Методическая статья

Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями

DOI:

10.3791/60359

⸱

31 октября 2019 г.

 , 
1Public Health Research Institute, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микобактерия туберкулеза показывает увеличение производства и высвобождение внеклеточных пузырьков в ответ на низкие железные условия. Эта работа детали протокола для генерации низких железных условий и методов для очистки и характеристики микобактериальных внеклеточных пузырьков, выпущенных в ответ на дефицит железа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микобактерии, в том числе Микобактерии туберкулеза (МТБ), возбудителя туберкулеза человека, естественным образом высвобождают внеклеточные пузырьки (ЭВ), содержащие иммунологически активные молекулы. Знания о молекулярных механизмах везиклового биогенеза, содержании пузырьков и их функциях при патогенно-хост-интерфейсе очень ограничены. Решение этих вопросов требует строгих процедур для изоляции, очистки и проверки EVs. Ранее было установлено, что производство везикл было увеличено, когда М. туберкулез подвергался воздействию ограничения железа, состояние, с которым сталкивается Mtb в принимающей среде. Представлен полный и подробный протокол для изоляции и очистки EVs от железодефицитных микобактерий. Количественные и качественные методы применяются для проверки очищенных ЭВ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микобактериальные внеклеточные пузырьки (MEV) являются мембранными наночастицами, размером 60-300 нм, естественно выделяемых быстро- и медленно растущими микобактериями1. МЕВ, высвобождаемые патогенными микобактериями, представляют собой механизм взаимодействия с хозяином с помощью иммунологически активных белков, липидов и гликолипидов, выделяемых концентрированным и защищенным образом2,3,4. Для характеристики МЭВ и понимания их биогенеза и функций, строгие и эффективные методы очистки везикулы и проверки имеют решающее значение. До сих пор, MEVs были изолированы от культуры фильтратов микобактерий, выращенных в богатых железом среде1,5,6,7,8.

Тем не менее, предыдущая работа показала, что ограничение железа значительно стимулирует высвобождение везикля в Mtb, возможно, для захвата железа с помощью микобактина, siderophore выделяется в MEVs9. Хотя процедуры изоляции МЭВ от Mtb, культивированные в высокой железной среде, были описаны, эффективной методологии получения МЭВ из низкой культуры железа не сообщалось. Таким образом, цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать, очистить и количественно MEVs, полученные из низких культур железа, так что они могут быть использованы для биохимических и функциональных анализов и для анализа генетических детерминантов везиклов производства в микобактериях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка истощенного железом определяемого среднего

  1. Приготовьте 1 л минимальной средней (ММ) путем растворения 5 г KH2PO4,5 г L-аспарагина, 20 мл глицерола и 2 г декстроза в 900 мл деионизированной воды в пластиковом контейнере. Избегайте стекла, чтобы предотвратить загрязнение железа. Отрегулируйте рН до 6,8 с 5 N NaOH и объем до 1 л с водой.
  2. Добавьте 50 г металлической хелатирующей мизины (MCR) и осторожно агитировать с помощью магнитной перемешивания бар для 24 ч при 4 c. Стерилизовать и удалить MCR путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр аудиенции с пластиковым приемником. Для ускорения фильтрации и предотвращения засорения фильтра, пусть осадка отложения около 30 минут до фильтрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда содержит менее 2 мкм остаточного железа, как это определено атомной спектроскопии поглощения.
  3. Дополнение ММ с 0,5 мг/л nCl2, 40 мг/л MgSO4, и 0,1 мг/л MnSO4. Отдельно подготовьте концентрированные запасы (1000x) каждого из металлических добавок в деионизированной воде и стерилизуют путем фильтрации перед мМ добавками. Утюг-обед, металл дополненный MM будет refer here как низкий утюг MM (LIMM).
  4. Из 50 мМ запас FeCl3 растворяется в 10 мМ HCl, добавить 1 мл до 1 л ЛИММ (50 мм конечной концентрации) для подготовки высокой железной ММ (HIMM).

