Органоидные культуры простаты как инструменты для перевода генотипов и мутационных профилей в фармакологические ответы

Лекарственная устойчивость является одной из основных клинических проблем в лечении рака. Метастатический рак предстательной железы (PCa) лечение в первую очередь направлено на андроген-сигнальных оси. Антиандрогенная терапия нового поколения (например, энзалутамид и абиратерон) показали большой клинический успех, но практически все PCa в конечном итоге прогрессирует в направлении андрогенно-независимого состояния, или кастрации устойчивый рак предстательной железы (CRPC).

Недавнее геномное и транскриптомическое профилирование CRPC показало, что существует три общих механизма резистентности при раке предстательной железы: 1) активация мутаций, приводящих к восстановлению андрогенных рецепторов (AR), сигнализирующих^1; 2) активация шунтирования сигнализации, как это можно прославить в доклинической модели для устойчивости антиандрогенной терапии следующего поколения, при которой активация глюкокортикоидного рецептора (ГР) может компенсировать потерю AR сигнализации^2; и 3) недавно выявленный процесс пластичности линии, в котором опухолевые клетки приобретают устойчивость, переключая линии от типа клеток, зависимых от цели препарата, к другому типу клеток, который не зависит от этого (который, в PCa, представлен как AR-отрицательный и/или нейроэндокринное заболевание (NEPC)^3,4. Однако молекулярные механизмы, вызывающие лекарственную устойчивость, не изучены. Кроме того, приобретенная устойчивость к антиандрогену может привести к терапевтической уязвимости, которую можно использовать. Поэтому важно оценить реакцию препарата в модельных системах, имитирующих фенотипы и генотипы пациентов.

Органоиды простаты являются органотипическими культурами, выращенными в 3D-белковой матрице с определенной средой. Важно отметить, что органоиды простаты могут быть установлены из доброкачественных и раковых тканей мурин или человеческого происхождения, и они сохраняют фенотипические и генотипические особенности, найденные в vivo^5,6. Важно отметить, что как анти-андроген чувствительных PCa и CRPC клетки представлены в текущем компендиуме органоидов. Кроме того, органоиды простаты легко генетически манипулируют с помощью CRISPR/Cas9 и shRNA^5. Таким образом, органоиды простаты являются подходящей моделью системы для тестирования лекарственных реакций и выяснений механизмов резистентности. Здесь описан подробный протокол для проведения тестирования на наркотики и анализа фармакологических реакций с использованием органов простаты.

Вся работа, описанная в этом протоколе, была выполнена с ранее установленными муринорганидами и органоидами, полученными от пациента. Все работы на животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Научно-исследовательского животного ресурсного центра Мемориального онкологического центра Слоун Кеттеринг (IACUC: 06-07-012). Все ткани, полученные из числа пациентов, были собраны в соответствии с правилами и положениями онкологического центра Memorial Sloan Kettering (IRB: 12001).

1. Средняя и буферная подготовка

1. Оттепель подвалм мембранной матрицы (например, Matrigel) на 4 кв с ночь перед началом эксперимента. Держите его на льду во время использования.
2. Поместите культурные тарелки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч до экспериментов. Это поможет подвалу мембраны матричного купола (в дальнейшем называют матричной купол) для полимеризации. Органоиды для покрытия описаны в шаге 2.1.2.
3. Подготовка органоидной среды в соответствии с установленным протоколом⁵.
4. Подготовьте органоидную среду без добавления эпидермального фактора роста (EGF; см. Таблица материалов для компонентов). EGF подавляет транскрипционный выход AR и придает устойчивость к антиандрогену^5.
5. Подготовка Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это средства массовой информации используется для ингибирования ферментативного пищеварения с заменой трипсина в разделах 2-4.
6. Подготовка лекарственных растворов в соответствии с протоколом производителя. Для enzalutamide/mdv3100 (далее называют анти-андроген второго поколения), подготовить запас раствор 100 мкм в диметил сульфодоксид (DMSO). Запас ы может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев и не должен быть свежим.

