Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Полу-высокой пропускной способ визуализации и инструментвизуализации данных для анализа C. elegans эмбрионального развития

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60362

⸱

29 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа описывает полу-высокой пропускной протокол, который позволяет одновременное 3D замедленной визуализации эмбриогенеза в 80-100 C. elegans эмбрионов в одном ночном запуске. Кроме того, для оптимизации анализа данных включены инструменты обработки изображений и визуализации. Сочетание этих методов с пользовательскими штаммами репортера позволяет детально контролировать эмбриогенез.

Аннотация

C. elegans является главным системой систематического анализа спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий во время эмбрионального развития. Одна из проблем заключается в том, что эмбриогенез динамически разворачивается в течение примерно 13 ч; эта полудневная шкала времени ограничила масштабы экспериментов, ограничив количество эмбрионов, которые могут быть изображены. Здесь мы описываем полу-высокой пропускной протокол, который позволяет для одновременного 3D промежуток времени изображения развития в 80-100 эмбрионов при умеренном разрешении времени, от до 14 различных условиях, в одном ночном запуске. Протокол прост и может быть реализован любой лабораторией с доступом к микроскопу с возможностью посещения точки. Полезность этого протокола демонстрируется с помощью его изображения двух специально построенных штаммов, выражающих флуоресцентные маркеры, оптимизированные для визуализации ключевых аспектов спецификации зародышевого слоя и морфогенеза. Для анализа данных была создана пользовательская программа, которая выводит отдельные эмбрионы из более широкого поля зрения во всех каналах, z-шагах и тайм-пойнтах и сохраняет последовательности для каждого эмбриона в отдельный стек tiff. Программа, которая включает в себя удобный графический пользовательский интерфейс (GUI), упрощает обработку данных путем изоляции, предварительной обработки и равномерной ориентации отдельных эмбрионов в рамках подготовки к визуализации или автоматизированного анализа. Также поставляется макрос ImageJ, который собирает индивидуальные данные эмбриона в многопанельный файл, который отображает максимальную интенсивность флуоресценции проекции и яркие изображения поля для каждого эмбриона в каждый момент времени. Протоколы и инструменты, описанные в этом вопросе, были проверены с помощью их характеристики эмбрионального развития после стука 40 ранее описанных генов развития; этот анализ визуализировал ранее аннотированные фенотипы развития и выявил новые. Таким образом, эта работа детали полу-высокой пропускной способ визуализации в сочетании с программой обрезки и ImageJ визуализации инструмент, который, в сочетании с штаммами, выражающими информативные флуоресцентные маркеры, значительно ускоряет эксперименты для анализа эмбрионального развития.

Введение

Эмбрион C. elegans является важной модельной системой для механистической клеточной биологии и анализа спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий, движущих эмбриональное развитие1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. На сегодняшний день большая часть характеристиккаки как клеточного уровня событий и клеточной судьбы спецификации в эмбрионе была достигнута с использованием относительно высокого временного разрешения один на время изображений экспериментов (т.е. приобретение каждые 10-100 с) эмбрионов выражения флуоресцентные маркеры. Хотя этот подход хорошо подходит для событий на срокотдок до десятков минут, он становится технически ограничивающим для характеристики более длительных процессов, на порядок часов до нескольких дней. Эмбриональное развитие от первого расщепления до конца удлинения занимает около 10 ч. В этом временном масштабе, полу-высокой пропускной связи методы, которые позволили бы одновременное снижение времени изображения (т.е. приобретение на 5-20 минут интервалов времени) больших когорты эмбрионов, из различных условий, откроет новый спектр экспериментов; например, проведение систематических крупномасштабных скрининговых усилий и анализ достаточного количества эмбрионов для сопоставления последствий молекулярных возмущений.

