Измерение микробных мутационных показателей с помощью анализа колебаний

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для проведения флуктуации и оценки частоты мутаций микробов с использованием фенотипических маркеров. Этот протокол позволит исследователям анализировать мутации в различных микробах и средах, определяя, как генотип и экологический контекст влияют на скорость спонтанных мутаций.

Аннотация

Анализы колебаний широко используются для оценки частоты мутаций в микробах, растущих в жидкой среде. Многие культуры прививаются несколькими тысячами клеток, каждая из которых чувствительна к селективному маркеру, который можно анализировать фенотипически. Эти параллельные культуры растут на протяжении многих поколений в отсутствие фенотипического маркера. Подмножество культур используется для оценки общего числа клеток, подверженных риску мутаций (т.е. размер популяции в конце периода роста, или N_t). Остальные культуры покрыты селективным агаром. Распределение наблюдаемых устойчивых мутантов между параллельными культурами затем используется для оценки ожидаемого количества мутационных событий, m,с помощью математической модели. Разделение м на N_t дает оценку скорости мутации на локус на поколение. Ассея имеет три важнейших аспекта: выбранный фенотипический маркер, выбранный объем параллельных культур и обеспечение полного высыхания поверхности на селективном агаре перед инкубации. Анализ относительно недорог и нуждается только в стандартном лабораторном оборудовании. Он также менее трудоемкий, чем альтернативные подходы, такие как накопление мутаций и одноклеточные анализы. Ассес работает на организмы, которые проходят через многие поколения быстро, и это зависит от предположений о фитнес-эффекты маркеров и клеточной смерти. Однако недавно разработанные инструменты и теоретические исследования означают, что эти вопросы теперь можно решать аналитически. Анализ позволяет оценить скорость мутации различных фенотипических маркеров в клетках с различными генотипами, растущими в изоляции или в сообществе. Проводя несколько анализов параллельно, анализы могут быть использованы для изучения того, как экологический контекст организма влияет на скорость спонтанной мутации, которая имеет решающее значение для понимания устойчивости к противомикробным препаратам, канцерогенеза, старения и эволюции.

Введение

В 1901 году голландский ботаник Уго де Врис придумал термин мутация¹. Двадцать шесть лет спустя, когда Герман Джозеф Мюллер обнаружил мутагенное действие рентгеновских лучей^2,мутации уже воспринимались как одна из движущих сил эволюции. Однако характер мутаций не был ясен. Чтобы ответить на фундаментальный вопрос о том, возникают ли мутации спонтанно (т.е. спонтанная мутация) или в ответ на отбор (т.е. индуцированную мутацию), был необходим метод наблюдения за мутационными событиями. Такой метод будет измерять ожидаемое количество мутаций на деление клеток или то, что уже было известно как скорость мутации^3,4.

Рисунок 1: Схематическая иллюстрация того, как выполнить анализ колебаний с микробным штаммом в 96 глубокой скважине пластины. (A) Привить и акклиматизировать клетки в 50 мл труб, содержащих пять различных средах ("красный", "синий", "зеленый", "фиолетовый", и "оранжевый" анализы). (B) Подготовьте параллельные культуры с небольшим количеством чувствительных клеток в 96 глубокой пластине скважины. «Красный» анализ имеет 20 параллельных культур, в то время как «синий», «зеленый», «фиолетовый» и «оранжевый» анализы имеют 19 параллельных культур. Позиции параллельных культур на 96 глубокой скважине являются случайными. Рандомизация может быть сделано с помощью дополнительного сценария LayoutGenerator.R или с помощью какого-либо другого инструмента. Макет в правом верхнем верхнем направлении является результатом рандомизации. (C)Инкубировать 96 глубокой пластины скважины и позволяют клеткам делиться и спонтанно мутировать. Шесть культур из глубоких скважин A1, B1, C1, E1, F1 и G1 показывают, как колеблется количество мутантов: 4, 0, 2, 2, 1 и 4 красных клетки после третьего деления клеток, соответственно. Количество мутантов отличается не только из-за разного количества спонтанных мутаций (0, 1 или 2, как показано на первой красной клетке), но и потому, что это важно, когда во время культурного цикла спонтанно возникает мутация сопротивления (клеточное деление 1, 2 или 3). (D) После инкубации 96 глубокой пластины скважины количество мутантов определяется путем покрытия 81 параллельных культур. На макете это круги без смелых краев. Вся параллельная культура накрывается на одном колодце из 6 колодца, содержащего селективный агар. (E) Остальные 15 культур разбавлены и покрыны на non-селективном агаре для того чтобы обусловить среднее число клеток(N_t). На макете они помечены как Ntwells и имеют смелые края. Для каждого ассса N_t усредняется в течение трех параллельных культур. В правом нижнем углу находится чашка Петри, содержащая неселективную агарную тарелку с 25 CFUs разбавленной культуры, выращенной в глубоком колодце D1 (часть «зеленого» ассса). (F) После инкубации селективных 6 скважинных пластин было подсчитано количество наблюдаемых мутантов и ожидаемое количество мутационных событий, м,оценивалось с помощью оценщика максимальной вероятности. (G) Зная как количество мутаций, м, и количество клеток на анализ, N_т, скорость мутации была оценена как м/N_т. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Сальвадор Лурия и Макс Дельбрюк в 1943 году предоставили гениальное решение этой проблемы с колебаниями асссы⁵ (см. Рисунок 1). Анализ начинается с нескольких популяций (названных параллельных культур), которые инициируются с небольшим количеством микробных клеток(рисунок 1A,B). После роста в доброкачественной, неселективной среде(рисунок 1С),параллельные культуры передаются на пластины, содержащие селективный маркер (фаги, антибиотики и т.д.), где только клетки с мутацией сопротивления выживают и могут произвести колонию(рисунок 1D). Основное ожидание заключалось в том, что в случае индуцированных мутаций резистентности количество клеток, несущих мутацию, должно быть распределено между различными популяциями со средним, равным дисперсии. Лурия и Дельбрюк обнаружили с колебаниями, что число мутантов резко колебалось и что разница в количестве мутантов между различными популяциями была значительно больше, чем среднее. Лурия и Дельбрюк тем самым продемонстрировали, что мутации являются спонтанными. Они показали, что мутации спонтанно возникают всякий раз, когда ДНК реплицируется, и количество мутантов зависит от того, когда мутация происходит во время роста популяции. Смотрите Рисунок 1C, где шесть популяций, каждая из которых инициирована с микробной клеткой (синим цветом), не испытывают ни одной, 1 или 2 отдельных мутаций. Популяции A1, E1 и F1 испытали одну одну мутацию (первая красная клетка), но из-за того, что одна мутация спонтанно возникает в различных временных точках во время культурного цикла, популяции оказались с очень разным числом наблюдаемых мутантов (четыре, два и один, соответственно). С другой стороны, популяции C1 и G1 оказались с таким же количеством наблюдаемых мутантов, как E1 и A1, несмотря на то, что произошли два мутационных события, а не одно. Колебания наблюдаемых мутантов среди популяций не только дали анализу название, но и показали, что частота мутантов (т.е. доля клеток мутантов) является неадекватным показателем частоты мутаций.

