Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60384

⸱

4 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Northwestern University, 2National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для генерации первичных органов эндометрия, которые состоят из эпителиальных и стромальных клеток и сохраняют характеристики родной ткани эндометрия. Этот протокол описывает методы от приобретения тканей матки до гистологической обработки эндометрийных органоидов.

Аннотация

Эндометрий человека является одним из самых гормональны реагировать тканей в организме и имеет важное значение для установления беременности. Эта ткань также может стать больной и вызвать заболеваемость и даже смерть. Модельные системы для изучения биологии эндометрия человека были ограничены системами культуры in vitro одного типа клеток. Кроме того, эпителиальные клетки, один из основных типов клеток эндометрия, не распространяются хорошо или сохранить свои физиологические черты в культуре, и, таким образом, наше понимание биологии эндометрия остается ограниченным. Мы впервые создали органоиды эндометрия, которые состоят как из эпителиальных, так и из стромальных клеток эндометрия человека. Эти органоиды не требуют каких-либо экзогенных материалов эшафот и специально организовать так, что эпителиальные клетки охватывают сфероидной структуры и становятся поляризованными с стромальных клеток в центре, которые производят и выделяют коллаген. Эстроген, прогестерон и андрогенные рецепторы выражаются в эпителиальных и стромальных клетках и лечение физиологическими уровнями эстрогена и тестостерона способствуют организации органоидов. Эта новая модель системы может быть использована для изучения нормальной биологии эндометрия и болезней таким образом, что не было возможно раньше.

Введение

Эндометрий человека выстраивал полость матки и служит первым контактом для эмбриона во время имплантации. Эндометрий состоит из светящихся и железистых эпителиальных клеток, поддерживающих стромальных фибробластов, эндотелиальных клеток и иммунных клеток. Вместе, эти типы клеток составляют ткани эндометрия, которая является одним из наиболее отзывчивых тканей для половых стероидных гормонов1. Изменения, которые происходят во время каждого менструального цикла поразительны. Надлежащий рост и реконструкция эндометрия необходимы для проведения имплантации эмбриона. Аномальная реакция на эстроген и прогестерон может привести к огнеупорной эндометрия, что не позволяет для успешного установления беременности и может даже привести к заболеваниям, включая неоплазию эндометрия.

Для того, чтобы изучить гормональные реакции и существенные изменения, которые происходят в эндометрии, клетки из тканей эндометрия, вырезанные из пациентов во время операции или биопсии эндометрия были распространены в клеточной культуре. Эндометрия стромальные клетки преимущественно размножаться и распространяться легко, и процесс дифференциации индуцированных прогестерона можно резюмировать в пробирке. В результате, многое было изучено в ходе этого процесса дифференциации, называется decidualization2,3. Другой основной тип клеток в эндометрии, светящиеся и железистые эпителиальные клетки, однако, не растут хорошо, как традиционные монослои, теряя полярность, становясь старческим, и имеющие ограниченный пролиферативный потенциал. В результате, меньше известно об их биологии и их роли в эндометрии человека. Поскольку многие неоплазии происходят из эпителиальных клеток, механизмы, связанные с гиперплазией или преобразованием в раковые клетки, еще предстоит полностью определить. Кроме того, исследованияустановили,что гормональный ответ включает в себя интимные действия паракрина между эпителией и стромальными клетками эндометрия4,5.

Недавно трехмерная (3D) органоидная культура эпителиальных клеток эндометрия была установлена двумя независимыми группами6,7,которые являются первыми сообщениями о органоидациях, образованных из ткани эндометрия. Эти органоиды состояли из эндометриальных эпителиальных клеток, встроенных в белковую матрицу(Таблица Материалов)и не включали в себя важный гормонально отзывчивый отсек эндометрия эндометрия, стромальных фибробластов. Поскольку матричные белки могут варьироваться от партии к партии и могут вызвать сигнальные пути, которые не обязательно происходят в тканях, было бы идеально заменить матричные белки компонентами эндометрия. В текущем исследовании представлен протокол для создания бесхозных эндометрийских органоидов эпителии и стромальных клеток эндометрия человека. Наличие стромальных клеток не только обеспечивает поддержку эпителиальных клеток, но и обеспечивает необходимые действия паракринных, которые были установлены, чтобы быть важным для реакции гормона эндометрия4,8,9 .

Новый многоклеточный органоид эндометрия предлагает модельную систему эндометрия, которая проста в генерации и которая включает в себя как эпителиальные, так и стромальные клетки. Эти органоиды могут быть использованы для изучения долгосрочных гормональных изменений и ранних событий болезни, такие как опухолевый из-за гормонального дисбаланса или экзогенных оскорблений. Сложность этих органоидов в конечном итоге может быть расширена, чтобы включить другие типы клеток, в том числе эндотелиальных и иммунных клеток с возможно миометрийных клеток, чтобы действительно имитировать физиологии тканей человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы эндометрия были собраны у женщин в предменопаузе, проходящих рутинную гистерэктомию для доброкачественных заболеваний матки в Северо-Западном университете Prentice Women's Hospital, в соответствии с институциональным обзором Совета утвержденных протокола. Письменное согласие было получено от всех женщин, включенных в исследование.

