Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60401

⸱

4 марта 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья описывает метод трансплантации для того чтобы трансплантат аренить донора крысы эпителиальные клетки в interscapular белый тучная пусковая площадка животных реципиента. Этот метод может быть использован для изучения воздействия принимающей и/или донорской помощи на развитие эпителия молочной железы и устраняет необходимость предварительной очистки, тем самым расширяя полезность этого метода.

Аннотация

Уже в 1970-х годах исследователи успешно пересадили эпителиальные клетки молочной железы в межскапулярную белую жировую подушечку крыс. Прививка эпителия с использованием методов трансплантации использует гормональную среду, предоставляемую хозяином грызунов-подростков. Эти исследования идеально подходят для изучения влияния различных биологических манипуляций на развитие молочной железы и вскрыть многие аспекты биологии молочной железы. Общей, но ограничивающей особенностью является то, что пересаженные эпителиальные клетки находятся под сильным влиянием окружающей стромы и перебора с эндогенным эпителием; для использования родной ткани молочной железы, брюшной-ингуинального белого жира площадку должны быть очищены, чтобы удалить хост эпителия молочной железы до трансплантации. Основным препятствием при использовании крысмодели организма является то, что очистка развивающихся молочных деревьев в пост-отлуженных крыс не является эффективным. При пересадке в железо-свободных жировых прокладок, донорэпилические клетки могут заселить очищенный хозяин жира площадку и образуют функциональную железу. Межлопатулярный жир площадку является альтернативным местом для этих трансплантатов. Основным преимуществом является то, что он не хватает протоковых структур еще обеспечивает нормальную стромы, что необходимо для содействия эпителиального роста и легко доступны в крысы. Еще одним важным преимуществом этого метода является то, что он является минимально инвазивным, потому что он устраняет необходимость приживать и удалить растущее эндогенное дерево молочной железы. Кроме того, межлопатулярный жир колодки содержит медиальный кровеносный сосуд, который может быть использован для отдельных сайтов для прививки. Поскольку эндогенные железы остаются нетронутыми, этот метод также может быть использован для исследований, сравнивая эндогенную маммарию железу с пересаженной железой. В этой статье описывается метод пересадки эпителиальной клетки молочной железы в межлопатулярную белую жировую подушечку крыс.

Введение

Послеродовой развития молочной железы и трансконал морфогенеза процессы в значительной степени зависит от гормональной сигнализации в начале полового созревания. У мышей и крыс, широко используемых модельных организмов биологии молочной железы, этот процесс начинается около 3 недель возраста, где быстрое распространение и дифференциация приводят к образованию зрелой паренхимы. Зрелая железа может пройти многочисленные раунды расширения и инволюции, имущество, которое было под следствием с начала20-го века. В контексте гиперраспространения и развития рака, методы трансплантации молочной железы были разработаны в 1950-х годах1, и усиливается количественной методологии способствовали Гулд и др. в 1977году 2,3,4. Уточнение метода трансплантации у грызунов способствовало крупным достижениям в понимании нормальной биологии молочных желез, которые до сих пор широко используются для изучения влияния различных методов лечения и генетических манипуляций на нормальное развитие молочной железы и состояния болезней.

Многие гипотезы были созданы и впоследствии протестированы с помощью трансплантации молочной железы, впервые описанной DeOme et al. в 1959году 1. Эксперименты в течение нескольких десятилетий показали склонность протоковой ткани, вырезанной из донорских молочных желез, чтобы заселить весь жир площадку5,6,7 и указали, что важнейший компонент развития молочной железы находится в этих эпителиальных структур. Более поздние исследования на мышах показали, что одна клещевая клетка может заселить очищенную жировую подушечку и способствовала открытию одного, общего прародителя базальных и светящихся молочных эпителиальных клеток8,9,10. В соответствии с этими выводами, было высказано предположение, что трансплантация увеличивает пул клеток с многолинейным потенциалом перенаселения в результате пластичности, что позволяет привитых клеток расти функциональной молочной железы7,10,11,12,13. Важно отметить, что использование методов трансплантации у грызунов преодолевает ограничения клеточной культуры индуцированных аномалий14 и часто дает результаты всего за несколько недель.