Общая цель исследования колебаний заключается в оценке спонтанной скорости мутации конкретного генотипа бактерий или другого одноклеточного организма, растущего в определенной жидкой среде. Анализ колебаний остается наиболее подходящим инструментом для изучения экологической зависимости от частоты мутаций микробов и позволяет быстро и недорого оценить скорость мутации. Альтернативные подходы к оценке скорости мутации, такие как максимальное последовательность^6,секвенирование популяции^7,эксперименты по накоплению мутаций^8,или сравнение последовательностей генома потомства с последовательностью родителей⁹ гораздо более трудоемкими и, таким образом, плохо подходят для потенциального обнаружения экологических зависимостей. Тем не менее, динамические аспекты генерации и ремонта мутации в значительной степени недоступны для анализов колебаний или для любого из методов отслеживания частоты мутаций, перечисленных выше. Для изучения того, как количество мутаций меняется во времени, пространстве или среди отдельных клеток в популяции, одноклеточные подходы^11,12 необходимы, которые, в дополнение к более трудоемким, чем колебания анализы, требуют узкоспециализированных навыков и оборудования.

На практике, анализ колебаний является подсчет клеток получить фенотипический маркер из-за мутации, которая происходит в среде, не хватает выбора для этого маркера. Мета-анализ сотен опубликованных анализов¹⁰ показывает, что по крайней мере 39 различных фенотипических маркеров были использованы с момента создания анализа в 1943 году. Анализ колебаний может быть использован для сравнения средних и экологической зависимости от частоты мутаций среди лабораторных, клинических, немутаторных и мутаторных штаммов, растущих в разрешительных средах. Анализ позволяет оценить скорость мутации в клетках с различным генетическим фоном, растущим в минимальных или богатых средах. Анализ подходит не только для популяций, растущих как монокультура, но также может быть использован для изучения влияния клеточных взаимодействий на частоту мутаций^11. Когда штамм интереса cocultured с вторым напряжением, и нейтральный маркер используется для различения штаммов, скорость мутации может быть ассирована для двух штаммов в той же трубке в то же время.

Колебания анализы показали, что скорость спонтанной мутации зависит как от генотипа клетки и ее окружающей среды¹² и является чертой, которая сама развивается¹³. Всякий раз, когда скорость мутации одного конкретного генотипа изменяется вместе с окружающей средой, она описывается как пластичность мутационных частот^11. Пластиковые показатели мутации были наиболее тщательно рассмотрены для стресс-индуцированного мутагенеза (SIM)¹⁴. Кроме того, с помощью анализов колебаний, недавно было показано, что плотность, к которой растет популяция клеток (как правило, партийная культура при переноске) тесно связана с частотой мутаций между бактериями и одноклеточными эукариотами. Скорость мутации на геном на одно поколение уменьшается в плотных популяциях в 23 раза^{в 10,11.} Такая пластичность частоты мутаций, связанная с плотностью мутации (DAMP), может зависеть от системы зондирования кворума¹⁵ и действовать независимо от SIM^16.