Здесь мы описываем полувысокой пропускной способ мониторинга c. elegans embryogenesis, который позволяет одновременно еженедельную 3D-временную визуализацию развития в 80-100 эмбрионах, от до 14 различных условий, в одном ночном запуске. Протокол прост в реализации и может быть выполнен любой лабораторией с доступом к микроскопу с возможностями посещения точек. Основные шаги в этом протоколе изложены на рисунке 1. Короче говоря, эмбрионы вскрыты от gravid взрослых, выражающих флуоресцентные маркеры интереса и передачи молодых эмбрионов (2-8 клеточной стадии) в колодцы 384-хорошо пластины для визуализации. В этом формате относительно небольшой размер воронки эмбрионов в узкую область, что облегчает идентификацию полей, содержащих несколько эмбрионов для замедленной визуализации. Для поддержания примерно синхронного развития в когорте эмбрионов, вскрытия выполняются в охлажденных носителях и пластина удерживается на льду, что предотвращает значительное развитие в течение часового времени вскрытия. Пластина передается в микроскоп и эмбрионы снимаются в температурно-контролируемой комнате на ночь, с интервалом в 20 минут, используя 60x погружение маслом 1.35 NA объектив, чтобы собрать полный z-диапазон в 2 мкм шагов. Пятьдесят полей, каждый из которых содержит от 1 до 5 эмбрионов, изображены в одном ночном запуске. В зависимости от желаемого эксперимента, разрешение времени может быть увеличено (например, изображение с интервалом 5-10 минут) за счет пропорционального уменьшения количества изображенных полей.

С помощью этого протокола даже один ночной запуск генерирует значительный объем данных (80–100 эмбрионов, разбросанных по 50 полям), и более крупные эксперименты могут быстро стать неуправляемыми в отношении анализа данных. Для облегчения обработки, визуализации и оптимизации анализа этих данных была создана программа для обрезки и ориентации эмбрионов и выполнения предобработки (необязательно), а также макрос ImageJ, который собирает данные для упрощения просмотра. Эти программы могут быть использованы для обработки изображений, собранных с помощью обычных подходов, так как они не зависят от метода визуализации, требующего только одной плоскости яркого поля. Первая программа использует 4D-поле, содержащее несколько эмбрионов (опция GUI или исходный код embryoCrop.py) или несколько 4D полей, содержащих несколько эмбрионов (screenCrop.py), плотно выращивают эмбрионы и ориентируют их в передне-задней конфигурации. Эти программы также дают пользователям возможность выполнять фоновое вычитание, коррекцию дрейфа и коррекцию затухания. Полученные файлы равномерно предварительно обработаны, плотно обрезанные стеки tiff для каждого эмбриона, которые поддаются изменению автоматизированного анализа изображений. Чтобы сделать его проще для просмотра всех эмбрионов для каждого состояния, ImageJ макрос (OpenandCombine'embsV2.ijm) был написан, который собирает все эмбрионы из данного состояния в один стек тифф и массивы яркие изображения поля и максимальной интенсивности проекции цвета ( RGB) накладки, бок о бок, для каждого эмбриона. Методы были проверены с помощью их для характеристики эмбрионального развития после нокдауна 40 ранее описанных генов развития в паре специально построенных штаммов, выражающих флуоресцентные маркеры, оптимизированные для визуализации ключевых аспектов зародышевого слоя спецификации и морфогенеза10,11. В совокупности полувысокой пропускной процесс обработки эмбрионов и инструменты обработки изображений позволят проводить эксперименты с более высоким числом образцов и проводить крупномасштабные скрининговые усилия, направленные на понимание процессов развития. Кроме того, эти штаммы также обеспечат эффективное средство для изучения влияния молекулярных возмущений на эмбриогенез.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка C. elegans Эмбрионы для полу-высокой пропускной записи изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этой части протокола заключается в загрузке популяции полусинхронизированных (от 2 до 8-клеточной стадии) C. elegans эмбрионов, расчлененных из подходящих штаммов маркера(рисунок 2), в стеклянно-нижней 384-коловидной пластины для визуализации. Другие форматы пластин также могут работать, но 384 пластины скважины являются предпочтительными, поскольку небольшой размер скважины ограничивает распространение эмбрионов на относительно небольшой площади, что облегчает идентификацию полей, содержащих несколько эмбрионов для визуализации замедленного действия. Грубо синхронизация эмбрионов гарантирует, что полный ход развития будет захвачен для каждого из эмбрионов в поле.