Хотя процедура была первоначально описана в контексте предопластических поражений у мышей, вскоре она была расширена до крыс и используется в сочетании с канцерогеном лечения установить множественность как мера восприимчивости к раку15, но популярность методов трансплантации последовала развитие генетических инструментов для каждого вида. Хотя исследования мыши, включающие трансплантацию, способствовали многим трансляционным выводам, паренхима крысиной молочной железы напоминает человека более близко16,17 и предлагает четкие преимущества для изучения эстрогена рецептор-положительный (ЭРЗ) рак молочной железы. Опухоли молочной железы являются индуцируемыми у обоих видов, но они отличаются с точки зрения чувствительности гормонов и профилей экспрессии генов. Основное отличие заключается в том, что крысиные опухоли молочной железы выражают и зависят от функции рецепторов гормона яичника и гипофиза, а именно эстрогена и прогестерона (PR), подобно подтипу светящегося а рака молочной железы человека. Действительно, трансплантация эпителиальной клетки молочной железы, как описано в этом протоколе, была использована для изучения генетических вариантов, участвующих в раке молочной железы и определить клеточную автономию воздействия на эпителиальные клетки молочной железы18.

В дополнение к биологии опухоли, протоковой эпителий нормальной крысиной молочной железы экспонатов более высокий уровень ветвления и в окружении толще слой стромы, чем мышь. Важность стромы хорошо документирована в исследованиях эпителиальной трансплантации молочной железы. Маммарийский эпителий должен взаимодействовать с жировой стромы, а в идеале и собственным мезенхимом, чтобы пройти свой характерный морфогенез19,20. Прививка ткани в реципиентную маммарийскую железу обеспечивает оптимальную среду; однако наличие эндогенного эпителия может повлиять на результаты. Предварительная очистка молочной железы эндогенного эпителия обычно выполняется в анализе трансплантации мыши и требует хирургического иссечения эндогенной ткани молочной железы и/или удаления соска1,21,22. Хотя это возможно, preclearing эпителия молочной железы в после отлохоты крыс не так широко выполняется, в основном из-за неэффективности очистки растущего молочного дерева в после отлохоты крыс. Так как было показано, что регионы жировой ткани в других частях тела может поддерживать рост пересаженного эпителия молочной железы21,23,24, процесс предварительного очищения можно легко избежать у крыс путем прививки ткани в interscapular белый жир площадку.

Метод трансплантации, описанный в настоящей работе, включает в себя инъекцию ферментативно диссоциированных органоидов молочных желез (фрагменты молочного протокового эпителия и других типов клеток, способных к морфогенезу) или монодисперсированных клеток в межпросветительную жировую площадку в инбредных, изогенных или конгенических штаммах лабораторных крыс2. Поскольку межсезонная жировая подушечка, как правило, лишена молочной ткани, она обеспечивает подходящую среду для нескольких мест трансплантации без необходимости предварительного очищенного эндогенного эпителия. В результате эндогенные, брюшно-ингиналовые молочные железы животного не подвергаются хирургическим манипуляциям, развиваются нормально и не могут вмешиваться в интерпретацию результатов. Кроме того, нетронутые молочные железы могут быть использованы для сравнения для оценки принимающей против донорского воздействия на развитие эпителия молочной железы и опухоли18,25. Хотя перенаселение молочной железы из одной стволовой клетки доступна для мышей, она еще не была разработана для крыс, в основном из-за отсутствия антител, чтобы выбрать для крыс ы молочных стволовых клеток25,26,27. Несмотря на это, трансплантация монодисперсных эпителиальных клеток молочной железы для количественной оценки потенциала перенаселенности может быть успешно выполнена, и эти клетки будут развиваться нормально, когда привиты в соответствующие рамки2,3,4. В то время как органоиды хороши для многих целей, монодисперсные клетки необходимы для количественного применения, например, для определения количества эпителиальных клеток молочной железы, необходимых для инициирования рака после ионизирующей лучевой терапии28 или для сравнения характеристик потока цитометрически выбранных популяций эпителиальных клеток29.

На сегодняшний день описанная здесь процедура является наиболее надежным методом проведения трансплантации молочной железы у крысы с общей целью изучения развития молочной железы и механизмов, лежащих в основе развития рака молочной железы. Часто доноры и/или животные-реципиенты подвергаются воздействию различных переменных до, во время или после эпителиальной трансплантации. Примеры включают в себя один ген исследования с участием химического канцерогенеза30, излучение28,31,32, генетические манипуляции хозяина / донора генома18, и гормональные манипуляции12. Основным преимуществом ферментативной диссоциации, описанной в этом протоколе, является возможность изолировать эпителиальные органоиды или монодисперсные клетки для дополнительных экспериментов с участием цитометрии потока, трехмерной культуры, редактирования генов и многое другое. Будущие применения этого метода будут включать дополнительные манипуляции донорской и/или принимающей ткани с помощью генной инженерии. Например, донорские клетки могут быть генетически изменены ex vivo в любом выбранном геномном локусе с помощью системы редактирования генов CRISPR-Cas9. Аналогичным образом, крысы-реципиенты также могут быть генетически изменены для изучения взаимодействия между донором и реципиентом инженерных генетических факторов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные были размещены и содержаться в AAALAC утвержденных объекта, и эксперименты, описанные в этом протоколе были одобрены MUSC институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Для использования в взаимной трансплантации животных должен быть инбредный или изогенный штамм, с конгенгенным статусом предпочтительным или перекрещенным в течение по крайней мере 6 поколений.

