Этот протокол описывает, как измерить кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans. Этот метод полезен для фундаментальных биологических исследований по здоровью кишечника, связанных с взаимодействием кишечных бактерий и их хозяина и для скрининга для выявления пробиотических и химических агентов для лечения синдрома вытекающей кишечника и воспалительных заболеваний кишечника.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение воздействия бактерий и химических веществ на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В живых организмах гиперпроницаемость кишечника является серьезным симптомом, который приводит ко многим воспалительным заболеваниям кишечника (IBD). Caenorhabditis elegans является немлекопитающим животных модель, которая широко используется в качестве системы анализа из-за его короткий срок службы, прозрачность, рентабельность и отсутствие вопросов этики животных. В этом исследовании был разработан метод для исследования воздействия различных бактерий и 3,3'-diindolylmethane (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans с высокой пропускной способностью системы анализа изображений. Черви были инфицированы различными бактериями кишечника или cotreated с DIM в течение 48 ч и кормили флуоресцен изотиоцианат (FITC)-dextran ночь. Затем проницаемость кишечника была изучена путем сравнения флуоресценции изображений и интенсивности флуоресценции внутри червя органов. Этот метод может также иметь потенциал для выявления пробиотических и патогенных кишечных бактерий, которые влияют на проницаемость кишечника в животной модели и эффективен для изучения влияния вредных или способствующих здоровью химических веществ на проницаемость кишечника и кишечного здоровья. Однако, этот протокол также имеет некоторые значительные ограничения на генетическом уровне, особенно для определения того, какие гены изменяются для контроля болезни, потому что этот метод в основном используется для фенотипического определения. Кроме того, этот метод ограничивается определением того, какие именно патогенные субстраты вызывают воспаление или увеличивают проницаемость кишечника червей во время инфекции. Поэтому для полной оценки функции бактерий и химических веществ при определении проницаемости кишечника необходимы дальнейшие углубленные исследования, включая изучение молекулярно-генетического механизма с использованием мутантных бактерий и нематод, а также анализ химических компонентов бактерий.
Введение
Проницаемость кишечника считается одним из основных барьеров, связанных с кишечной микробиотой и слизистым иммунитетом и, вероятно, будет зависеть от нескольких факторов, таких как изменения микрофлоры кишечника, эпителиальные нарушения, или изменения слизистого слоя1. Последние документы сообщили эффективные протоколы для измерения кишечной проницаемости культивированных клеток кишечника человека путем анализа флуоресценции поток ставки через слой клеток кишечника2, но меньше научных работ представляют собой подходящую процедуру для измерения проницаемости кишечника в нематод, особенно в C. elegans, с помощью F....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка P. aeruginosa PAO1 и Escherichia coli OP50 Культура
- Приготовьте 500 мл стерилизованной среды Лурия-Бертани (LB)(таблица 1)и привить одну колонию P. aeruginosa в среду. Инкубировать культуру от 14 до 15 ч при 37 градусах Цельсия со скоростью встряхивания 150 об/мин.
- Равномерно распределить бактериальную культуру на две центрифуги 500 мл и центрифуги труб при 3220 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
- Удалите супернатант до тех пор, пока объем не будет 50 мл (одна десятая от первоначального объема) и повторно бактериальных гранул.
- Храните концентрированну....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После инкубации с P. aeruginosa PAO1, C. elegans показал значительное увеличение FITC-декрен флуоресценции в организме червя по сравнению с флуоресценцией, показанной после инкубации с другими двумя бактериальными штаммами (Рисунок 1). Интенсивность флуоресценции червей, питаемых кишечной палочкой OP50, P. aeruginosa PAO1 и E. faecalis KCTC3206, составила 100,0 и 6,6, 369,7 и 38,9 и 105,6 и 10,6%, соответственно. Данные подчеркивают, что P. ae.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Используя этот новый метод определения проницаемости кишечника в C. elegans, который сочетает в себе автоматизированную флуоресцентную микроскопию и количественный анализ изображений, различия, вызванные кишечными микроорганизмами или химическими веществами, могут быть определены в vivo, в частности, в кишечнике C. elegans. Этот протокол полезен для исследований проницаемости кишечника и применим ко многим задачам, таким как определение реактивных видов кислорода (ROS) в стрессовых условиях и морфологич.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Корейским институтом науки и техники в интрамуральных исследований грант (2E29563).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3,3'-дииндолилметан | Sigma | D9568 | |
| в 90 раз; 15 мм чашки Петри | SPL Life Sciences, Южная Корея | 10090 | |
| 60× 15 мм чашки Петри | SPL Life Sciences, Южная Корея | 10060 | |
| Бактор Агар | Бектон Дикинсон | REF. 214010 | |
| Раствор формальдегида | Sigma | F1635 | |
| Инфузия мозга и сердца (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Дикий тип | |
| Холестерин | Sigma | C3045 | |
| Пластина для анализа Коста, 96 Лунка черная с прозрачным плоским дном Необработанный, без крышки Полистирол | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Диметилсульфоксид | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Корейская коллекция для типовой культуры | KCTC NO. 3206 | Фальсикатный анаэробный |
| Escherichia coli OP50 | Центр генетики ценорхабдита (CGC) | ||
| Флуоресцеин изотиоцианат - программное обеспечение dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB средний | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Магния сульфат гептагидрат | Биореагенты Fisher | BP2213-1 | |
| Флюорограмма водная монтажная среда | Sigma | F4680 | |
| Оперетта CLS Система анализа высокого содержания | PerkinElmer | ||
| Пептон | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Корейская коллекция для типовой культуры | KCTC NO. 1637 | |
| Биореагенты | хлорида натрия | Фишера BP358-1 | |
| Стереомикроскоп | Nikon, Япония | SMZ800N | |
| Экстракт дрожжей | Becton Dickinson | REF. 212750 |
Ссылки
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