2. Выращивание микобактерий в условиях, ограниченных железом

  1. Оттепели из 50 л замороженных 15% глицерола запасов Mtb и полоса агар пластины дополняется 10% ADN обогащения (5 г / л альбумина, 2 г / л декстроза, и 0,85 г / л хлорид натрия, 0,2% глицерола и 0,05% Tween-80)10. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия, пока не будут видны колонии.
  2. Прививать одну колонию Mtb10 в 2 мл микобактериального бульона среды (Таблица материалов) дополнены обогащения ADN. Инкубировать с возбуждением при 37 градусах Цельсия.
  3. Пусть культура Mtb вырастет до поздней стадии логарифмического (OD540 - 0,8 евро). Чтобы проверить это, измерьте OD540 с помощью спектрофотометра.
  4. Распространение 200 зл и культуры позднего логарифмического на микобактериальные агар пластины(Таблица материалов) дополнены 0,2% глицерола, 0,05% Tween-80, и ADN. Привить не менее 5 пластин. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока бактериальный рост не будет виден как сливовый слой. Это занимает 1 неделю для Mtb.
  5. Влажный стерильный ватный тампон в LIMM. Используйте этот тампон для сбора бактерий из агар пластин и привить 100 мл LIMM для подготовки концентрированной бактериальной подвески с OD540 из 1,0.
  6. Разбавить эту подвеску 10 раз до 1 л с LIMM и разделить его на две, 2 л стерильных пластиковых бутылок, каждая из которых содержит 500 мл культуры.
  7. Выняйте 2 мл культуры и перенесите его в культурную трубку 5 мл. Добавьте 10 зл 10% vol/vol tyloxapol.
  8. Инкубировать культуры при 37 градусов по Цельсию стоя в течение 14 дней.

3. Коллекция МЕВ

  1. Измерьте OD540 культуры 2 мл на момент сбора. Сделать 1:10 серийных разбавления культуры и пластины 100 л каждого разбавления на агар пластины с ADN и 0,05% Tween-80.
  2. Перенесите культуру на пять конических центрифуговых трубок 225 мл и центрифугу при 2850 х г в течение 7 мин при 20 градусах Цельсия.
  3. Соберите культурный супернатант с помощью пипетки 50 мл и фильтр стерилизуйте его через блок фильтра 0,22 мкм.

4. Изоляция МЕВ

  1. Перенесите культурный фильтрат в перемешанную систему ультрафильтрации клеток, расположенную при 4 градусах по Цельсию, и процедите концентрат на уровне 100 кВт с мембраной до 50 мл.
  2. Centrifuge концентрированной культуры фильтрата на 15000 х г в течение 15 минут при 4 кв и собирать супернатант.
  3. Центрифуги культуры фильтрации в поликарбонатных ультрацентрифугных труб при 100000 х г на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  4. Отдохните membranous гранулы в общей сложности 1 мл стерильных фосфатов буферного солей (PBS) путем нежного пипеттинг.
  5. Смешайте 0,5 мл гранулированной подвески, полученной в шаге 4.4 с 1,5 мл 60% раствора йодиксанола, что дает окончательную концентрацию йодиксанола в 45% wt/vol. Распределите эту смесь в нижней части 13 мм х 51 мм полипропилена тонкой стеной ультрацентрифуге трубки.
  6. Наложение MEV-iodixanol 45% подвески с 1 мл 40%, 35%, 30%, 25%, и 20% (vol/vol в PBS) йодиксанол решений и 1 мл PBS в верхней части.
  7. Центрифуга при 100 000 х г на 18 ч при 4 градусах Цельсия.
  8. Соберите 1 мЛ градиентных фракций плотности, начиная с верхней с помощью 1 мл Шприц Гамильтон.
  9. Разбавить каждую собранную фракцию до 20 мл с PBS и центрифугой при 100 000 х г на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  10. Удалить супернатант и приостановить гранулы в 0,5 мл PBS. Храните эту гранулу при 4 градусах Цельсия.

5. Количественная оценка МЕВ

  1. Измерьте концентрацию белка в каждой фракции по анализу Брэдфорда(Таблица материалов),следуя рекомендациям производителя.
  2. Выполняйте мембранный липидный анализ.
    1. Инкубировать 10 злитровую фракцию с флуоресцентным мембранным зондом 1-(4-Триметилламмонимфенил)-6-фенил-1,3,5-Hexatriene р-Toluenesulfonate (TMA-DPH) при конечной концентрации 1 мкг/мл в окончательном 50 мл объема PBS в 96 хорошо черный Пластины.
    2. Инкубировать пластины при 33 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
    3. Измерьте флуоресценцию при 360 нм возбуждении и 430 нм эмиссии.