Здесь представлен подробный протокол для флуктуации, используемой для изучения штамма Escherichia coli K-12, приобретая устойчивость к антибиотику рифампицин в среде с минимальными средствами массовой информации. Однако этот протокол следует рассматривать как базовый шаблон, который может быть использован для изучения широкого спектра микробов, просто изменяя условия культуры и фенотипические маркеры мутации. Протокол эволюционировал от своего начала^{5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29} через его использование на широком диапазоне микробов и даже раковых клеток³⁰ и был изменен для увеличения пропускная информация, которая была необходима для правильного тестирования экологических зависимостей микробных мутаций^10,11,16. Описанный здесь протокол не охватывает все методологические и аналитические вопросы колебания, которые уже хорошо обсуждались в литературе, в частности фитнес-эффекты устойчивых мутаций³¹, фенотипическая задержка³², гибель клеток³³, и пригодность различных алгоритмов, доступных для оценки мутации ставки^26,34. Это может быть важно, например, когда экологическая зависимость фитнес-эффектов может привести к ошибочным изменениям в оценках скорости мутации^35. Тем не менее, мы отмечаем, что аналитические инструменты, которые мы используем здесь, могут справиться с вариацией в пригодности мутантов и клеточной смерти. Как учреждено в примечаниях и обсуждении, также порекомендовано что множественные фенотипические маркеры которые маловероятны для того чтобы иметь такие же отenvironmentally зависимые влияния пригодности были рассмотрены. Этот протокол позволит людям регулярно анализировать экологические зависимости от частот ы мутаций в разнообразии микробных штаммов и окружающей среды. Анализ мутаций в различных средах еще не был тщательно протестирован и как только плотность населения считается, колебания анализы могут дать более точную оценку мутации скорость¹⁰. Этот протокол позволит проводить больше анализов колебаний, что необходимо для понимания механизмов, лежащих в основе частоты мутаций, что, в свою очередь, имеет жизненно важное значение для понимания эволюции, канцерогенеза, старения и устойчивости к противомикробным препаратам.

Протокол

1. День 1: Прививка и акклиматизация культур

1. Прививать 3 мл жидкого лисогенного бульона (LB, см. Дополнительную таблицу 1) с царапиной льда из e. coli MG1655 глицерола (18% глицерола, -80 градусов по Цельсию). Встряхните культуру LB при 120 об/мин при 7 ч при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется E. coli K12 MG1655, растущий в LB, но этот анализ может быть выполнен с любым штаммом кишечной палочки или любыми другими мутиальными микробными видами. Температура инкубации, время инкубации и уровень питательных веществ в носителях роста могут подвергаться изменению по видам или деформации.
2. Разбавить культуру в 2000 раз с помощью сосудистого раствора. Добавьте 100 л разбавленного раствора к трем 50 мл винтовой крышки конической нижней полимерной трубки (50 мл труб) с 10 мл жидкой Дэвис минимальной среды (DM, см. Дополнительную таблицу 1), соответственно, содержащий 80 мг/л, 125 мг/л, или 250 мг/л глюкозы. Это та же среда (т.е. среда), в которой будет оцениваться скорость мутации. Встряхните культуры при 120 об/мин на ночь при 37 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор средств массовой информации зависит от вариаций по видам, деформации или исследовательскому вопросу.

2. День 2: Поколение мутантов в параллельных культурах

1. Во-первых, подготовить среды, в которых бактерии будут культивированы. Всегда готовьте на 10% больше, чем требуется (т.е. двадцать 1 мл культур требуется 22 мл). Подготовка 22 мл 1) DM с 80 мг/л глюкозы, 2) DM с 125 мг/л глюкозы, 3) DM с 250 мг/л глюкозы, 4) DM с 80 мг/л глюкозы, и 5) DM с 250 мг/л глюкозы в пяти 50 мл труб. Этикетка их как GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B, и GLC-250B, соответственно.
2. Подготовка прививки для окружающей среды. Убедитесь, что инокулум для 1 мл окружающей среды содержит 1000-5000 клеток. Сделайте это, выдвивая приведенные ниже шаги.
   1. Измерьте оптическую плотность (OD) ночных культур (от шага 1.2) на 600 nm.
   2. Разбавить каждую ночную культуру для того, чтобы достичь конечной плотности 1000-5000 клеток на мл ДМ с глюкозой. В наших руках, если OD измеряется в 2.2.1 составляет 0,3, это означает, что 100-кратное разбавление (в солевой раствор) ночной культуры, а затем добавить 11 л этого решения в среду 22 мл.
3. Подготовьте параллельные культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол написан для одной пластины 96 глубоких скважин, выполняя пять анализов колебаний (максимально разумное число на одной пластине 96 скважин), используя три среды. С опытом, несколько глубоководных пластин могут быть запущены параллельно.
   1. Создайте случайный макет параллельных культур для одной пластины 96 глубоких скважин. Дополнительный R-скрипт LayoutGenerator.R (см. макет на рисунке 1B)может быть использован для этого. Позиция каждой параллельной культуры на 96 глубокой пластины скважины в соответствии с макетом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запуск LayoutGenerator.R гарантирует, что первый анализ имеет 20 параллельных культур, и что второй, третий, четвертый и пятый анализы имеют 19 параллельных культур каждая.
   2. Передача 1 мл привитых носителей в каждую скважину из 96 глубоких скважин пластины в соответствии с рандомизированной макет.
   3. Закрепите крышку глубокой пластины колодца с лентой. Не фиксировать крышку плотно, потому что рост культуры чувствителен к количеству аэрации.
   4. Взвесьте всю тарелку с крышкой и лентой и встряхните тарелку при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия. Поместите 2 л дистиллированной воды в инкубатор, чтобы стабилизировать количество испарения среди экспериментальных наборов.
4. Определите размер инокулума путем покрытия 10 злител каждого из привитых носителей на неселективной пластине агара Тетразолия (TA) (см. Дополнительную таблицу 1). Используйте стерильный L-образный распределитель до тех пор, пока поверхность агара не высохнет. Инкубировать TA агар пластины крышкой вниз на ночь при 37 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TA agar - это богатый агар, содержащий сахар L-арабинозы и водорастворимый краситель 2,3,5-тримфинилтритразолий хлорид, который бесцветный в своей окисленной форме. Когда бактерии уменьшают краситель, он становится красным из-за образования формазана. Колонии на Агар TA, которые не могут использовать L-arabinose темно-красный. Другие штаммы, такие как MG1655, розоватые. Использование TA агар, а не стандартный агар LB рекомендуется, потому что цветные бактериальные колонии легче обнаружить, что делает колонии подсчета более надежным и быстрым.
5. Подготовка селективного TA агар, содержащий рифампицин в 6 хорошо пластин. Пипетка 5 мл селективного агара TA в каждую скважину из 6 колодцев. Подготовка антибиотика рифампицин как раз перед его добавлением в агар TA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда циклоцерин используется в качестве маркера, используйте Дэвис минимальной среде с 250 мг / л глюкозы дополняется агар и L-arabinose и 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида в качестве селективного агара. А именно, TA агар не выбирает только клетки, которые устойчивы к циклоцерину, потому что триптон и дрожжевой экстракт (оба основных компонента агара TA) содержат аминокислоту D-аланина. Эта аминокислота антагонизирует противомикробный эффект циклоцерина и позволяет всем клеткам создать колонию.
   1. Оставьте селективные и оставшиеся неселективные пластины в темноте (например, в коробке) при комнатной температуре.