1. Сбор донора крысы молочной железы эпителия

  1. Определить количество крыс-доноров, необходимых для трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 1 крыса-донор (4 недели) может обеспечить достаточное количество клеток для трансплантации в 4 животных-реципиентов. Некоторые приложения этого протокола потребуют дополнительного количества ячеек, и могут быть различия в общей урожайности.
  2. Этикетка все материалы и обеспечить доступное размещение для хирурга (Таблица 1).
  3. Запись массы тела каждой женщины-донора крысы. Следуйте институциональным руководящим принципам, чтобы полностью обезощивать или усыпствовать крысы-донора. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
  4. Переместите животное в стерильное хирургическое поле. Поместите животное на спину и распылите всю брюшную поверхность с 70% этанола.
  5. Сделайте сагитальный, Х-образный разрез, позволяющий получить доступ к грудной, брюшной и пытковые молочные железы. Вскрыть все ткани молочной железы от донорской крысы с помощью ножниц(Рисунок 1). Удалите все видимые лимфатические узлы.
  6. Извлеките ткань молочной железы с помощью щипков и поместите в маркированное 60-мм блюдо на льду. Добавьте в тарелку с 60 мм 500 л без сыворотки DMEM/F12. Отрегулируйте размещение ткани молочной железы, чтобы она оставалась полностью мокрой.
  7. Мелко фарш молочной ткани с помощью ножниц. Для этого разрежьте ткань на кусочки размером 1-2мм (рисунок 1С). Держите железу на льду до тех пор, пока не будет собрана вся донорская ткань (не превысит 60 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный персонал может фарш молочных желез и дополнительно подготовить коллагеназный раствор в то время как хирург продолжает ткани извлечения.

2. Извлекайте ткани мозга из эвтаназии доноров

  1. Тщательно переверните тело донора, чтобы поместить его в положение склонного. Безопасный с булавками. Спрей головы и верхней части спины с 70% этанола.
  2. Найдите основание черепа и сделайте разрез под затылочными кондиалами. Вставьте острые ножницы под кожу и отрежьте кожу от черепа, включая стороны головы.
  3. Используйте костные резцы или сильные ножницы, чтобы сократить череп вдоль средней линии, от затылочной до лобной кости. Держите лезвие как можно более поверхностным и угол вверх, чтобы предотвратить разрушение основной ткани мозга.
  4. Очистите кость с помощью rongeurs или сильные щипцы. Вставьте инструмент боковой к мозжечке, чтобы сломать кость с обеих сторон, подвергая костной слуховой канал. Разорвать связи с обезвражеражает.
  5. Аккуратно поднимите мозг изогнутыми, тонкими щипками. Поместите мозг на кусок фольги и запишите вес, а затем сразу же перенесите на трубку 15 мл с равным количеством (w:v) носителей, хранящихся на льду.
    1. Дополнительно, используйте тонкой кончик щипцы для удаления гипофиза (расположен под мозгом) для дополнительного использования в процедуре трансплантации, если это необходимо.
  6. Используйте механический гомогенизатор, чтобы нарушить ткани. Гомогенизировать мозг в течение 10-15 с на низкой скорости. Пусть смесь сидеть на льду, по крайней мере 1 мин, а затем гомогенизации снова. Гомогенизации достаточно, когда конечная смесь не состоит из больших частей.
  7. Фильтр гомената, проходя его через фильтр 100 мкм. Держите фильтрат на льду до использования (менее 4 ч).