1. Подготовка агарозских плесеней

  1. До начала изоляции клеток, литые и уравновешивать 1,5% агарозных микро форм (Таблица материалов) для размещения органоидов в соответствии с инструкциями производителя.

2. Поколение эндометрийных органоидов

  1. Урожай первичных стромальных и эпителиальных клеток
    1. В шкафу биобезопасности с использованием асептического метода, подготовить ферментный раствор (2,5 мг/мл коллагеназы типа I 0,1 мг/мл DNase I в 10 мл диспазы 500 единиц) при 37 градусов по Цельсию, и стерильный фильтр растворсссссс с помощью 0,2 мкм шпригофильтра в 15 мл конической трубки.
    2. В шкафу биобезопасности с использованием асептического метода, соскребать эндометрий от биопсии матки и фарш ткани под капотом на очень маленькие кусочки скальпелем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для генерации достаточного количества органоидов требуется эндометрийная ткань, которая составляет не менее 20 мм х 10 мм х 1 мм.
    3. Положите свежемолотую ткань в ферментный раствор в конической трубке 15 мл. Закройте крышку и оберните верхнюю часть восковой пленкой(Таблица материалов) для предотвращения загрязнения.
    4. Положите трубку с тканью в водяную ванну или инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут с нежной тряской (80–100 об/мин).
    5. Стек 100 мкм ячейки ситечко на вершине 20 мкм ячейки ситечко на 50 мл конической трубки. Фильтр раствора через два ситектов, а затем промыть 15 мл конической трубки с 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS; Таблица материалов) и положить мыть через ситечко, чтобы обеспечить все клетки собраны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протекаемые жидкости содержат стромальные клетки и красные кровяные тельца (всего 20 мл). Эпителиальные клетки собираются на 20 мкм ситечко. Куски непереваренной ткани остаются на вершине 100 мкм ситечко. Отбросьте непереваренные ткани в контейнер для отходов биологической опасности.
    6. Инвертировать 20 мкм ячейки ситечко от шага 2.1.5 на новый 50 мл конической трубки и мыть эпителиальные клетки от ситера с 20 мл органоидных носителей (Таблица материалов) дополнен 1% пера / стреп.
    7. Центрифуги конические трубки со ступеней 2.1.5 и 2.1.6 на 500 x g в течение 5 мин.
    8. С собранными стромальными клетками, удалите супернатант и resuspend гранулы с 10 мл красных кровяных клеток лиза буфера.  Инкубировать при 37 градусах По области в течение 10-15 мин. Центрифугки конической трубки на 500 х г в течение 5 минут, удалить супернатант, и resuspend гранулы с 200-300 л органоидных носителей (см. шаг 2.2.2 для дальнейших инструкций).
    9. С собранными эпителиальными клетками, удалите супернатант и повторно приостановите с 100 Зл органоидных носителей (см. шаг 2.2.2 для дальнейших инструкций).
  2. Посевные клетки
    1. После упрямиза 1,5% агарозных форм в колодцах (1 плесень на скважину) из 24-хорошо пластины, удалить органоидных носителей на внешней стороне агарозы формы и наклона ткани культуры пластины так, что среда из камеры посева клетки посуды блюда также может быть тщательно удалены.
    2. Под микроскопом посмотреть эпителиальные (от шага 2.1.9) и стромальные (от шага 2.1.8) клеточные суспензии.  Добавьте больше органоидных носителей к эпителиальной или стромальной клеточной суспензии по 100 Л за один раз, так что суспензии примерно равны по плотности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальные клетки будут слипаться вместе, и не рекомендуется переваривать / трипсинизовать эпителиальные клетки в одноклеточных суспензий.
    3. Объедините 1 часть стромальных клеток с 3 частями эпителиальных клеток по объему.
    4. Пипетка 50 кЛ (60 000 клеток) комбинированной клеточной подвески в камеру посева клеток агарозной плесени.
    5. После того, как агарозные формы заполнены клетками, тщательно добавьте 400 л свежих органоидных носителей в колодец 24-хорошей пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда достигает чуть ниже поверхности агарозы блюда и не приведет к клеткам плавать из форм. Через 2–3 дня клетки оседают и начинают формировать органоиды.
    6. Изменение среды каждый второй день с 500 л органоидных носителей.
    7. После 2-3 дней, изменить среду на один, который дополняется 0,1 нМ эстрадиола (Е) и 0,8 нм тестостерона (T) для содействия организации эпителиальных и стромальных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя организация эпителиальных и стромальных клеток может произойти с гормонами или без них, больше органоидов будет организовываться в присутствии гормонов.

3. Сбор эндометрийных органоидов для экспериментов

ПРИМЕЧАНИЕ: После проведения эксперимента органоиды эндометрия могут быть обработаны для гистологии или анализа РНК. Следующие шаги описывают, как обрабатывать органоиды.