3. День 3: Покрытие культур на селективных и неселективных агар плит

1. Подсчитайте колонии, формирующие единицы (CFU) на неселективных агарных пластинах и определите размер прививки путем умножения CFU на 100. Это соотношение между объемом параллельной культуры (1 мл и 1000 л) и объемом покрытием (10 л).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если неселективные пластины хранятся в холодильнике, CFU можно пересчитать позже.
2. После 24 ч инкубации, взвесьте всю глубокую скважину пластины, чтобы определить количество испарения. Это, вероятно, составит около 10%.
3. Рассчитайте средний объем параллельной культуры после 24 ч инкубации(V24ч)в микролитрах, используя стартовый объем V0ч.1000 л, а вес пластины преобразуется в микролитры, где плотность среды роста измеряется в мг/мл. В этом исследовании используется плотность 1 мг/л:
   
4. Передача трех случайно выбранных культур в анализе (15 в общей сложности, выделенных с черным кругом в макете на рисунке 1B) в помечены микроцентрифуговых труб. Оставьте их на скамейке, которые будут использоваться позже (см. шаг 3.6) для определения окончательного размера популяции (или N_т).
5. Плита оставшихся 81 параллельных культур из глубокой пластины хорошо на селективной Агар TA, содержащий рифампицин. Pipette одно вся параллельная культура от плиты 96 глубокого наилучшим образом в один наилучшим образом 6-колодца плиты. Убедитесь, что любая 6-хорошая пластина содержит параллельные культуры из более чем одного флуктуации.
   1. Снимите крышки с селективных агарпластинок и оставьте нераскрытыми в стерильных условиях. Высушите всю жидкость на поверхности селективного агара TA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агар быть полностью сухим имеет решающее значение. Однако, не перекрывайте селективный агар TA, потому что он не должен быть позволено треснуть.
6. В то время как селективные пластины агара TA сушат, что может занять до нескольких часов, определите N_т из 15 культур, подготовленных в шаге 3.4 с использованием единиц формирования колоний (CFU).
   1. Определите CFU путем разбавления культур от микроцентрифуговых труб. Используйте пять 10-кратных шагов разбавления, смешивая и вихря 900 л сольного раствора с 100 зл культуры на каждом шагу. Плита 40 л последнего разбавления (с коэффициентом разбавления 10⁵⁾на неселективном агаре TA и инкубировать пластины крышкой вниз на ночь при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серия разбавления в 96 скважинах может быть выполнена с помощью многоканального пипетки, что может увеличить скорость этого шага.
7. После того, как все колодцы на 6 хорошо пластины свободны от культуры жидкости, положить крышку обратно и место 6 хорошо пластины с крышкой вниз на скамейке, пока все 6 хорошо пластины сушат. После того, как все высохнет, инкубировать пластины крышкой вниз на 37 градусов по Цельсию в течение 44-48 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для других маркеров (налидиксовая кислота, циклобрина, гигромицин В или 5-FOA) насигает пластины в течение 68-72 часов. Убедитесь, что влажность в инкубаторе высока. Очень важно, чтобы селективные агарные пластины не высохли в инкубационный период.