3. Пищеварение и обработка экстрактов молочной железы

  1. Оттепель или теплые реагенты, как указано(таблица 1). Следуйте соответствующим шагам для восстановления органоидов или монодисперсных клеток.
  2. Приготовьте 10 мл безсыворотки пищеварения (без коллагеназа) для каждого донорского животного(Дополнительный файл 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем используемых носителей пищеварения может быть скорректирован (масштабируется вверх или вниз) для размещения сгруппированной ткани, если это применимо.
    1. Для органоидов пропустить до 3,3.
    2. Для монодисперсированных клеток, подготовить свежие Монодисперсионные Mixture и инактивации решение (Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3) в дополнение к сыворотке свободной коллагеназа пищеварения средств. Приступай к шагу 3.3.
  3. Когда все ткани молочной железы от доноров был извлечен и фарш, добавить фермент коллагеназа к теплой (или комнатной температуры) пищеварения средств(Дополнительный файл 1). Смешайте путем инвертирования.
  4. Передайте коллагенеза пищеварения через фильтр 20 мкм. Распределите 10 мл фильтрованных носителей в маркированных трубках 50 мл для пищеварения.
  5. Используйте новый наконечник пипетки мощностью 1000 л для каждого образца и перенесите измельченные донорскую ткани из каждой 60-мм тарелки в трубку пищеварения коллагеназа. Отрежьте 1 см от конца наконечника 1000 л и вручную поместите его на устройство перед использованием. Аккуратно перемешайте измельченные ткани, повысив вверх и вниз 1-2 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань трудно пипетка во время передачи, используйте небольшое количество коллагеназа пищеварения средств пищеварения из 50 мл трубки, а затем передать его обратно.
  6. Поместите образцы в горизонтальное положение в встряхиваемом инкубаторе и дайте образцам переварить 1,5-2 ч при 37 градусах По цельсии, 200-220 об/мин.
    1. Для органоидов пропустить до 3,7.
    2. Для монодисперсированных клеток добавить DNase I (0,2 мкг/мл) в смесь в течение последних 10 минут пищеварения. Инкубировать, как и прежде, с энергичной тряски. Приступай к шагу 3.7.
  7. Когда ткань полностью усваивается, гранулы подвески с помощью холодной центрифугации (4 кВ) в течение 10 мин при 1200 х г (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки на льду между каждым шагом, чтобы увеличить жизнеспособность клеток.
  8. Убедитесь, что гранулы образовались, а затем осторожно слить супернатант и жировой слой. Аккуратно приостановите гранулы в 10 мл свежих носителей DMEM/F12.
  9. Кратко спина на 68 х г примерно 10 с. Длина спина (но не скорость) может быть увеличена, если нет четкого разделения клеток. Визуально осмотреть гранулы перед началом(Рисунок 1D).
  10. Аккуратно удалите супернатант, оставив после себя небольшой объем. Переходке к следующему шагу, основанному на том, нужны ли органоиды или монодисперсные клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ Важно оставить небольшой объем носителей в трубке, потому что гранулы будут очень свободно. Остаточный объем носителей будет разбавлен через шаги мытья.
    1. Для органоидов добавьте еще 10 мл объема DMEM/F12 media и повторите стирки/спин. После второй стирки, resuspend клетки в меньшем объеме (1-2 мл) DMEM / F12 средств для фильтрации. Приступай к шагу 3.11.
    2. Для монодисперсированных клеток растворите в 2 мл предварительно разогретого HBSS с 0,025% (w/v) трипсином и 6,8 мм EDTA. Дайджест в течение 3-5 мин при 37 градусах Цельсия. Немедленно инактивируйтесь.
      1. Добавьте 4 мл DMEM/F12 с 10% FBS, чтобы остановить инактивировать трипсин.