  1. Подготовка 5-10 мл 0,1 мг/мл раствор атрамизолгидрорида (TMHC) анестезии, растворенного в ледяной среде M9 (0,45 М Na2HPO47H2O, 0.11 M KH2PO4, 0.04 M NaCl, 0.09 M NH4Cl) для использования во время использования во время использования во время рассечение и визуализация. Это носитель включает в себя анестезию, чтобы движущиеся вылупившихся личинок не нарушали визуализацию эмбрионов на более ранних стадиях развития.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании инструментов обрезки и визуализации для анализа данных, полученных с помощью стандартных методов монтажа агарозной площадки, перейдите вперед к разделу 3 ниже.
  2. Aliquot 70 л подготовленного раствора в отдельные скважины стеклянно-нижней 384-луковой пластины с одной скважиной для каждого состояния; избегать внешних двух рядов пластины, чтобы предотвратить эффекты края.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно маскировать окружающие колодцы с помощью клейкой фольги ПЦР (см. пример на рисунке 1D),это сохраняет соседние скважины для будущих экспериментов и облегчает поиск соответствующих скважин под микроскопом вскрытия. После того, как раствор aliquoted, держать пластину и оставшийся раствор на льду во всем вскрытии.
  3. Создание рот pipets для переноса эмбрионов из депрессии слайд (где gravid гермафродиты вскрыты) в колодцы. Потяните капиллярные pipets (25 л откалиброванных pipets) над пламенем и перерыв для создания тонкой конической конца(рисунок 1D). Для предотвращения перекрестного загрязнения необходим один пайпет для предотвращения перекрестного загрязнения; отказаться от трубы после использования.
  4. Используйте тонкие пинцеты для передачи 10 gravid взрослых под рассечение сферы в 150 злиц ледяной TMHC решение aliquoted на депрессии слайд для каждого состояния. Используя пинцет и скальпель, вскрыть червей, чтобы освободить эмбрионы.
  5. Загрузите вытянутую трубу капилляра в крепление аспиратора, включенное в pipets, и рот пипетку для передачи всех 2 до 8-клеточной стадии эмбрионов в отдельный колодец подготовленной пластины(Рисунок 1D). Избегайте переноса эмбрионов поздней стадии и вскрытия мусора. Изучите под областью вскрытия и если агрегаты эмбрионов присутствуют, рот пипетка вверх и вниз или кран скопления эмбрионов с трубчатым кончиком разойтись.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения перекрестного загрязнения, чистое оборудование вскрытия и использовать свежий рот пипетка при перемещении между условиями. Храните тарелку на льду между вскрытиями.
  6. После того, как черви из всех условий были вскрыты и эмбрионы помещены в их соответствующие хорошо, спина 384-хорошо пластины в течение 1 мин на 600 х г, чтобы урегулировать эмбрионов.
  7. Протрите дно пластины с этанол пропитанной салфеткой, чтобы удалить любые остатки и поместить пластину на конфокальный микроскоп, оснащенный держателем пластины в температурно-контролируемой среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, которые следуют подробно этот метод с помощью лабораторной установки; пожалуйста, измените условия приобретения в соответствии с экспериментальными потребностями и оборудованием. Здесь используется конфокальная коробка сканера, оснащенная двойным вращающимся диском Nipkow с двойным спиннингом, 512 x 512 EM-CCD, высокоточной автоматической XY-Stage (специально еде есеное разрешение 0,1 мкм) и моторизованным управлением z-оси (специально еде 0,1 мкм). Эта система хранится в комнате 16 градусов по Цельсию, которая поддерживает температуру микроскопа между 21 и 23 градусами Цельсия во время ночной визуализации.
  8. Чтобы определить поля с подходящими эмбрионами, выполните предварительное сканирование каждой скважины с помощью объективного и подходящего программного обеспечения для визуализации 10x 0.4 NA. Наиболее оптимальные поля будут содержать более одного эмбриона ранней стадии, который находится в той же фокусной плоскости, что и другие эмбрионы, и в идеале будет иметь минимальный контакт между соседними эмбрионами. Отметьте позиции подходящих регионов.
  9. Чтобы выбрать поля изображений, переключитесь на цель 60x и отрегулируйте фокусную плоскость в каждом посещении точки, чтобы надлежащим образом снести эмбрионы. 1-4 поля на скважину изображены, в общей сложности 50 полей в 14 скважинах, и каждое поле может содержать от одного до пяти эмбрионов. В целом, от 4 до 15 эмбрионов выбираются из каждого состояния для визуализации с высоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевой переменной на этом этапе является использование достаточного количества нефти; поместите нефть на цель, посещая точки в каждой скважине, чтобы распределить нефть вокруг поверхности всех скважин, а затем применить дополнительное падение нефти к цели до выбора месторождений.
  10. Изображение выбранных полей с помощью 60x 1.35 NA цель приобрести 18 z разделов с интервалом 2 мкм каждые 20 минут в течение 10 ч. Условия визуализации с использованием зародышевого слоя и морфогенеза репортер штаммов являются следующими: яркое поле, 90% мощности, 25 мс, 20% прироста; 488 нм, 100% мощность, 200 мс, 60% прироста; 568 нм, 45% мощности, 150 мс, 60% прироста.
  11. После завершения визуализации оцените эмбриональную летальность, выполнив низкое увеличение (10х 0,4 NA objective) цельное яркое сканирование 20-24 ч после начала ночной визуализации.

