Method Article

Полу-высокой пропускной способ визуализации и инструментвизуализации данных для анализа C. elegans эмбрионального развития

DOI:

10.3791/60362

⸱

October 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа описывает полу-высокой пропускной протокол, который позволяет одновременное 3D замедленной визуализации эмбриогенеза в 80-100 C. elegans эмбрионов в одном ночном запуске. Кроме того, для оптимизации анализа данных включены инструменты обработки изображений и визуализации. Сочетание этих методов с пользовательскими штаммами репортера позволяет детально контролировать эмбриогенез.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans является главным системой систематического анализа спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий во время эмбрионального развития. Одна из проблем заключается в том, что эмбриогенез динамически разворачивается в течение примерно 13 ч; эта полудневная шкала времени ограничила масштабы экспериментов, ограничив количество эмбрионов, которые могут быть изображены. Здесь мы описываем полу-высокой пропускной протокол, который позволяет для одновременного 3D промежуток времени изображения развития в 80-100 эмбрионов при умеренном разрешении времени, от до 14 различных условиях, в одном ночном запуске. Протокол прост и может быть реализован любой лабораторией с доступом к микроскопу с возможностью посещения точки. Полезность этого протокола демонстрируется с помощью его изображения двух специально построенных штаммов, выражающих флуоресцентные маркеры, оптимизированные для визуализации ключевых аспектов спецификации зародышевого слоя и морфогенеза. Для анализа данных была создана пользовательская программа, которая выводит отдельные эмбрионы из более широкого поля зрения во всех каналах, z-шагах и тайм-пойнтах и сохраняет последовательности для каждого эмбриона в отдельный стек tiff. Программа, которая включает в себя удобный графический пользовательский интерфейс (GUI), упрощает обработку данных путем изоляции, предварительной обработки и равномерной ориентации отдельных эмбрионов в рамках подготовки к визуализации или автоматизированного анализа. Также поставляется макрос ImageJ, который собирает индивидуальные данные эмбриона в многопанельный файл, который отображает максимальную интенсивность флуоресценции проекции и яркие изображения поля для каждого эмбриона в каждый момент времени. Протоколы и инструменты, описанные в этом вопросе, были проверены с помощью их характеристики эмбрионального развития после стука 40 ранее описанных генов развития; этот анализ визуализировал ранее аннотированные фенотипы развития и выявил новые. Таким образом, эта работа детали полу-высокой пропускной способ визуализации в сочетании с программой обрезки и ImageJ визуализации инструмент, который, в сочетании с штаммами, выражающими информативные флуоресцентные маркеры, значительно ускоряет эксперименты для анализа эмбрионального развития.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбрион C. elegans является важной модельной системой для механистической клеточной биологии и анализа спецификации судьбы клеток и морфогенетических событий, движущих эмбриональное развитие1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. На сегодняшний день большая часть характеристиккаки как клеточного уровня событий и клеточной судьбы спецификации в эмбрионе была достигнута с использов....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка C. elegans Эмбрионы для полу-высокой пропускной записи изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этой части протокола заключается в загрузке популяции полусинхронизированных (от 2 до 8-клеточной стадии) C. elegans эмбрионов, расчлененных из подходящих штаммов маркера(рисунок 2), в стеклянно-нижней 384-коловидной пластины для визуализации. Другие форматы пластин также могут работать, но 384 пластины скважины являются предпочтительными, поскольку небольшой размер скважины ограничивает распространение эмбрионов на относительно небольшой площади, что облегчает идентификацию полей, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значительная проблема в характеристике влияния молекулярных возмущений на эмбриональное развитие C. elegans заключается в том, что эмбрионам требуется около 10 ч, чтобы прогрессировать от первого расщепления до конца удлинения при 20'16. Полу-высокой пропускной метод, в котором большие когорты эмбрионов могут быть одновременно изображены полезно для событий в этом временном масштабе, поскольку это позволяет изображения нескольких условий параллельно с достаточным размером ансамбля для каж.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа описывает набор инструментов и методов, которые были разработаны для того, чтобы позволить более масштабные усилия по профилировать функции генов в эмбриональном развитии в C. elegans. Наш метод полувысокой пропускной записи позволяет 3D-замедленной визуализации эмбрионального развития при разрешении 20 мин для 80-100 эмбрионов в одном эксперименте. Хотя этот протокол может быть адаптирован для использования с любым желаемым штаммом маркера (ы), эта работа демонстрирует потенциал метода с использовани.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.D.O. была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук под эгидой Калифорнийского университета Сан-Диего Институциональные исследования и академическое развитие карьеры премии (NIH/ IRACDA K12 GM068524). A.D. и K.O. были поддержаны Институтом Людвига по исследованию рака, который также предоставил им финансирование исследований, используемых для поддержки этой работы. Мы благодарны Эндрю Чисхолму за его советы на ранних этапах этого проекта, Рональду Биггсу за вклад в этот проект после начальной стадии разработки метода, и Дэйву Дженкинсу и Энди Шиау за поддержку и доступ к открытию малых молекул высокососодержание системы визуализации группы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Аспираторная трубка в сбореDrummond Scientific2-000-000
Калиброванная пипетка (25 мл)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager Программное обеспечениеYokogawa Electric CorpВ комплекте с конической трубкой CV1000
(15 мл)США Scientific1475-0501
Микроскоп CV1000Yokogawa Electric CorpCV1000
Депрессионное стекло (3 лунки)Erie Scientific1520-006
Диссекционный микроскопNikonSMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab Подготовленоhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Микроцентрифужная пробирка (1,5 мл)США Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealSeal Bio-RadMSF1001
NGM PlatesLab Preparedhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 лунка, F-дно, Стеклянное дноGreiner Bio-One781855
тетрамизола гидрохлоридSigma AldirchT1512-10G Пинцет
, Dumont #3Электронная микроскопия Sciences0109-3-PO
U-PlanApo объектив (10&x; 0,4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo объектив (60× 1,35 NA)Olympus1-U2B832

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic DevelopmentSemi high throughput Imaging3D Time lapse ImagingEmbryo Cropping ProgramImageJ Visualization ToolkitFluorescent Marker StrainsConfocal MicroscopyAutomated Data AnalysisRNAi based ScreeningEmbryo Preparation Protocol

Related Articles