Представлен протокол для генерации первичных органов эндометрия, которые состоят из эпителиальных и стромальных клеток и сохраняют характеристики родной ткани эндометрия. Этот протокол описывает методы от приобретения тканей матки до гистологической обработки эндометрийных органоидов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поколение многоклеточных органов эндометрия человека
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эндометрий человека является одним из самых гормональны реагировать тканей в организме и имеет важное значение для установления беременности. Эта ткань также может стать больной и вызвать заболеваемость и даже смерть. Модельные системы для изучения биологии эндометрия человека были ограничены системами культуры in vitro одного типа клеток. Кроме того, эпителиальные клетки, один из основных типов клеток эндометрия, не распространяются хорошо или сохранить свои физиологические черты в культуре, и, таким образом, наше понимание биологии эндометрия остается ограниченным. Мы впервые создали органоиды эндометрия, которые состоят как из эпителиальных, так и из стромальных клеток эндометрия человека. Эти органоиды не требуют каких-либо экзогенных материалов эшафот и специально организовать так, что эпителиальные клетки охватывают сфероидной структуры и становятся поляризованными с стромальных клеток в центре, которые производят и выделяют коллаген. Эстроген, прогестерон и андрогенные рецепторы выражаются в эпителиальных и стромальных клетках и лечение физиологическими уровнями эстрогена и тестостерона способствуют организации органоидов. Эта новая модель системы может быть использована для изучения нормальной биологии эндометрия и болезней таким образом, что не было возможно раньше.
Введение
Эндометрий человека выстраивал полость матки и служит первым контактом для эмбриона во время имплантации. Эндометрий состоит из светящихся и железистых эпителиальных клеток, поддерживающих стромальных фибробластов, эндотелиальных клеток и иммунных клеток. Вместе, эти типы клеток составляют ткани эндометрия, которая является одним из наиболее отзывчивых тканей для половых стероидных гормонов1. Изменения, которые происходят во время каждого менструального цикла поразительны. Надлежащий рост и реконструкция эндометрия необходимы для проведения имплантации эмбриона. Аномальная реакция на эстроген и прогестерон может привести к огнеупорной эндометри....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Образцы эндометрия были собраны у женщин в предменопаузе, проходящих рутинную гистерэктомию для доброкачественных заболеваний матки в Северо-Западном университете Prentice Women's Hospital, в соответствии с институциональным обзором Совета утвержденных протокола. Письменное согласие было получено от всех женщин, включенных в исследование.
1. Подготовка агарозских плесеней
- До начала изоляции клеток, литые и уравновешивать 1,5% агарозных микро форм (Таблица материалов) для размещения органоидов в соответствии с инструкциями производителя.
2. Поколение эндометрийных органоидов
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схема протокола изображена на рисунке 1. Ткань матки была получена после операции после того, как была обследована патологоанатомами. Эндометрия подкладка была отделена от миометрия путем соскабливания и ткани эндометрия была ферментативно переваривается в клетки, как указано в протоколе. Эпителиальные и стромальные клетки были добавлены в микроколодцы в агарозных форм. После 7 дней в культуре, органоиды были обработаны с E и T в течение дополнительных 7-14 дней.
.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы создали органоиды эндометрия человека, состоящие из эпителиальных и стромальных клеток эндометрия без использования экзогенных эшафотных материалов. Хотя уже было показано, что первичные эпителиальные клетки эндометрия могут образовывать органоиды6,7, эти клетки были встроены в желатиновую матрицу белков, выделяемых клетками саркомы мыши (см. Таблица Материалов), чтобы помочь образуют сфероидные структуры. Кроме того, отсутствовали стромальные.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было профинансировано NIEHS/NIH/NCATS UG3 грант (ES029073) и Северо-Западной Школы Фейнберга медицины мост фонда (JJK). Мы хотели бы отметить Северо-Западной патологии Основной фонд для обработки фиксированных органоидов для встраивания парафина. Мы хотели бы отметить всю команду UG3, включая лаборатории Woodruff, Burdette и Urbanek, за глубокие дискуссии и сотрудничество.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агароза HS, молекулярная биология класса | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Агарозные плесени | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Хлорид аммония (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Эстрадиол | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Коллагеназа, тип II, порошок | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| dispase | corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA Fisher | Scientific | BP120-1 | |
| Эозин Stain VWR | 95057-848 | ||
| Рецептор эстрогена (SP1), моноклональное антитело кролика | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Флюорощит с DAPI, гистологическая монтажная среда | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x без кальция, магния и фенола красного |
| Раствор гематоксилина | Раствор красителя Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Модифицированная формула Harris, раствор |
| гепарина | STEMCELL Technologies | 07980 | добавлено в MammoCult media |
| Hydrocortisoon стоковый раствор | STEMCELL Technologies | 07925 | добавлено в MammoCult media |
| Органоидные среды - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | дополнено 2 & микро; л/мл гепарина и 5 & микро; L/mL гидрокортизона |
| Параформальдегид, 16% раствор | Электронная микроскопия | Sciences 15710 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Фосфатный буферный раствор, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Рецептор прогестерона, PgR 1294, неконъюгированный, супернатант культуры | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| белковая матрица - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Очищенное мышиное антитело к Е-кадгерину | BD Biociences | 610181 | Клон 36 |
| Рекомбинантное антитело против виментина [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| Набор для лизиса и выделения РНК | Zymo Research | R2060 | |
| Бикарбонат натрия (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Тестостерон | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Трихромная морилка | Abcam | ab150686 | |
| Восковая пленка - Парапленка | VWR | 52858-000 |
Ссылки
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