2. Эмбриональный Летальность Скоринг

  1. Используя 10x отсканированные поля, оцените эмбриональную летальность и личиночные дефекты, подсчитав вылупившихся червей и невылупившихся эмбрионов для каждой скважины.
  2. Оценка unhatched эмбрионов, как эмбриональный смертельный. Исключить арестованных одно- до четырехклеточных эмбрионов от количества летальности, так как молодые расчлененные эмбрионы иногда не могут завершить образование яичной скорлупы (если мейоз II еще не завершен) и дефекты проницаемости могут привести к осмотическим осложнениям в течение первых двух Подразделений.
  3. Оценка частично вылупились или полностью вылупившихся червей с морфологией тела или поведенческими дефектами, такими как свалочный или парализованный, как «аномальные личинки».

3. Автоматизированная обрезка(рисунок 3A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение размещается в двух местах: (1) Зенодо дома удобной версии программного обеспечения12, который не требует каких-либо знаний программирования. (2) Github содержит исходный код для нашего embryoCropUI.py и screenCrop.py программного обеспечения13, которые требуют знания с Python. Подробные инструкции по загрузке и эксплуатации обеих версий программы можно найти ниже.

  1. Автоматизированная обрезка с использованием исказуемой версии embryoCropUI (удобная версия)
    1. Чтобы использовать программу embryoCropUI, сначала скачать программу из Зенодо(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12.
      1. Скачать версию формата MacOS или Windows (обратите внимание, что версия MacOS требует MacOS X10.11 или выше).
      2. Загрузите файл инструкций(GUI-Инструкции-zenodo'repoV2.docx),который обеспечивает пошаговую инструкцию для тестирования и использования программы embryoCropUI.
      3. Загрузите test'files.zip, чтобы проверить, правильно ли программа функционирует на платформе (см. инструкции).
    2. После загрузки, распаковать и перемещаться, чтобы найти embryoCropUI исполняемые (...»embryoCropUI »WINDOWS-embryoCropUI.exe) или (...»embryoCropUI'MacOS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe). Двойной клик, чтобы запустить (или выбрать "открыть с" терминала) и запустить embryoCropUI исполняемых.
    3. GUI исполняемых культур один 4D поле зрения в то время. В верхнем левом углу выберите открытую кнопку для загрузки определенного поля на обрез (мультитиф). Если обрезка серии tiff, с несколькими измерениями (т.е., z, время, канал), загрузите только первое изображение в серии в папке (одна серия tiff в папку).
    4. После загрузки изображений укажите следующую информацию: количество z-ломтиков, (я), количество точек времени (T), количество каналов (C), канал, который соответствует DIC или яркое поле (первый No1, второй и т.д.).
    5. Выберите дополнительную обработку для выполнения изображений. Программа предлагает коррекцию дрейфа, фоновое вычитание и коррекцию затухания.
    6. Укажите параметры фонового вычитания и коррекции затухания, чтобы направлять усилия по обработке в запросе GUI. Для фоновых вычетов определите размер самого большого объекта, отражающий размер значимого сигнала; этот размер функции не должен рассматриваться как фон и должен быть нечетным значением числа. Ввугатите значение от 0-1 для коррекции затухания. Значение коррекции затухания отражает процент первоначальной интенсивности, которая остается на самой дальней глубине изображенного объекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновое вычитание и коррекция затухания должны работать вместе.
    7. Укажите порядок сбора изображений (т.е. канал-z-время (czt) или z-канал-время (zct)).
    8. Укажите микроны на пиксель для изображений на основе используемой камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плохое обрезка изображений произойдет, если размер пикселя не определен должным образом.
    9. Выберите Выполнить в левом нижнем углу. Новый субфолдер с пометкой с надписью "crop" будет создан в том же пути, что и необрезанная папка; обрезанные версии будут сохранены в этом месте. В зависимости от размера файла, обрезка должна завершиться в течение нескольких секунд до нескольких минут.
  2. Автоматизированная обрезка с использованием screenCrop.py (пакетная альтернатива эмбрионам, описанная выше;Python подкованных пользователей только)10,13
