Представлен протокол для изучения фармакологических реакций в эпителиальных органоидах простаты. Органоиды очень напоминают биологию виво и резюмировать генетику пациентов, делая их привлекательными модельных систем. Органоиды простаты могут быть установлены из дикого типа простаты, генетически модифицированных моделей мыши, доброкачественных тканей человека, и передовых рака простаты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Органоидные культуры простаты как инструменты для перевода генотипов и мутационных профилей в фармакологические ответы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь представлен протокол для изучения фармакодинамики, потенциала стволовых клеток и дифференциации рака в эпителиальных органоидах простаты. Органоиды простаты являются андрогенов отзывчивые, трехмерные (3D) культуры, выращенные в определенной среде, которая напоминает простатический эпителий. Органоиды простаты могут быть созданы из диких и генетически модифицированных моделей мыши, доброкачественных тканей человека, и передовых рака простаты. Важно отметить, что полученные организмом пациенты очень похожи на опухоли в генетике и биологии опухолей in vivo. Кроме того, органоиды могут быть генетически манипулировать с помощью CRISPR/Cas9 и shRNA систем. Эти контролируемые генетики делают органоидную культуру привлекательной в качестве платформы для быстрого тестирования влияния генотипов и мутационных профилей на фармакологические реакции. Однако экспериментальные протоколы должны быть специально адаптированы к 3D-природе органоидных культур для получения воспроизводимых результатов. Описаны здесь подробные протоколы для выполнения посевных анализов для определения способности органоидного образования. Впоследствии, этот доклад показывает, как выполнять медикаментозное лечение и анализировать фармакологические реакции с помощью измерений жизнеспособности, изоляции белка, и изоляции РНК. Наконец, протокол описывает, как подготовить органоиды для ксенотрансплантации и последующих анализов роста in vivo с использованием подкожной прививки. Эти протоколы дают высоковоспроизводимые данные и широко применимы к системам 3D-культуры.
Введение
Лекарственная устойчивость является одной из основных клинических проблем в лечении рака. Метастатический рак предстательной железы (PCa) лечение в первую очередь направлено на андроген-сигнальных оси. Антиандрогенная терапия нового поколения (например, энзалутамид и абиратерон) показали большой клинический успех, но практически все PCa в конечном итоге прогрессирует в направлении андрогенно-независимого состояния, или кастрации устойчивый рак предстательной железы (CRPC).
Недавнее геномное и транскриптомическое профилирование CRPC показало, что существует три общих механизма резистентности при раке предстательной железы: 1) активация мутац....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Вся работа, описанная в этом протоколе, была выполнена с ранее установленными муринорганидами и органоидами, полученными от пациента. Все работы на животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Научно-исследовательского животного ресурсного центра Мемориального онкологического центра Слоун Кеттеринг (IACUC: 06-07-012). Все ткани, полученные из числа пациентов, были собраны в соответствии с правилами и положениями онкологического центра Memorial Sloan Kettering (IRB: 12001).
1. Средняя и буферная подготовка
- Оттепель подвалм мембранной матрицы (например, Matrigel) на 4 кв с ночь перед началом эксперимента. Держите....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эффективность посева
Способность органоидного образования определяется фенотипом и генотипом. Базальные клетки дикого типа (WT) показали превосходную способность органоидного образования (30%-40%) по сравнению с светящимися клетками (3%) (Рисунок 1А). После органоидного установки способность к образованию резко возросла. Как правило, 25%-30% клеток, полученных из органоида WT может образовывать новыйор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе устойчивости к антиандрогену, и обнаружение потенциальных терапевтических уязвимостей требует тестирования фармакологических реакций в модельных системах, имитирующих рак простаты. Описано здесь подробный протокол для надежного анализа фармакологических реакций в пациента полученных и генетически модифицированных органов простаты и подготовки этих органоидных образцов для применения вниз по течению.
В этом протоколе есть два важных шага. Во-п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
C.L.S входит в совет директоров Novartis; является соучредителем компании ORIC Pharmaceuticals и соучредителем энзалутамид и апалутамида; является научным консультантом Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, КСЗ, Петра и PMV; и является соучредителем компании Seragon, приобретенной Genentech/Roche в 2014 году. W.R.K. является коизобретателем и патентообладателем органоидной технологии.
Благодарности
K.P. поддерживается NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. поддерживается HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; и Консорциум рака Старра. W.R.K. поддерживается Голландским онкологическим фондом/KWF Buit 2015-7545 и Фондом рака предстательной железы PCF 17YOUN10.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| A83-01 | Tocris | 2939 | Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 200 нМ |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Органоидный средний компонент |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Органоидный средний компонент |
| Клеточные культуральные планшеты | Fisher | 657185 | |
| Титр клеток Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 1 нМ |
| ДМСО | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 50 нг/мл для мыши, 5 нг/нл для человека |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Специфический для человека органоидный средний компонент: Конечная концентрация 10 нг/ ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Специфический для человека компонент органоида среда: Конечная концентрация 5 нг/мл |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Органоидный средний компонент |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | Н/Д | Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 10 мМ |
| Матригель (Сниженный фактор роста & Фенол красный свободный) | Corning | CB-40230C | Органоидный средний компонент |
| N-ацетилцистеин | Sigma-Aldrich | A9165 | Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 1,25 мМ |
| Никотинамид | Sigma-Aldrich | N0636 | Специфический для человека органоидный средний компонент: Конечная концентрация 10 мМ |
| NOGGIN | Peprotech или стабильные трансфицированные клетки 293t с конструкцией Noggin (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Органоидный средний компонент: Конечная концентрация 10% кондиционированная среда или 100 нг/мл |
| Пенициллин/стрептавидин | Gemini Bio-Products | 400-109 | Органоидный средний компонент |
| Ингибиторы фоспатазы | Merck Millipore | 524629 | |
| простагландин E2 | Tocris | 3632464 | |
| ингибиторы протеазы | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech или стабильные трансфицированные клетки 293t с конструкцией R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Компонент органоидной среды: Конечная концентрация 10% кондиционированная среда или 500 нг/мл |
| буфер RIPA | Merck | 20-188 | |
| РНК-легкий мини-набор | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Компонент среды органоида, специфичного для человека: Конечная концентрация 10 μ M |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Органоидная среда компонент: Конечная концентрация 10 μ М |
Ссылки
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