2. Изоляция, ферментативное пищеварение и создание органоидов

1. Изолировать органоиды простаты из мыши или ткани человека в соответствии с ранее установленными протоколами^5,7. Краткое описание приведено ниже.
   1. Фарш и ферментативно переваривают ткани простаты для получения одноклеточной суспензии. В этом эксперименте для переваривания 5 мг/мл коллагеназа II типа ADMEM/F12 использовалась для переваривания 50 мг ткани предстательной железы.
   2. Собирайте клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин, подсчитайте клетки, переприостановите их в подвальной мембранной матрице, и пластине при соответствующей плотности^5,7 в матричных куполах на предварительно разогретых органоидных плитах культуры (покрытие метод показан на рисунке 1A).
   3. Разрешить купола затвердеть и добавить средства массовой информации на вершинах куполов, так что они полностью покрыты.
2. Выращивайте органоиды до нужного количества для применения ниже по течению. Номер ячейки может быть определен стандартными методами подсчета. Дополнительную информацию о плотности можно узнать в специальном разделе протокола для приложения.
3. Используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить. Когда мембранная матрица подвала полностью нарушена, перенесите подвеску на коническую трубку 15 мл. Не размещайте более 10 куполов на одну коническую трубку 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
4. Снимите супернатант и промойте клеточные гранулы 5 мл PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
5. Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин с тряской при 37 градусах Цельсия. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FBS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
6. Нарисуйте супернатант и resuspend в 1 мл PBS.
7. Фильтр подвески с фильтром 40 мкм для обеспечения одной подвески ячейки. Количественная оценка номера ячейки с помощью гемоцитометра или эквивалентного прибора подсчета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение жизнеспособных одиночных ячеек трудно, используйте сортировку потока для получения одноклеточного раствора.

3. Оценка способности органоидного образования

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить процент клеток, которые могут генерировать органоид, посевной анализ может быть выполнен в качестве прокси для стволовых / прародитель потенциал. Способность органоидного образования также важна для определения числа клеток для анализов жизнеспособности.

1. Разбавить клеточную суспензию, полученную в шаге от 2,7 до 100 клеток на 10 л суспензии, с помощью органоидной среды, содержащей ингибитор 10 мкм рокиназы Y-27632.
2. Перенесите 1100 ячеек (110 л суспензии) в новую коническую трубку.
3. Добавьте 285 л мембранной матрицы и переприостановите клетки. Это приведет к концентрации матрицы в 70%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление мембранной матрицы подвала во время посева значительно уменьшает изменение размера купола, вызванное вязкостью белковой матрицы.
4. Семенные клетки в 35 мтричных куполах в предварительно разогретой 24 скважине, в результате чего 200 клеток/колодца. Плита 3-5 репликирует на образец (также см. метод покрытия на рисунке 1А и шаг 2.1.2).
5. Чтобы убедиться, что клетки остаются в пределах матричного купола, переверните пластину и поместите ее в клеточный инкубатор, чтобы укрепить мембранную матрицу подвала.
6. Через 10 минут выньте пластину из инкубатора и добавьте среду, содержащую ингибитор киназы Rho.
7. Освежать среду каждые 2 дня. Через 7 дней, количественное количество органоидов. Держите ингибитор Родкиназы в средствах массовой информации на протяжении всего эксперимента.
8. Подсчитайте количество органоидов, установленных на купол, и вычислите процент органоидов, образуювшихся из общего числа клеток, покрытых (200 клеток).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные отношения учреждения варьируются от 3%-60% в зависимости от типа клеток и генотипа.

4. Определение фармакологических реакций органоидов

1. Продолжая со ступени 2.7, семена 1000-10000 клеток в матричном куполе. Используйте эффективность образования органоидов и скорость роста в качестве прокси для определения конечного номера ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые номера клеток приведены в таблице 1. Используйте от трех до пяти репликаций на условие в анализе. Используйте окончательную концентрацию 70% подвальной мембранной матрицы, чтобы уменьшить ошибки трубаций, вызванные вязкостью.
2. Семя 35 зл и пляскивных куполов в 24 хорошо пластины и пусть купола затвердеть, как это делается в разделе 3 (также см. метод покрытия на рисунке 1И шаг 2.1.2). Добавьте среду, содержащую ингибитор родкиназы и препарат выбора. Этот метод может быть применен ко всем препаратам, но в этом протоколе, анти-андроген второго поколения используется на 10 мкм для примера. Чтобы определить половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50), выполнить бревенчатый 10 инкрементный, и в качестве контроля, использовать транспортное средство, в котором препарат был растворен.
3. Освежать среду каждые два или три дня и анализировать органоиды на 7-й день, чтобы определить фармакологическую реакцию препарата. Временные точки могут варьироваться в зависимости от выбора эксперимента и препарата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды не должны быть trypsinized для выполнения этих анализов.
4. Чтобы сохранить органоиды нетронутыми, используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы.
5. Когда мембранная матрица подвала полностью нарушена, перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Не передавайте более 10 матричных куполов на коническую трубку 15 мл.
6. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Снимите супернатант и промойте 5 мл PBS.
7. Приостанавливай органоиды в 1 мл PBS и нарушить органоиды с помощью тритурации и стекла Пастер пипетка.
8. Количества фрагментов органоидов. Семена 5 реплицируют 100 органоидных фрагментов, описанных в шаге 2.1.2.
9. Выполните результаты переживаний клеток, описанные ниже в разделе 7.