      2. Спин клетки на 270 х г в течение 5 минут, а затем повторно в DMEM / F12 с 10% FBS снова. Приступить к шагу 3.11 для фильтрации ячеек.
  11. Фильтр клетки с помощью 40 мкм ячейки ситечко помещается в новой трубке 50 мл. Предварительно промокните ситечко путем pipetting 1 мл той же базовой среды, используемой для приостановки клеток, а затем передать подвески клетки через фильтр с помощью пипетки для сбора протоковых фрагментов / органоидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительный выход фильтрованного эпителия из ткани молочной железы одной, 4-недельной донорской крысы составляет 1 х 106 клеток.
    1. Для органоидов отбросьте фильтррат. Маммарийские органоиды останутся внутри корзины клеточного ситечко и меньше, нежелательные клетки будут устранены. Переворачивайте клеточный ситечко над новой трубкой 50 мл и промыть любым объемом, необходимым для сбора клеток. Приступай к шагу 3.12.
    2. Для монодисперсированных клеток, отбросить ситечко клетки и сохранить фильтр, потому что молочные эпителиальные клетки будут проходить через фильтр, наряду с меньшими стромальных и иммунных клеток. Промыть трубку, которая была использована для пищеварения / центрифугирования с другим объемом DMEM / F12 с 10% FBS и пройти через тот же ситечко клетки. Пеллети монодисперсированные клетки центрифугированием при 1200 х г в течение 5 мин. Приступить к шагу 3.12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переосляные ячейки готовы к последующему применению.
  12. Импульс спина раствора и обеспечить образование клеточной гранулы, прежде чем перейти к следующему шагу. Импульс спина снова, если это необходимо.
  13. Аккуратно удалите супернатант. Приостановите пеллетку в небольшом объеме (1000-2000 л DMEM/F12), чтобы сконцентрировать клетки для подсчета.
  14. Подсчитайте клетки и разбавьте при необходимости. Повторное увеличение желаемого количества клеток для трансплантации в 20 ЗЛ средств DMEM/F12 для каждого животного. Всегда держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Донорская клетка рассчитывает в диапазоне 1 х 105 - 1 х 106 клеток будет необходимо для каждого места трансплантата на основе конечной точки исследования. Например, эксперименты по канцерогенезу часто требуют большего количества пересаженных клеток, по сравнению с другими приложениями. Количество клеток, необходимых должны быть экспериментально определены для каждого штамма. Процедура, описанная в этом протоколе, использовала 250 000 донорских клеток в 20 медиа-на сайте пересадки, до смешивания с гоменатом мозга, как описано в шаге 3.16.
  15. Подготовьте любой aliquot (ы) клеток, необходимых для других экспериментов (например, изоляция FACS3,26,27,30,33).
    1. Для органоидов, перейти к шагу 3.16.
    2. Для монодисперсированных клеток, количественно жизнеспособных клеток с помощью трипан или метилен синий окрашивания, а затем продолжить.
  16. Подготовьте единичные партии донорского материала для всех реципиентов трансплантации. Объедините равные объемы клеточной суспензии (20 кЛ) с 50% гоменатом мозга (20 л) для каждого участка трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 40 л л на участок будет вводиться на каждом сайте, но рекомендуется включить не менее 25% дополнительный объем для отходов.
  17. Немедленно приступаем к трансплантации или замораживание клеток для трансплантации позже (потенциальная остановка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные клетки не были протестированы с этим протоколом и потребует оптимизации до создания когорты животных для трансплантации экспериментов. Настоятельно рекомендуется пересадить свежие клетки.