    1. Чтобы использовать screenCrop.py, версия программного обеспечения Python для обрезки больших наборов данных в пакетном формате, клонирования или загрузки исходного кода из Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
    2. Прочитайте инструкции по настройке правильной виртуальной среды и следуйте описанной системе именования файлов; оба из них подробно описаны в файле README в репозитории Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
    3. После того, как экологические переменные и соглашения о наименовании были надлежащим образом установлены, открытые parameters.py и screenCrop.py в редакторе по выбору.
    4. Чтобы изменить регулируемые параметры, не касаясь исходного кода, откорректировать parameters.py файл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: можно также непосредственно изменять параметры в заголовке screenCrop.py.
      1. При использовании файла конфигурации parameters.py, измените настройку настройки использования на True. При использовании прямого редактирования в течение screenCrop.py, оставьте настройку use'configure на False.
      2. Найдите следующую информацию в файле parameters.py и внедните изменения в соответствии с желаемыми параметрами изображения и структурой файлов:
        1. loadFolder (линия 9): Изменение диска, на котором хранятся файлы (например, ::,, D:// и т.д.)
        2. Дата (строка 7): Изменение папки, содержащей файлы для сеанса визуализации. Это называется «Имя экспериментального Фолдера» в файле отслеживания CSV (см. инструкции).
        3. trackingFile (строка 11): Изменение пути к файлу CSV, в котором хранится информация об эксперименте.
        4. z (линия 13): Установить как количество z самолетов.
        5. nT (линия14): Установить количество таймтов.
        6. nWells (линия 19): Установите как количество используемых скважин.
        7. pointVisits (линия 20): Установить в качестве максимального числа посещений точки (за хорошо).
        8. В строке 10 найдите местоположение, занимаемое в настоящее время 'CV1000/' и ввведайте внешнюю папку, используемую в пути файла. Чтобы избежать проблем, используйте следующую конвенцию: 'XXXXXXX/'.
        9. В строке 12 ввейди допустимый путь файла для хранения данных о соотношении сторон для обрезанных данных.
        10. В строках 15, 16, 17 и 18 входных True/False для того, проходят ли изображения через следующую обработку:
          1. Вход True или False для коррекции дрейфа на линии 15.
          2. Ввод True или False для фонового вычета на строке 16. Размер объекта должен быть эмпирически определен для различных штаммов маркеров и размеров пикселей. В конфигурации здесь размер функции был определен как 41 для штамма Germ-Layer и 201 для штамма Morphogenesis. Фоновая вычитание должно быть сделано в сочетании с коррекцией затухания.
          3. Вход True или False для коррекции затухания на строке 17.
          4. Ввод True или False для переднего заднего вращения на линии 18.
    5. Как только все изменения были сделаны, обрезка может начаться. Для этого, переключиться на screenCrop.py и выбрать значок игры в панели инструментов, в выпадающем меню выберите Run Как
    6. Поскольку обрезка может занять несколько часов для большого набора данных (50 пунктов посещения 18 z шагов, 3 канала, 31 тайм-пойнт), отслеживать ход обрезки в окне консоли. После завершения обрезки небольшое окно покажет предварительные просмотры обрезанных изображений перед сохранением. Для каждого изображения есть 3 варианта:
      1. Сохранить: Пресс-панель пространства, чтобы сохранить изображение, если изображение обрезается должным образом без каких-либо областей, представляющих интерес быть отрезаны.
      2. X: Нажмите X, если изображение, как представляется, области, представляющие интерес отрезали; изображение будет сохранено с X перед именем, чтобы отделить его от других изображений.
      3. Удалить: Нажмите D, чтобы удалить обрезанное изображение, если изображение не обрезано должным образом или эмбрион не является удовлетворительным.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения будут сохранены в subfolder под названием "Обрезанный" в Load Folder (определяется в строке 9 программы).