5. Изоляция РНК от органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные методы на основе столбцов дают хорошее количество и качество РНК. Для обеспечения хорошего количества РНК, используйте как минимум один купол на образец; однако рекомендуется использовать три купола, которые могут быть посеяны в одном колодце из 12 хорошо пластины.

1. Добавить ке-меркаптоэтанол (1%) к буферу лютатиона лиза в комплекте изоляции РНК.
2. Нарисуйте среду из мембранных куполов подвала, содержащих органоиды, и добавьте 750 зл. Пипетка вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Убедитесь, что все мембраны подвала матрицы была распущена.
3. Добавьте 750 л 70% этанола и перемешайте путем пипетки. Затем перенесите 700 л смеси в столбец, центрифугу при 12 000 х г в течение 1 мин и повторите с остатком лизата.
4. Выполните моющие и на колонке DNase лечения в соответствии с инструкциями производителя. Elute РНК в 30-50 Л без РНЗа воды.
5. Измерьте концентрации с помощью флюорометра при OD 260 нм и 280 нм и храните при -80 градусах по Цельсию или продолжайте использовать приложения вниз по течению.

6. Белковая изоляция от органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции белка, подготовить стандартный буфер RIPA, содержащий фосфатазы и ингибиторы протеазы (Таблица материалов). Рекомендуется использовать по крайней мере три купола, которые могут быть посеяны в одном 12 скважины.

1. Используя пипетку P1000, оформить среду из клетки с подвалом мембранных куполов, содержащих органоиды и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы.
2. При полном нарушении перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
3. Снимите супернатант и промойте 5 мл ледяного PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
4. Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин при встряхивании при 37 градусах Цельсия.
5. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FCS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постцентрифугация, не подвал мембранной матрицы должны быть видны в гранулы.
6. Снимите супернатант и промойте 5 мл ледяного PBS. Снимите супернатант и перенапрягия клеточные гранулы в 300 злицисном буфере с помощью пипетки P1000, а затем перенесите в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
7. Инкубировать на льду в течение 10 мин, а затем sonicate 2x на 30 с каждый при охлажденной воде с температурой 4 градусов по Цельсию. Поместите трубку обратно на лед и выполнять количественную оценку белка с помощью стандартных методов.
8. Денатурная белка путем добавления сульфата натрия додецил (SDS), содержащего погрузочный краситель и кипятить в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Храните lysates при -80 градусах по Цельсию или продолжайте работать с приложениями ниже по течению.

7. Переживание клеточной жизнеспособности с помощью органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток может быть оценена с помощью коммерчески доступного набора для оценки жизнеспособности клеток и люминометра. Подготовка буферов в соответствии с инструкциями производителя. Рекомендуется пять репликаций на одно условие: одна реплика, состоящая из одного мембранного купола мембраны 35 Л в одном колодце 24 скважины.

1. Нарисуйте среду органоидной культуры, стараясь оставить матричные купола нетронутыми.
2. Добавьте 65 КЛ PBS и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить матричный купол.
3. Добавьте 100 кл.л. буфера набора асссеев жизнеспособности ячейки и повторно приостановите путем пипеттинга.
4. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут с встряхиванием.
5. Передача 100 л смеси на непрозрачную пластину, подходящую для светинометра, и выполняйте чтение в соответствии с инструкциями производителя для набора для асссы для системы ассеции жизнеспособности клеток.