4. Процедура трансплантации (крысы-реципиенты 4-5 недель)

  1. Взвесьте каждого реципиента крысы и рассчитать правильную дозу утвержденного анальгетика, который будет использоваться в процедуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вес тела может быть измерен до 24 ч до процедуры. Следуйте институциональным руководящим принципам, чтобы сдержать или кратко обезобезожнести каждое животное в течение всего срока бритья.
  2. Бритье хирургической области на каждом животном с помощью электрических клиперов. Определите основание черепа и начало позвоночную колонку. Приблизительно одна треть пути вниз по позвоночнику, брить 3 см х 2 см области на верхней грудной части спины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье также может быть выполнено под наркозом в день трансплантации, но должно быть выполнено за пределами стерильного поля. Верните крысу в родную клетку, пока это не понадобится.
  3. Найдите все материалы, необходимые для трансплантации(Таблица 1).
  4. Оцените систему анестезии животных перед использованием. Доверчивую любые жидкости и замените любые баки или части, которые необходимы. Убедитесь, что газовая линия в анестезиоционную камеру открыта и все периферийные линии закрыты, чтобы изофруранная анестезия и кислород могли свободно поступать к животному, как только оно помещается в камеру.
  5. Теплые грелки для поддержки температуры тела животных-получателей.
  6. Создайте стерильное поле, которое будет использоваться для хирургии. Организуйте поставки, как описано в таблице 1.
  7. Администрирование предоперационного анальгетика крыс-реципиентов, как указано в одобренном организацией протоколе по уходу за животными.
  8. Промыть шприцы Гамильтона со стерильными DMEM/F12 носителей, чтобы предотвратить потерю клеток. Убедитесь, что игла крепится к телу шприца, вставьте иглу в жидкость и отодвинете поршень. Заполните максимальный объем. Нажмите поршень вниз и изгнать содержимое в трубку для сбора отходов. Повторите 3-5 раз.
  9. Загрузите весь объем донорского материала (подготовленного в шаге 3.16) в отдельный шприц для каждого состояния (например, контроль, лечение, дикий тип, нокаут и т.д.). Вставьте кончик иглы в жидкость, отодвините поршень и держите иглу под поверхностью смеси, так как объем в трубке уменьшается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите не менее 10% дополнительного объема в каждый шприц. Не распоряжайтесь оставшейся смесью, закрывайте трубку и держите ее на льду в случае необходимости большего.
  10. Перевернуть шприц после того, как он полностью загружен и нажмите поршень немного, чтобы удалить пузырьки воздуха на кончике иглы. Переходке к следующему шагу, когда все будет подготовлено.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик иглы никогда не касается любой другой поверхности, даже в стерильной области. Полезно отдохнуть тело шприца над небольшой контейнер льда для содействия жизнеспособности клеток.
  11. Поместите животное-получатель в наркоз нуючку и включите машину.
  12. Когда животное полностью расслабляется (не реагирует на постукивание или нежное движение камеры), направьте анестезию на носовой конус и перенеси животное в стерильное поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расширенная продолжительность анестезии не очень хорошо переносится крысами. Завершите процедуру для каждого животного за 10 минут или меньше.
  13. Поместите животное в лежачем положении (на животе), чтобы затылок и верхний позвоночник были доступны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте адекватную тепловую поддержку животного все время и регулярно оценивайте глубину анестезии с помощью твердой щепотки ног.
  14. Дополнительно, применять офтальмологические ветеринарной мази для предотвращения высыхания глаз.
  15. Очистите свежевыбритую область, чтобы удалить лишние волосы. Используйте круговое движение и применять 70% этанола (или другой реагент, в институциональных руководящих принципов) на кожу, а затем антисептик (например, йод), и повторить. Поместите полотенце драпировка над животным, так что только область для бритой области подвергается.
  16. Убедитесь, что животное остается нереагирующим на глубокие раздражители с твердой щепоткой, а затем перейти к следующему шагу.
  17. Сделайте небольшой (2 см) межкапулярный разрез с помощью резкого хирургического лезвия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен быть поверхностным, так как жирная подушечка расположена прямо под кожей.
  18. Найдите медиальное кровеносное сосуд для ориентации(рисунок 2B).
  19. Поднимите кожу на одной стороне разреза с помощью щипков и удерживайте ее от жирной площадки во время трансплантации(рисунок 2B). Вставьте иглу в место пересадки.
    1. Дополнительно, переместить кончик иглы внутри ткани и создать небольшой карман для сбора клеток. Используйте небольшое повторяющееся движение. Не удаляйте иглу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг рекомендуется для начинающих пользователей протокола. Используйте крайнюю осторожность при создании кармана, так как межлопатулярная жировая ткань прокладки очень деликатна.
  20. Тщательно введите 40 л клеточной смеси в межлопатулярную жировую ткань. Удалите иглу медленно.
  21. Держите ткани на месте и позволить пересаженные клетки, чтобы согласиться на 3-5 s. Используйте дополнительную пару щипцы, если это необходимо.
  22. Снимите иглу. Повторите процедуру инъекции (шаги 4.18-4.21) на втором месте трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий из одной группы доноров могут быть введены в ту же сторону жира колодки в каждом животном, или чередующихся сторон для предотвращения пакетных эффектов от рук доминирования хирурга.
  23. Закройте хирургическую рану с помощью рановых зажимов или швов, а затем прекратите анестезию.
  24. Обеспечить послеоперационный анальгетик, как указано в утвержденных организацией протоколе.
  25. Немедленно перемещайте животное в клетку восстановления с тепловой поддержкой. Монитор для признаков бедствия, таких как кровотечение из разреза или проблемы с дыханием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно полностью восстановиться в течение 5-10 мин. Обратитесь к институциональным руководящим принципам для возвращения животных в колонию и послеоперационного мониторинга после процедур выживания.
  26. Дополнительно, выполнять исследования канцерогенеза на месте трансплантата (ы) путем введения канцерогенов для крыс-реципиента 3-4 недель после трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, крысиный карцерогенез проводится с использованием химической канцерогенной обработки в возрасте 50-57 дней. Это лечение диктует возраст операции по пересадке (которая должна быть сделана между 29-36 дней), чтобы дать достаточно времени для привитых клеток, чтобы инициировать рост молочной железы.