  1. Гистологии
    1. Растворите 1,5% агарозы в фосфатно-буферизированном сольном (PBS) путем кипячения. Дайте жидкой агарозе остыть примерно до 50 градусов по Цельсию.
    2. Под рассекающим сядр, наклоните 24-ну колодец и аккуратно выпей из среды из-за пределов формы агарозы. Тщательно pipette из среды из интерьера агарозной плесени, чтобы избежать нарушения органоидов.
    3. Под рассекающим микроскопом тщательно пипетка 70-75 л тепла (50 градусов по Цельсию) 1,5% агарозы в камеру агарозного блюда. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить органоидов.
    4. Дайте остыть при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
    5. Добавьте 4% параформальдегида (PFA) в каждый колодец 24 хорошо пластины и исправить весь запечатанный агарозплеплеплеи плесень, содержащая органоиды на ночь при 4 градусах Цельсия. Затем хранить в 70% этанола при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока готовы к обработке для встраивания парафина.
  2. Изоляция РНК
    1. Под рассекающим микроскопом наклоните 24-ну колодец и аккуратно выпей из медиумизируемой из камеры агарозной формы.
    2. Решительно пипетка 1 мл свежей органоидной среды непосредственно в форму агарозы, чтобы органоиды вымываются из микровелл. Будьте осторожны, чтобы не создать слишком много пузырьков.
    3. Повторите трубацию снова с той же средой от шага 3.2.2.
    4. Соберите все среды, содержащие органоиды. Центрифуги на максимальной скорости собирать органоиды и приступить к экстракции РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема протокола изображена на рисунке 1. Ткань матки была получена после операции после того, как была обследована патологоанатомами. Эндометрия подкладка была отделена от миометрия путем соскабливания и ткани эндометрия была ферментативно переваривается в клетки, как указано в протоколе. Эпителиальные и стромальные клетки были добавлены в микроколодцы в агарозных форм. После 7 дней в культуре, органоиды были обработаны с E и T в течение дополнительных 7-14 дней.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы создали органоиды эндометрия человека, состоящие из эпителиальных и стромальных клеток эндометрия без использования экзогенных эшафотных материалов. Хотя уже было показано, что первичные эпителиальные клетки эндометрия могут образовывать органоиды6,7, эти клетки были встроены в желатиновую матрицу белков, выделяемых клетками саркомы мыши (см. Таблица Материалов), чтобы помочь образуют сфероидные структуры. Кроме того, отсутствовали стромальные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано NIEHS/NIH/NCATS UG3 грант (ES029073) и Северо-Западной Школы Фейнберга медицины мост фонда (JJK). Мы хотели бы отметить Северо-Западной патологии Основной фонд для обработки фиксированных органоидов для встраивания парафина. Мы хотели бы отметить всю команду UG3, включая лаборатории Woodruff, Burdette и Urbanek, за глубокие дискуссии и сотрудничество.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агароза HS, молекулярная биология классаDenville ScientificCA3510-6
Агарозные плесениSigma-AldrichZ764043(https://www.microtissues.com/)
Хлорид аммония (NH4Cl)Amresco0621
β-ЭстрадиолSigma-AldrichE2257
Коллагеназа, тип II, порошокThermo Fisher Scientific17101015
dispasecorning354235
DNase ISigma-AldrichD4513
EDTA FisherScientificBP120-1
Эозин Stain VWR95057-848
Рецептор эстрогена (SP1), моноклональное антитело кроликаThermo Fisher ScientificRM-9101-S
Флюорощит с DAPI, гистологическая монтажная средаSigma-AldrichF6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1x без кальция, магния и фенола красного
Раствор гематоксилинаРаствор красителя Thermo Fisher Scientific3530-32Модифицированная формула Harris, раствор
гепаринаSTEMCELL Technologies07980добавлено в MammoCult media
Hydrocortisoon стоковый растворSTEMCELL Technologies07925добавлено в MammoCult media
Органоидные среды - MammocultSTEMCELL Technologies05620дополнено 2 & микро; л/мл гепарина и 5 & микро; L/mL гидрокортизона
Параформальдегид, 16% растворЭлектронная микроскопияSciences 15710
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122
Фосфатный буферный раствор, pH 7,4Sigma-AldrichP3813
Рецептор прогестерона, PgR 1294, неконъюгированный, супернатант культурыAgilent TechnologiesM356801-2
белковая матрица - MatrigelBD Biosciences356231
Очищенное мышиное антитело к Е-кадгеринуBD Biociences610181Клон 36
Рекомбинантное антитело против виментина [EPR3776]Abcamab92547
Набор для лизиса и выделения РНКZymo ResearchR2060
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Sigma-AldrichS6014
ТестостеронSigma-Aldrich86500
Трихромная морилкаAbcamab150686
Восковая пленка - ПарапленкаVWR52858-000
без ртути

Ссылки

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.