8. Подготовка органоидов для ксенотрансвтинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды также поддаются для подкожной прививки как иммунных скомпрометированных животных, а также, изогенных мышей. Для обеспечения вводили органоиды различаются in vivo, этикетки органоидов с составно выражающим флюорофор⁵. Рекомендуется провести экспериментальный эксперимент по прививке с использованием 5 х 10⁵ клеток до 2 х 10⁶ клеток на инъекцию, с шагом 5 х 10⁶ клеток, так как эффективность прививки варьируется между органоидными линиями.

1. Используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы. При полном нарушении перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не передавайте более 10 матричных куполов на коническую трубку 15 мл.
2. Нарисуйте супернатант и промыть 5 мл PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
3. Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин при встряхивании при 37 градусах Цельсия.
4. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FBS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
5. Нарисуйте супернатант и resuspend в 1 мл PBS. Фильтр подвески с фильтром 40 мкм для обеспечения одной подвески ячейки. Количественная оценка клеток с использованием стандартных методов.
6. Спин вниз и повторной концентрации клеток в ИНГибитор PBS и Ро до концентрации 2 х 10⁶ клеток на 100 QL (см. Таблица 2 для концентрации клеток и абсолютное число клеток, необходимых для различных концентраций). Используйте равный объем подвальной мембранной матрицы для создания 1:1 подвески. Поместите подвеску на лед.
7. Вводить клетки в соответствии со стандартными протоколами и контролировать рост ксенотрансплантата с помощью стандартных методов⁸.

Эффективность посева
Способность органоидного образования определяется фенотипом и генотипом. Базальные клетки дикого типа (WT) показали превосходную способность органоидного образования (30%-40%) по сравнению с светящимися клетками (3%) (Рисунок 1А). После органоидного установки способность к образованию резко возросла. Как правило, 25%-30% клеток, полученных из органоида WT может образовывать новыйорганоид (Рисунок 1B). CRISPR/Cas9-опосредованные потери Pten (Ptenq /)) или p53 (p53q /)) привели к незначительному увеличению мощности образования органоидов. Потеря как p53, так и Pten дополнительно увеличила мощность образования(рисунок 1B).

Фармакологический ответ
На основе эффективности посева было выполнено посев 1000-10 000 клеток в 35 злител мембранной матричной купола в 24 скважинах. Рекомендуемые номера посева клеток на основе эффективности образования органоидов предусмотрены в таблице 1. Однако, скорость распространения органоидов может сильно отличаться в зависимости от генотипа. Дополнительные изменения в номер елочного посева могут быть сделаны на основе пролиферации.

На рисунке 2влияние антиандрогенных молекул на рост были протестированы в мурин органоидов с различными генотипами. В общей сложности 2500 клеток были посеяны из мурин органоидов с генотипом WT, потеря p53, Pten потери, или двойной p53 и Pten потери. p53 и Pten потеря была инициирована лентивирного введения gRNA ориентации p53 и / или Pten локус в органоидов, составляющих Cas9 под контролем промоутера Rosa26 с C57/Bl6 генетический фон9.

Потеря p53 не вызвала резистентности к антиандрогенным молекулам. Потеря Птена повышенной устойчивостью к антиандрогенным соединениям, как показано ранее10. Двойная потеря p53 и Pten, однако, привела к полной устойчивости к антиандрогену второго поколения(рисунок 2A). ИНгибирование АР также изменило фенотипы органоидов. В управлении Cas9 - органоидов, а также P53/'-удаленныеи Pten/ органоиды, снижение размера проема органоида наблюдалось ( Рисунок 2B). p53/ Птен /- органоиды были фенотипически незатронутыми(Рисунок 2B). В соответствии с этими результатами, когда 1 х 106 клеток были привиты подкожно на фланге, только p53/ Pten/ органоиды выросли (Рисунок 2C). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что p53/Pten //-совместное удаление приводит к резистентности к антиандрогену второго поколения в мурин органоидов.