5. Оценка эпителиального роста

  1. Мониторинг эструс цикла крыс через ежедневный вагинальный лаваж и изучить цитологии на слайде микроскопа. Начало за 8-12 дней до конечной точки исследования. Пожертвовать всех крыс в одной стадии. Это необязательный шаг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл крысэструса составляет 4-5 дней. Разрешение животному пройти через 1-2 полных циклов облегчит интерпретацию, так как слайды из предыдущих циклов могут быть использованы для сравнения.
  2. Пожертвование трансплантации крыс 6-8 недель после трансплантации, в институциональных руководящих принципов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост обычно обнаруживается через 3-6 недель после трансплантации, но может потребоваться дополнительное время.
  3. Поместите животное в лежачее положение и очистить тело с 70% этанола. Поднимите кожу с щипками и сделать разрез вдоль позвоночного столба, чтобы разоблачить interscapular жира площадку. Вскрыть кожу от ткани, так что большинство жира колодки видно.
  4. Определите медиальный кровеносный сосуд, отделяет места трансплантата в межкапулярной жировой площадке. Акциз всей площадки в качестве одного куска ткани или вырезать вдоль кровеносных сосудов и удалить стороны индивидуально.
  5. Поместите ткань на положительно заряженный микроскоп слайд для всего крепления. Используйте 2 пары тупых щипц и аккуратно распределите ткань, чтобы восстановить ее оригинальную конформацию на слайде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса молочные ткани является чрезвычайно деликатным. Края ткани могут скручиваться под собой. Всегда ручка с осторожностью и удерживайте на месте, пока ткань не прилипает к слайду (несколько секунд).
  6. Цельное крепление по крайней мере одного из эндогенных брюшно-ингинальных молочных желез (с лимфатическими узлами для ориентации) для сравнения.
  7. Поместите слайды в 70% этанола в течение 7-10 дней, чтобы обезвредить ткани. Пополнить этанол так часто, как это необходимо для обеспечения ткани не высыхает.
  8. Подготовка квасцов-кармин пятно и обработки слайдов, когда ткань достаточно непрозрачной. Разрешить пятно, чтобы остыть перед использованием (Дополнительный файл 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пятно может быть подготовлено до одного дня до фиксации и регидратации шаги. Раствор может храниться при 4 градусах Цельсия и имеет ограниченный потенциал для повторного использования.
  9. Исправить ткани, поместив слайды в 25% ледниковой уксусной кислоты : 75% этанола в течение 60 мин.
    1. Увлажнять ткани через серию из 3 стирок в серии снижения концентрации этанола: 70% этанола в течение 15 мин, 50% этанола в течение 5 мин и dH2O в течение 5 мин.
  10. Пятно с квасцов кармина в течение 4-8 дней. Проверьте задней части слайдов каждый день, чтобы определить, если пятно полностью проникли ткани. Переходке к следующему шагу, когда окрашивание завершено.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание завершено, когда толстые части железы имеют фиолетовый оттенок и больше не появляются белые.
  11. Дестазировать и обезвоживать ткани путем передачи слайдов через серию увеличения концентрации этанола: 70% этанола в течение 30 мин, 95% этанола в течение 30 мин и 100% этанола в течение 30 мин.
  12. Поместите обезвоженые горки в ксилен в течение 3 дней, чтобы очистить ткани. Передача на минеральное масло для длительного хранения.
  13. После того, как слайды очищаются, используйте маломощную световую микроскопию или цифровую фотографию высокого разрешения для получения изображений слайдов для анализа. Убедитесь, что параметры приобретения изображения согласованы для всех слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальный рост должен быть четко различимы.
  14. Относитесь к присутствию нароста как к двоичному результату.
  15. Рассчитайте среднее количество пересаженных эпителиальных клеток, которые произвели рост молочной железы No1 в 50% мест трансплантации с использованием приобретенных изображений. Количественная оценка других физических особенностей, по мере необходимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Донор и реципиент молочных желез
Шаги по изоляции и подготовке эпителиальных клеток крысы для трансплантации показаны на рисунке 1A. В 4 недель, эндогенной молочной железы донорской крысы начал созревание и эпителий может быть визуализирована на целом установленные слайды окрашенных квасцов кармин(Рисунок 1B). Одна донорская крыса в этом возрасте о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает метод трансплантации эпителиальной клетки молочной железы, оптимизированный для работы с крысами. Изолированные эпителиевые органоиды молочной железы от крыс-доноров (3-5 недель) прививаются в межлопатулярный белый жир площадку крыс-реципиента (также 3-5 недель возраста). Результаты могут быть интерпретированы всего лишь 4-6 недель спустя, используя светлую микроскопию для изучения привитых тканей; однако оптимальное количество времени между трансплантацией и жертвоприношением должно быть определе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Холлингс онкологический центр онкологический центр поддержки Грант P30 CA138313 экспериментального финансирования исследований от Национальных институтов здравоохранения(https://www.nih.gov/), и средства от Департамента патологии и лабораторной медицины в Медицинском университете южной Каролины. Мы хотели бы поблагодарить Марийн Смитс за запись интервью заявления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; M шприцевые фильтрыFisher Scientific09-715Gстерильно-фильтрующая коллагеназа питательная среда