4. День 4: Определение количества ячеек в культурах

1. Подсчитайте CFU на неселективных агарпластинах. Оцените количество жизнеспособных клеток в культуре, умножив CFU с коэффициентом разбавления (10⁵) и соотношением между рассчитанным средним объемом V24чв микролитрах (см. шаг 3.3) и объемом покрыванной (40 ql):
   
2. N_т конкретного генотипа, растущего в определенной среде, является средним значением этих ценностей из трех культур.

5. День 5: Оценка коэффициента мутации

1. Подсчитайте количество колоний, устойчивых к антибиотику, на селективных тарелок агара TA (т.е. количество устойчивых клеток, возникших в результате спонтанной мутации в глубокой скважине в дни 2–3). Запись распределения между параллельными культурами наблюдаемого числа мутантов для конкретного асссея (например, 16 или 17 значений, включая нулевые подсчеты).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если селективные пластины хранятся в холодильнике, колонии устойчивы к антибиотику можно пересчитать позже.
   1. Используйте каждое распределение, чтобы оценить количество мутационных событий, m,используя R-пакет флан³⁶.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует также R-пакет rSalvador с аналогичной функциональностью²⁹.
   2. Сохранить распределение наблюдаемых мутантов для одного ассеима в текстовом файле в виде одного столбца.
2. Используйте программное обеспечение Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) для оценки м, как описано ниже.
   1. В вкладке Гипотеза Тестирование оставить значения по умолчанию (т.е. Неизвестный Фитнес галочкой, Метод оценки - Максимальная вероятность (ML), Распределение мутантных Lifetime - Экспоненциальный (LD модель), Винсор Параметр No 1024, Мутация номер и фитнес No 1, Уровень доверия 0,95, Количество класса и максимальное значение No 100).
   2. Нажмите Просмотр и выберите текстовый файл с распределением наблюдаемых мутантов. Сначала попробуйте с помощью файла дополнительных данных.
   3. После загрузки файла нажмите на Perform Test. На правой стороне под Результат теста, в рамках одного образца ML-тест (LD модель), найти номер мутации. Это м,ожидаемое количество мутационных событий.
   4. В соответствии с 95 Процент доверия Интервал для мутации номер найти верхней и нижней границы м.
3. После того, как m и N_t (определяется CFU) доступны, оцените скорость мутации конкретного генотипа в конкретной среде как . Разделите верхние и нижние границы на m на N_т таким же образом, чтобы генерировать доверительные интервалы на частоту мутаций (NB это не учитывает неопределенность в N_t).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты представлены как скорость мутации на rpoB локуса на поколение. Скорость мутации на базовую пару генерируется путем деления скорости мутации на rpoB локус на 79, что является нашим текущим знанием о том, сколько точечных мутаций в гене rpoB придают устойчивость рифампицину^37. Умножение частоты мутаций на нуклеотид на размер хромосомы(E. coli K-12 MG1655 и 4 639 675 bp) дает частоту мутаций на геном.
4. Повторите шаги 5.1'5.3 с оставшимися четырьмя анализами колебаний.

Результаты

Результаты были собраны с зарегистрированным протоколом в 4 по-разному неделях 3 по-разному индивидуальными исследователями, где каждая неделя плита 96 глубоких скважин была использована для того чтобы произвести 5 оценок тарифа перегласовки. В общей сложности три 96 глубоких скважинных пластин генерировали 15 оценок скорости мутаций (95% доверительный интервал, CI)в E. coli K-12 MG1655(Рисунок 2A, как используется в протоколе), в то время как одна пластина глубокой скважины 96 была использована для пяти оценок (95% CI) E. coli K-12 BW25113 На рисунке 2 средняя точность с межкварттилным диапазоном оценки m составляет 17,5% (1,00% и 28,9%, n и 20). Точность является коэффициентом изменения ожидаемого количества мутационных событий(м),рассчитанного как _м/м х 100% (где расчет, как показано ранее³⁸). Необработанные данные по рисунку 2 доступны в дополнительном файле данных "Krasovec_etal_JoVE_data.csv". Дополнительный файл данных сопровождается R-скриптом для генерации рисунка 2. Смотрите также Дополнительную таблицу 2 для получения более подробной информации о бактериальных штаммов, и дополнительная таблица 3, где столбцы в файле данных объясняются. Точки данных, полученные с рифампицином и налидиксовой кислотой, были ранее опубликованы в Kra'ovec et al.¹⁰ и имеют те же идентификаторы здесь, что и при первой публикации.

На рисунке 2А представлены частоты мутаций MG1655 трех различных фенотипических маркеров, циклозерина, рифампицина и налидиксовой кислоты. Здесь, скорость мутации были оценены в Дэвисе минимальной среде с 80, 125, и 250 мг/л глюкозы, как поясняется в протоколе. В одном случае было использовано 1000 мг/л глюкозы(рисунок 1В). На практике можно использовать любую начальную концентрацию глюкозы. Как и ожидалось, частота мутаций была выше для резистентности циклобрина, самая низкая для сопротивления налидиксовой кислоты, и скорость устойчивости рифампицина была в середине. Это в соответствии с известными размерами цели для этих трех сопротивлений, где самый большой для циклорезина и самый маленький для налидиксовой кислоты. В ходе обсуждения и диаграммы 3 подробно рассказывается о том, как использовать целевые размеры, объемы параллельных культур и уровень питательных веществ в окружающей среде для оптимизации измерения частоты мутаций микробов с помощью анализов колебаний.