Органоиды PCa, полученные из пациента, неоднородны в фенотипе и генотипе11,12; поэтому, реакции к снадобьям могут отличать больш между людскими линиями pCa органоидными. На рисунке 3показана антиандрогенная реакция молекул двух различных органов PCa, MSKPCA2 и MSKPCA3. Распространение органов MSKPCA2 сильно подавлялось антиандрогенными молекулами, в то время как органоиды MSKPCA3 оставались без изменений(рисунок 3A,B). Органоиды MSKCPCA2 выражали высокий уровень AR и AR-целевой FKBP5, и они выражали отличительные черты светящихся белков, таких как CK8 и CK18. В отличие от этого, органоиды MSKPCA3 также выразили базальные (CK5) и мезенхимальные (Vimentin) маркеры и не показали выражение FKBP5. Эти результаты свидетельствуют о том, что эти органоиды модели несветящиеся андроген-независимый фенотип.

Рисунок 1: Измерение показателей органоидного образования клеток простаты человека и мыши. (A) Схематический обзор повторной подвески клеток в подвальной мембранной матрице (слева) и органоидном посеве в матричных куполах (справа). (B) Относительное органоидное образование человека (CD49f) полученных базальных и (CD26) полученных светящихся клеток (%, y-оси; среднее SD) в присутствии 1 нМ DHT. В общей сложности 200 клеток были посеяны и количество органоидов было количественно 7 дней после посева (n No 3, Зп злт; 0,01, t-тест). (C) Относительное органоидное образование мурина WT, Pten q/, P53q /q, и P53/Pten /) органоидов (%, y-оси; среднее SD) в присутствии 1 нМ DHT. В общей сложности 200 клеток были посеяны и количество органоидов было количественно 7 дней после посева (n No 3). p53 и Pten потеря была опосредована gRNA ориентации p53 и / или Pten локус в органоидов, выражающих Cas9 constitutively под промоутер Rosa26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Оценка фармакологического ответа органоидов, полученных из генетически модифицированных мышей. (A) Относительная пролиферация клеток мурина WT, Ptenq /,, P53q /,и P53/ Pten/ органоиды ( y-оси, среднее SD, измеряется набором анализа жизнеспособности клетки 7 дней после установления органоиды; (n No 3, зрп злт; 0,05, t-test) с 1 нМ DHT или 10 мкм антиандрогена второго поколения, как указано. (B) Представитель яркие изображения WT, Pten/ q, P53 / /,и P53/ / /органоидных культур, обработанных с 1 нМ DHT или 10 ММ второго поколения анти-андрогенов, как указано. (C) Представитель кривой роста WT, Ptenq /,P53q /,, и P53/Pten /) органоиды вводили подкожно на фланге изогенных C57/Bl6 мышей. Только P53/Pten /- органоиды показали рост. В общей сложности 1 х 106 клеток были введены. Показано, что три независимые кривые P53/Pten /' organoids демонстрируют неоднородность в скорости роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Оценка фармакологической реакции органоидов, полученных биопсией рака простаты человека. (A) Относительная пролиферация клеток органов MSKPCA2 и MSKPCA2(y-axis,среднее SD, измеренная набором анализа жизнеспособности клеток) 5000 клеток 7 дней после установки органоидов (n No 4, p qlt; 0.05, t-test) с 1 нМ DHT или 10 мкм второго поколения анти-андрогенов, как указано. (B) Представитель ярко-поля изображения MSKPCA2 и MSKPCA3 органоидов культур лечение с 1 нМ DHT или 10 ММ второго поколения анти-андрогенов, как указано. (C) Западный анализ помарка AR, FKBP5 (AR-цель гена), CK8 и CK18 (светящиеся маркеры), CK5 (базальный маркер), и Vimentin (мезенхимальный маркер) в MSKPCA2 и MSKPCA3 органоидов. GAPDH использовался в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Цифры посева клеток, используемые для оценки фармакологического ответа на основе способности органоидного образования. Таблица за колонкой (слева направо) включает в себя диапазоны мощностей органоидного образования и соответствующее количество клеток к семени на матричную купол.

Таблица 2: Рекомендуемые номера клеток для экспериментов по ксенотрансплантации органоидов. Колонки слева направо включают абсолютное общее число клеток для 10 инъекций, общий объем PBS Y-27632 для 10 инъекций, объем матрицы мембраны подвала, и номер клетки на инъекцию.

C.L.S входит в совет директоров Novartis; является соучредителем компании ORIC Pharmaceuticals и соучредителем энзалутамид и апалутамида; является научным консультантом Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, КСЗ, Петра и PMV; и является соучредителем компании Seragon, приобретенной Genentech/Roche в 2014 году. W.R.K. является коизобретателем и патентообладателем органоидной технологии.