1,5 - 2,0 мл микроцентрифужные пробирки (стерильные)Fisher Scientific05-408-129содержащие ресуспендированные клетки и/или гомогенатную смесь мозга
100 &микро; Ситечки для клеток МCorning431752фильтрующие гомогенат мозга
100 мкл газонепроницаемые шприцы с иглами 25 калибраHamilton81001 & 90525Для введения смеси трансплантата животным-реципиентам (1 на генотип/состояние донора)
1000 мкл наконечники для пипеток + пипетка--перенос клеток/смесей/тканей
15 мл полипропиленовая трубкаFalcon (Corning)352196хранение гомогенатной смеси мозга, или клетка: гомогенная смесь для трансплантации
40 &микро; Ситечки для клеток МCorning431750фильтрация органоидов после промывки клеточной гранулы
50 мл полипропиленовые трубкиFisher Scientific05-539-6для усвоения коллагеназы донорской ткани молочной железы
60 мм посудаThermo Scientific130181для измельчения ткани
Квасцы сульфат калияSigma-Aldrich243361/237086окрашивание молочной железы целиком слайды
Испаритель для анестезии для ветеринарного применения-следуйте институциональному протоколу
Бета-дин или йод
Пробирка для культуры из боросиликатного стекла для гомогенизацииFisher Scientific14-961-26для гомогенизации головного мозга (используйте соответствующую пробирку для гомогенизатора)
CarmineSigma-AldrichC6152/1022окрашивание молочной железы Цельные горки
Аппарат для подсчета клеток-
Чистые клетки для животных для восстановления-следуйте институциональному протоколу
Коллагеназа типа 3Worthington Biochemical Corp.LS004183ферментативное расщепление измельченной ткани молочной железы от донорских крыс
деионизированная вода--для химических растворов
DMEM/F12GIBCO11320033для измельчения ткани, коллагеназы для расщепления и ресуспендирования смесей эпителиальных клеток
ЭДТА--монодисперсионная смесь
этанол, 200 ProofDecon Labs2705/2701Фетальная
сыворотка для крупного рогатого скота (FBS)Гиклон-инактивацияраствора
Марля
--Ледяная кислотаFisher ScientificA38-212использование для фиксатора всего предметного стекла для всей груди (1:4 ледяная уксусная кислота в 100% этаноле)
HBSSGIBCO-Монодисперсионная смесь
Грелки--следуйте институциональному протоколу
Ведра для льда (x2)-
-Инкубатор с орбитальным вращением--должен быть способен поддерживать 37°°; С, встряхивание со скоростью 220-225 об/мин (для коллагеназного расщепления тканей молочной железы)
Изофлурановая анестезия-следование институциональному протоколу
Световой микроскоп или цифровая камера-визуализация эпителия молочной железы целиком и/или получение изображений
Механический гомогенизаторFisher Scientific-TissueMiserили альтернативные модели
Минеральное масло, чистоеSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5Долгосрочное хранение очищенной молочной железы целиком Кислородные
баллоны для испарителя анестезии--следуйте институциональному
протоколу Бумажные полотенца или деликатные салфетки для работы--
Положительно заряженные предметные стекла микроскопаThermo ScientificP4981-001ткань молочной железы целые монтирует
Послеоперационный анальгетик--Институциональный протокол
Весыизмерения массы тела животных, правильная дозировка обезболивающего препарата
Бритва-электрические машинки для стрижки или другие
баночки для окрашивания--минимум 1 на химическую стирку, размер, соответствующий количеству слайдов, стекло предпочтительно
Стерильные полевые простыниIMCO4410-IMCиспользуется во время трансплантации
Стерильные ножницы и щипцы х3 (автоклавные)--автоклавные хирургические инструменты, используемые для доноров и реципиентов
Шприцы: 5 мл (или больше)--для стерильной фильтрации питательных сред коллагеназы
Трипсинмонодисперсионная смесьУортингтон
Контейнер для сбора отходов для жидкостей (налитых или аспирированных) -
Аппликатор зажимов для ран, зажимов и инструмента для удаленияFine Science Tools12020-00Закрытие разреза кожи над межлопаточной белой подушечкой
XylenesFisher ScientificX3S-4очищение молочной железы целиком монтируется слайдами после окрашивания
, - - Уортингтон Трипсин

Ссылки

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343(1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173(1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7(2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634(1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002(2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.