6. Квалификационный анализ МЕВ

  1. Выполните белковый электрофорез.
    1. Смешайте примерно 1 мкг образцов MEV в 16 л с 4 qL 5x образец погрузки буфера (10% W/V SDS, 10 мм дитиотрейтол, 20% v/v глицерол 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 05% w/v SDS, 10 мМ дитиотрейтол, 20% v/v глицерол 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v
    2. Загрузите в 10% Tris/Glycine SDS-полиакриламид гель11 и запустить на 10 V/cm в бегущий буфер (25 мм Tris базы, 190 мм глицин, 0,1% SDS) до синего красителя фронт достигает нижней части геля.
    3. Пятно гель с ультрачувствительным раствором окрашивания белка (Таблица материалов).
  2. Выполните точечную помотку.
    1. Загрузите 2 злицы подвески МЭВ с концентрацией около 0,5 мкг/Зл, а также двукратные серийные разбавления на мембрану нитроцеллюлозы и процесс для точки пятно в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Используйте антисыворотку, выращенную у мышей, против подготовки МЭВ при разбавлении 1:5,000 в качестве основного антитела и козьего антимышки в сочетании с пероксидазах хрена (HRP) при 1:10,000 разбавления в качестве вторичного антитела. Обнаружение антиген-антител комплексов с соответствующим субстратом HRP Blotting Detection Reagent и системой визуализации.
  3. Выполните отрицательную окрашивание и электронную микроскопию.
    1. Исправить 250 Л МЕВ с 2% глютаральдегида в 0,1 м какодилат при комнатной температуре в течение 2 ч и инкубировать ночь в 4% формальдегида, 1% глутаральдегида, и 0,1% PBS.
    2. Пятно фиксированных образцов с 2% тетроксид осмия в течение 90 мин.
    3. Серийно обезвоживают образец в этаноле и встраивают в эпоксидную смолу Сперра.
    4. Наблюдайте за МЕВ под электронным микроскопом передачи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MEV были очищены дифференциальной осадок в градиент плотности(Рисунок 1, Рисунок 2). В описанных условиях, MEVs разделены главным образом в градиентной фракции 3 (F3), который соответствует 25% йодиксанол. Этот вывод основан на обнаружении белка, мембранного липида, микроскопической визуализации нетронутых МЭВ, распределении размеров наночастиц и положительной реактивности с антивисикулным антисывороткой(рису...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько методов для очистки эукариотических клеток, полученных экзосомы были разработаны12. В отличие от этого, существует ограниченная информация об эффективных методах очистки бактерий полученных EVs7. Эффективная изоляция Mtb-полученных EVs необходимо учитывать внутренние трудности в выращивании этого патогенного микобактерий. Mtb имеет долгое время деления (24 ч) и должны быть обработаны в условиях биобезопасности уровня 3 (BSL-3). Поэтому важно оптимизировать эффекти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Рафаэлю Прадос-Росалесу за то, что он поделился антисерой антисеры МИВ и Навнитом Догра за выполнение анализа отслеживания наночастиц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Amicon stirring cell Model 108EMD MiliporeUFSC40001Cell Система ультрафильтрации
BD Polypropilene 225 мл конические пробиркиFisher05-538-61Конические центрифужные пробирки
Biomax 100 кДа отсечная ультрафильтрационная мембранаEMD MiliporePBHK07610Ультрафильтрационная мембрана
Chelex-100 смолаBio-Rad142-2842Металл хелатная смола
Middlebrook 7H10 АгарBD Difco262710Микобактериальные агаровые пластины
Middlebrook 7H9 БульонBD Difco271310Микобактериальный бульон среда
Нитроцеллюлоза блоттинговая мембранаGE Healthcare10600001Блоттинговая мембрана
OptiprepSigmaD1556Йодиксанол
поликарбонат ультрацентрифугирование пробирки 25 мм x 89 ммBeckman Coulter355618Поликарбонатные ультрацентрифужные пробирки 25 мм x 89 мм
Полипропиленовая тонкостенная центрифужная трубка 13 мм x 15 ммBeckman Coulter344059Полипропиленовая тонкостенная центрифужная трубка 13 мм x 15 мм
Пробирный краситель для анализа белкаBioRad5000006Bradford Protein Staining
SYPRO RubyMolecular ProbesS12000Сверхчувствительные белковые красители
TMA-DPHМолекулярные зондыT2041-(4-триметиламмониумфенил)-6-фенил-1,3,5-гексатриен p-толуолсульфонат
Вакуумные фильтрующие колбыCellProV50022Фильтрующий блок

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778(2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
  10. Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
  11. Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
  12. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Iron LimitationMycobacterium tuberculosisVesicle IsolationDifferential CentrifugationDensity GradientNanoparticle AnalysisProtein DetectionLipid AnalysisBSL 2 Facilities

Похожие статьи