25 мМ
НикотинамидSigma-AldrichN0636Специфический для человека органоидный средний компонент: Конечная концентрация 10 мМ
NOGGINPeprotech или стабильные трансфицированные клетки 293t с конструкцией Noggin (Karthaus et al. 2014)120-10CОрганоидный средний компонент: Конечная концентрация 10% кондиционированная среда или 100 нг/мл
Пенициллин/стрептавидинGemini Bio-Products400-109Органоидный средний компонент
Ингибиторы фоспатазыMerck Millipore524629
простагландин E2Tocris3632464
ингибиторы протеазыMerck Millipore539131
R-SPONDINPeprotech или стабильные трансфицированные клетки 293t с конструкцией R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)120-38Компонент органоидной среды: Конечная концентрация 10% кондиционированная среда или 500 нг/мл
буфер RIPAMerck20-188
РНК-легкий мини-наборQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7Компонент среды органоида, специфичного для человека: Конечная концентрация 10 μ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Органоидная среда компонент: Конечная концентрация 10 μ М

Ссылки

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891(2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CRISPR Cas9
Органоидные культуры простаты как инструменты для перевода генотипов и мутационных профилей в фармакологические ответы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.