4. Визуализация(рисунок 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: OpenandCombine'embsV2.ijm10,12 является Macro ImageJ, который будет строить простой для просмотра файл айф из всех изображений для конкретного напряжения и состояния. Требуется установка FIJI/ImageJ14,15. Этот макрос работает в соответствии с нашей структурой файлов; его необходимо будет модифицировать для работы с другими файлофайлными структурами. Руководство по надлежащей структуре файлов и подробное описание важных соображений можно найти в конце GUI-Инструкции-zenodo-repoV2.docx файла на репозиторий Зенодо. Пожалуйста, прочитайте эти инструкции полностью перед визуализацией, чтобы правильно имя и структура файлов, чтобы лучше всего взаимодействовать с этим макросом. Для справки, наша структура местоположения файла выглядит следующим образом:
Вопрос: «обрезанный»-Таргет»-Эмб»-Эмб»-15 Дигит уникальный идентификатор «W»#F »T»#_Z.#_C.tif
т.е. ::«Обрезанный»EMBD0001»GLS-Emb1-EMB1-20140327T135219

  1. Скачать OpenandCombine'embsV2 и GUI-Инструкции-zenodo'repoV2.docx от Зенодо (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
  2. Подготовьте следующую информацию:
    -Место, где хранятся папки изображения (после обрезки).
    - Имя папки изображения (ы) для обработки конкретного состояния (ы) (т.е. EMBD0002). Это называется «Цель» в приведенном выше примере
    -15-значный альфа-числовой уникальный идентификатор, который специфичен для данного ночного эксперимента , этот идентификатор является именем папки для получения данных (т.е. 20140402T140154) и уникальный идентификатор встроен в индивидуальное имя файла tiff (EMBD0002 20140402T140154-W06F2-T01'01-C1) за каждый эмбрион, изображенный в этот день. Макрос использует этот идентификатор для проверки эмбрионов, приобретенных в один и тот же день, и может собирать повторяющиеся условия с отдельными датами в отдельные файлы ImageJ.
  3. Открыть ImageJ, и перетащите и падение макрофайла, OpenandCombine'embsV2.ijm, в бар ImageJ, или открыть макрос напрямую.
  4. Как только макрос открыт, найдите линии 3 и 4. Ввод информации, собранной в разделе 4.2) в соответствии со следующими шагами:
    1. В строке 3 (RNAL) ввейте целевое имя для обработки изображений. Ввод каждой цели в следующую структуру newArray ("XXXXXXXXXX/"); включают цитаты. Для запуска нескольких условий одновременно, отделиться от запятой и сохранить все целевые имена в скобках (т.е., newArray ("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
    2. В строке 4 (дата) ввводите 15-значный альфа-числовой уникальный идентификатор в котировках, например newArray ("20140402T140154").
  5. Пресс-запуск в левом нижнем углу окна макроса. Появится окно, которое запустит запрос для навигации по внешней папке, содержащей обрезанные папки изображения (указано в 4.4.1).
  6. После выбора появится еще одно окно, которое позволит спецификации параметров изображения.
    1. Введите количество каналов, количество срезов, размер шрифта для текста, используемого при маркировке компилированных изображений, и цвет для каждого из каналов.
    2. Проверка автоматического контрастирования/выключения во всех каналах.
  7. После того, как все параметры были определены, нажмите OK в нижней части окна. Составной файл начнет собираться; это займет несколько минут, на условие, чтобы завершить.
  8. После завершения, просмотрите файлы, которые остаются открытыми при желании. Они могут быть закрыты без сохранения, так как макрос уже сохранил файлы в недавно созданной папке, которая названа следующим образом: имя внешней папки (указано в запросе раздела 4.5) обрезанный-фиджи-обработанный-выход-EMBD0002-GLS-20140402T140154.tif).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Значительная проблема в характеристике влияния молекулярных возмущений на эмбриональное развитие C. elegans заключается в том, что эмбрионам требуется около 10 ч, чтобы прогрессировать от первого расщепления до конца удлинения при 20'16. Полу-высокой пропускной метод, в котором большие когорты эмбрионов могут быть одновременно изображены полезно для событий в этом временном масштабе, поскольку это позволяет изображения нескольких условий параллельно с достаточным размером ансамбля для каж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта работа описывает набор инструментов и методов, которые были разработаны для того, чтобы позволить более масштабные усилия по профилировать функции генов в эмбриональном развитии в C. elegans. Наш метод полувысокой пропускной записи позволяет 3D-замедленной визуализации эмбрионального развития при разрешении 20 мин для 80-100 эмбрионов в одном эксперименте. Хотя этот протокол может быть адаптирован для использования с любым желаемым штаммом маркера (ы), эта работа демонстрирует потенциал метода с использовани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