Анализ колебаний ясно показывает, какой штамм является составным мутатором и который имеет нормальные показатели мутации. ШтаммmutT имел приблизительно 50x более высокую скорость мутации к устойчивости nalidixic кислоты(Рисунок 2B) как MG1655 (Рисунок 2A). Однако для определения скорости мутации конкретного генотипа в различных средах рекомендуется делать по крайней мере пять репликатов на генотип в среду, используя только один фенотипический маркер. Для подробного изложения статистических методов, ранее используемых для анализа этого типа эксперимента,см.

Рисунок 2: Репрезентативная цифра частоты мутаций, оцениваемая по колебаниям в популяциях кишечной палочки. (A) Скорость мутации, определяемая зарегистрированным протоколом в диком типе MG1655 (круги). На рисунке показаны показатели мутаций в присутствии рифампицина (светло-голубые круги), налидиксовой кислоты (красные круги) и килокерина (темно-синие круги) сопротивления. Для налидиксовой кислоты использовались большие объемы культуры в 10 мл (см. Дополнительный файл данных). Данные по рифампицину и налидиксовой кислоте перерисовываются с рисунка 2a в Крашовце и др.¹⁰. (B) Скорость мутации к сопротивлению nalidixic кислоты в мутанте Keio³⁹ йmutT (красные треугольники). Обратите внимание на логарифмическую шкалу на оси скорости мутации. Ошибки баров - 95% доверительных интервалов, рассчитанных по мере объяснения в протоколе. Данные перекрываются с рисунка 4а в Крашовце и др.¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Диаграмма для устранения неполадок в ходе асссы о колебаниях. Диаграмма потока должна следовать сверху, решая три вопроса в желтых алмазах в свою очередь, корректировка протокола в соответствии с содержанием результирующих зеленых ящиков, и реализация протокола, как указано в красных овалах. Более подробную информацию о том, как устранить неполадки, можно найти в первых трех абзацах обсуждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Формулы для носителей, используемых в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительная таблица 2: Бактериальные штаммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительная таблица 3: Подробное описание столбцов в файле необработанных данных Krasovec_etal_JoVE_data.csv. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительные файлы данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.

Обсуждение

Любая оценка частоты мутаций должна максимизировать точность, достигнутую для того, чтобы обеспечить повторяемость и воспроизводимость внутри и между исследованиями^34. Для проведения флуктуации существует три критических соображения. Первые два были установлены в протоколе, но потребуется устранение неполадок (см. рисунок 3),если протокол адаптирован для работы с различными штаммами или средами. Во-первых, выбрать соответствующий фенотипический маркер. Для бактерий рекомендуется оценить скорость по одному из двух маркерных локций, rpoB или gyrA,придавая устойчивость к антибиотикам рифампицин и налидиксивая кислота, соответственно. Целевой размер мутаций к устойчивости к антибиотикам в этих двух локусов отличается. Есть 79 и 20 уникальных мутаций, придающих устойчивость к рифампицин³⁷ и nalidixic кислоты⁴⁰ соответственно. На практике это означает, что в среднем чаще наблюдаются резицивые мутанты, устойчивые к рифампицину. Итак, первый вопрос (No 1 на рисунке 3),на который необходимо ответить, заключается в том, является ли штамм мутатором. При изучении составных мутаторов, где ожидается много наблюдаемых колоний мутантов, лучше использовать маркер с меньшим целевым размером (например, налидиксовая кислота). См. Рисунок 2B, где частота мутаций составного мутатора E. coli K-12 BW25113 ,mutT были оценены с использованием налидиксовой кислоты в качестве маркера. При работе с немутаторными бактериальными штаммами, которые имеют дикий тип (т.е. нормальный) уровень мутации, рифампицин является лучшим выбором (см. Рисунок 2А). Если по какой-то причине требуется больше наблюдаемых мутантов, то соответствующим маркером является устойчивость к циклоборину. Для этого маркера мутации резистентности могут возникать в более чем десяти генах^41,что означает, что размер цели даже больше, чем для рифампицин. При изучении дрожжей и археев рекомендуется оценить частоту мутаций в 25S рибосомных белках и URA3, придавая устойчивость к гигромицину В и 5-фторо-оротовой кислоте (5-FOA), соответственно.

Вторым важным соображением является объем параллельных культур. Какой объем использовать зависит от фактического количества наблюдаемых мутантов. Ожидаемое число наблюдаемых мутантов зависит от целевого размера выбранного фенотипического маркера, способности штамма восстанавливать и избегать мутаций (средняя скорость мутации), а также переносимости окружающей среды, на которую влияет как используемые средства массовой информации, так и объем культуры. Если нет параллельных культур содержат колонии мутантов, устойчивых к рифампицин, то циклоцерин должен быть использован или количество покрывало клетки должны быть увеличены. Это может быть достигнуто путем добавления большего количества глюкозы в минимальную среду или путем выращивания клеток в более богатой (или полной) среде. Однако во многих случаях такое увеличение плотности населения связано со снижением частоты мутаций, что приводит к ограниченному, если таковое, увеличению числа колоний-мутантов, наблюдаемых^10. Если увеличение питательных веществ не является решением, то увеличение числа клеток за счет увеличения объема каждой параллельной культуры является одним из вариантов. Когда окружающая среда включает в себя минимальные соли с сахаром в качестве единственного источника углерода и энергии (т.е. ответ на Q2 на рисунке 3 является "минимальной средней"), то объемы между 0,5 и 1,5 мл должны быть использованы. Если окружающая среда богата, то объемы параллельных культур должны быть между 0,35-1 мл. Последний вопрос касается медианного числа устойчивых колоний. Если наблюдается слишком мало колоний мутантов (т.е. ответ на 3-й показатель на рисунке 3 и окружающая среда не должна быть изменена, то следует увеличить объем параллельных культур или использовать антибиотик с большим целевым размером (например, циклозерин). С другой стороны, если много колоний мутантов наблюдается на всех селективных пластинах (более 150 евро за тарелку, см. рисунок 3),то количество покрых клеток должно быть уменьшено, что обычно означает использование меньшего объема или переключение на антибиотик с меньшим целевым размером (например, налидиксовая кислота).

Как только том выбран, самое лучшее что все параллельные культуры на одном 96 глубоком наилучшим образом плите имеют такой же том. Это позволяет более точно определить фактический объем параллельных культур от веса пластины. При сравнении частоты мутаций определенного генотипа между различными средами, опять же лучше всего использовать один и тот же объем параллельных культур во всех средах. Если налидиксиновая кислота используется для оценки дикого типа (т.е. нормального) уровня мутации или какого-либо другого фенотипического маркера, который имеет еще меньший целевой размер, чем налидиковая кислота, то объем должен быть увеличен еще больше. Одним из вариантов является создание параллельных культур в трубах 50 мл с объемом до 15 мл. Например, 10 мл параллельных культур были подготовлены в 50 мл труб при оценке E. coli K-12 MG1655 скорость мутации налидиксовой кислоты (см. Рисунок 2A). Параллельные культуры 10 мл были затем покрыты селективным агаром TA и вылиты в большие 150 мм пластин вместо стандартных 90 мм посуды Петри. Недостатком подготовки параллельных культур в 50 мл труб является то, что пропускная мощность значительно ниже по сравнению с анализом частоты мутаций в 96 глубокой скважине пластины. Одним из решений является уменьшение числа параллельных культур. Однако это повлияет на точность оценки м,которая зависит от ожидаемого количества мутационных событий и количества параллельных культур^26. Получение распределения наблюдаемых мутантов с 14–17 параллельными культурами (как это было сделано на рисунке 2),является хорошим балансом между твердой пропускной стоимостью и приемлемым уровнем точности^26-20%. Средний уровень точности в 17,5% аналогичен медианной точности с межквартильной аранжой 16,4% (5,7%-38,9%, n и 580), рассчитанной на основе гораздо большего набора данных^10. Таким образом, рекомендуется при подготовке параллельных культур в 96 глубоких скважинных пластинах или 50 мл труб распределение наблюдаемых мутантов получено по крайней мере с 14 параллельными культурами. При оценке частоты мутаций в различных средах рекомендуется проверить уровень точности, выполнив многослойный эксперимент, в котором все 96 параллельных культур на одной пластине выращиваются в одной среде. Кроме того, при подготовке параллельных культур, очень важно, чтобы прививки содержат небольшое количество клеток, потому что это снижает шансы любых устойчивых клеток, присутствующих в инокулуме. Существующие устойчивые мутанты не нужны в инокулуме, так как они увеличатся в численности и создадут газон на селективных пластинах и оценить скорость мутации не удастся. Например, в большинстве популяций кишечной палочки уровень мутации до устойчивости к рифампицину составляет порядка 10^-8евро. Таким образом, чтобы избежать прививки культуры с уже существующим устойчивым мутантом, необходимо привить менее 10⁸ клеток (например, 10³10⁴ клетки). Последним критическим шагом является обеспечение того, чтобы перед инкубированными селективными агарными пластинами поверхность на селективном агаре полностью высохла. Распределители не могут быть использованы, если используются 6-колодные пластины и первоначальный объем параллельной культуры составляет 1 мл, например. Плиты должны быть обнаружены в стерильных условиях, чтобы поверхность жидкости высохнуть. Время, которое это занимает, может быть сильно изменчивым, зависящим от условий окружающей среды и состояния пластин. Это время должно быть сведено к минимуму, но может быть до нескольких часов.