S.D.O. была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук под эгидой Калифорнийского университета Сан-Диего Институциональные исследования и академическое развитие карьеры премии (NIH/ IRACDA K12 GM068524). A.D. и K.O. были поддержаны Институтом Людвига по исследованию рака, который также предоставил им финансирование исследований, используемых для поддержки этой работы. Мы благодарны Эндрю Чисхолму за его советы на ранних этапах этого проекта, Рональду Биггсу за вклад в этот проект после начальной стадии разработки метода, и Дэйву Дженкинсу и Энди Шиау за поддержку и доступ к открытию малых молекул высокососодержание системы визуализации группы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аспираторная трубка в сбореDrummond Scientific2-000-000
Калиброванная пипетка (25 мл)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager Программное обеспечениеYokogawa Electric CorpВ комплекте с конической трубкой CV1000
(15 мл)США Scientific1475-0501
Микроскоп CV1000Yokogawa Electric CorpCV1000
Депрессионное стекло (3 лунки)Erie Scientific1520-006
Диссекционный микроскопNikonSMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab Подготовленоhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Микроцентрифужная пробирка (1,5 мл)США Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealSeal Bio-RadMSF1001
NGM PlatesLab Preparedhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 лунка, F-дно, Стеклянное дноGreiner Bio-One781855
тетрамизола гидрохлоридSigma AldirchT1512-10G Пинцет
, Dumont #3Электронная микроскопия Sciences0109-3-PO
U-PlanApo объектив (10&x; 0,4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo объектив (60× 1,35 NA)Olympus1-U2B832

Ссылки

  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
  3. Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948(2012).
  4. Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
  5. Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
  6. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
  7. Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
  8. Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
  9. Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
  10. Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
  11. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
  12. Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
  13. Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
  17. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
  18. Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
  19. Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848(2010).
  20. Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
  21. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
  22. Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
  23. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
  24. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
  25. Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D-таймлапс визуализацияпрограмма для кроппинга эмбрионовинструментарий для визуализации ImageJлинии с флуоресцентными маркерамиконфокальная микроскопияавтоматизированный анализ данныхскрининг на основе РНК-интерференциипротокол подготовки эмбрионов
Полу-высокой пропускной способ визуализации и инструментвизуализации данных для анализа C. elegans эмбрионального развития
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.