Флуктуционная асссеия имеет неотъемлемые ограничения. Он инспорачирует фенотипические маркеры мутации только в небольшом подмножестве генома. Таким образом, анализ требует больших популяций, которые проходят через достаточное количество поколений, чтобы наблюдать достаточное количество мутаций, чтобы оценить скорость вообще. Это означает, что флуктуации анализы могут быть использованы только на организмы, которые способны проходить через большое количество поколений быстро, как бактерии, пекаря дрожжи⁴², или жидкой культуры млекопитающих клеток³⁰. Кроме того, мутации являются редкими событиями, происходящими в конкретных биохимических условиях конкретной клетки. Тот факт, что колебания анализы смотреть через большие популяции клеток с течением времени означает, что эти обстоятельства могут существенно отличаться. Используя этот анализ, поэтому трудно изучить прогрессирование показателей мутации конкретной популяции от фазы задержки до ранней и поздней экспоненциальной фазы и, наконец, к стационарной фазе. Любая дифференциация частот мутаций среди одиночных клеток в популяции полностью скрыта от флуктуации. Одноклеточная динамика мутации может быть изучена с помощью одномолекулярного отслеживания репарации ДНК белка MutS⁴³ или путем подсчета очагов накопленных белков MutL^44. Последние достижения в области секвенирования высокой пропускной способности также позволили напрямую оценить частоту мутаций от родительских трио^9,45 и многопоколения родословных^46. Такие методологические достижения начинают позволять прямое подсчет мутаций, происходящих в течение одного поколения. Однако этот прямой подход требует дорогостоящих и современных технологий, таких как флуоресцентная микроскопия, микрофлюиды или секвенирование всего генома. С другой стороны, флуктуации являются относительно недорогими и требуется только стандартное лабораторное оборудование. Делать больше анализов флуктуации также облегчит поколение новых гипотез, которые могут быть проверены с помощью более прямых одноклеточных подходов.

Существует давний интерес к изучению мутаций, так что колебания анализ, скорее всего, останется широко используемым методом. Число цитирований основополагающей статьи Лурии и^{Дельбрюка 5} за последние 4 года (2015-2018) входило в пятерку лидеров по количеству цитирований этого документа. Однако, из-за большого количества точной ручной работы, необходимой для правильного проведения анализа колебаний, большинство исследований проводят лишь несколько анализов колебаний. Это, однако, недостаточно для выявления экологических зависимостей от частоты мутаций. Путем рационализации флуктуации анализы с помощью нескольких пластин, как описано в этой работе, текущая максимальная пропускная их часть возможна 11 глубоких пластин скважин (55 анализов колебаний) параллельно, как описано здесь. Запуск двух наборов флуктуаций анализы пошатнулся в день параллельно, позволяет проводить до 110 анализов в неделю. Еще одно изменение пропускной мощности может быть возможно путем автоматизации различных этапов анализов колебаний из чисто ручного протокола. Кроме того, для изучения экологических зависимостей от частоты мутаций необходимо учитывать плотность населения. Предыдущие результаты¹⁰ показывают, что при учете известных факторов, влияющих на скорость мутаций, контроль плотности населения может сократить различия в оценках уровня мутаций более чем на 90%. Для контроля плотности мы рекомендуем определить N_t (используется для оценки частоты мутаций) независимо от метода, используемого для определения плотности населения. В бактериях N_t можно определить по CFU и плотности, например, с АТФ на основе люминесценции асссы¹⁰.

Высокая пропускная система и контроль плотности имеют важное значение при изучении того, как экологический контекст организма влияет на скорость спонтанной мутации. Знание существования пластичности частоты мутаций имеет важное значение, но понимание ее причин и последствий являются ключевыми проблемами, которые необходимо решать, если необходимо включить пластичность частоты мутаций в более широкий биологический контекст. Анализ колебаний является отличным инструментом, который может быть использован для проверки многих гипотез, потому что результаты получены быстро, и анализы являются недорогими по сравнению с другими методами. На примере, на данном этапе проводится исследование экологических зависимостей от частоты мутаций в бактериальных сообществах и микробиомах. Адаптация анализа колебаний к кокультурам может проверить гипотезу о том, что штаммы влияют на скорость мутации друг друга с помощью небольших молекул. Ведение тысяч флуктуаций анализов с культурами может определить, если штаммы различаются как в их способности изменять друг друга мутации скорости и в их восприимчивости, чтобы их скорость мутации изменены другими. Возможно, изменение между штаммами в восприимчивости к манипуляциям с частотой мутаций связано с конкретными генетическими вариациями. Это может изменить наши взгляды на то, как эволюция работает в сложных сообществах, не в последнюю очередь в примерах широкого значения, таких как, как устойчивость к противомикробным препаратам возникает.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл Микроцентрифужные пробирки	Starlab International GmbH	S1615-5550
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид	Sigma-Aldrich	T8877-10g
6-луночные планшеты	Greiner Bio-One	REF 657102
90 мм Чашки Петри Тройная вентиляция	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 глубоколуночная пластина (Мастерблок 2 мл)	Greiner Bio-One	REF 780270
Сульфат аммония	Fisher Chemical	A/6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Экстракт дрожжей Bacto	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Циклосерин	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Только для определения альтернативного фенотипического маркера
D-глюкоза безводная	Fisher Chemical	G/0500/61
50 мл центрифужная пробирка	Corning	REF 430828
L-(+)-арабиноза	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Сульфат магния гептагидрат	Fisher Chemical	M/1050/53
Налидиксовая кислота	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Только для анализа альтернативы фенотипический маркер
Фосфат калия двухосновной тригидрат	Sigma-Aldrich	P5504-500г
Фосфат калия одноосновной	Sigma-Aldrich	P0662-500г
Рифампицин	EMD Millipore Corp, США	557303-1GM
Хлорид натрия	Fisher Chemical	S/3160/60
Спектрофотометр	Jenway	6320D
Тиамина гидрохлорид	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Дигидрат цитрата натрия дигидрат	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Триптон	Fisher Chemical	1278-7099