Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественная оценка пролиферативной и мертвой клетки в Enteroids

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60501

⸱

31 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Представленный протокол использует цитометрию потока для количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных вратах мыши. Этот метод полезен для оценки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию и выживание органов.

Аннотация

Кишечный эпителий действует как барьер, который предотвращает проникновение в остальную часть тела содержимого светила, например патогенной микробиоты и токсинов. Функция эпителиального барьера требует целостности кишечных эпителиальных клеток. В то время как эпителиальная пролиферация клеток поддерживает непрерывный слой клеток, который образует барьер, эпителиальный ущерб приводит к барьерной дисфункции. В результате содержимое светильника может пересекать кишечный барьер неограниченным путем. Дисфункция кишечного барьера была связана со многими кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника. Изолированные мыши кишечные склепы могут быть культивированы и поддерживается как склеповидные структуры, которые называются кишечными органоидами или "энтероидами". Энтероиды идеально подходят для изучения пролиферации и клеточной смерти кишечных эпителиальных клеток in vitro. В этом протоколе мы описываем простой метод количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных энтероидах. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) и пропидий йодид используются для обозначения размножающихся и мертвых клеток в энтероидах, а доля размножающихся и мертвых клеток затем анализируется цитометрией потока. Это полезный инструмент для проверки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию эпителиальных клеток кишечника и выживание клеток.

Введение

Фундаментальная функция кишечных эпителиальных клеток заключается в защите попадания содержимого светила, таких как патогенные бактерии и токсины1,2. Для выполнения такой функции, кишечные стволовые клетки непрерывно размножаться и дифференцироваться в различные эпителиальные клетки, в том числе энтероцитов и секреторных клеток, которые образуют барьер, образуя тесные соединения3. Быстрое обновление кишечных эпителиальных клеток требует строгой координации пролиферации клеток, дифференциации клеток и гибели клеток4,5. Снижение пролиферации клеток или чрезмерная гибель клеток приводит к эпителиальному повреждению и скомпрометированной функциибарьера1,6. Дисфункция кишечного барьера была связана с воспалительными заболеваниями кишечника7,8.

Ранее был разработан метод культуры кишечных склепов. Используя этот метод, изолированные мыши ные склепы растут в кишечные органоиды (enteroids), которые имеют crypt-villus как структуры и содержат все кишечной эпителиальной линии клеток9,10. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) является аналогом тимидина, который способен заменить тимин (T) в ДНК, которая проходит репликацию во время пролиферации клеток. Пролиферативные клетки могут быть быстро и точно помечены EdU окрашивания. Propidium iodide (PI) является аналогом бромида этидия, который высвобождает красную флуоресценцию при вставке в двухцепочечную ДНК. PI специально обнаруживает мертвые клетки, так как он проходит только через поврежденную мембрану клетки.

В этом протоколе мы сначала описываем, как изолировать склепы из тонкой кишки, а затем культивировать их как ветероиды in vitro. Затем мы описываем, как анализировать пролиферативные и мертвые клетки в enteroids EdU и PI включения и потока цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Кембриджского-Судаского геномного ресурсного центра (CAM-SU) при Университете Соохова.

1. Кишечная органоидная изоляция и культура

  1. Изоляция кишечных склепов и энтероидной культуры
    1. Эвтаназия 8-недельная мышь дикого типа с ингаляцией CO2. Используйте щипцы ткани и тонкие ножницы радужной оболочки, чтобы вскрыть примерно 8 см илеума.
    2. Промыть с помощью шприца с gavage кормления иглы около 40 мл ледяной Dulbecco в фосфат-буферный солей (DPBS), а затем вырезать вдоль с ножницами и открыть ileum.
    3. Разрежьте илеум на мелкие (0,5–1,0 см) кусочки. Поместите кусочки в 5 мл стерильных ледяных DPBS в 15 мл конической трубки, затем рок в течение 5 минут на льду.
    4. Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать DPBS и заменить его 10 мл холодного буфера 1 (2 мМ EDTA в DPBS). Рок в течение 30 минут на льду.
    5. Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать буфер 1 и заменить 10 мл холодного буфера 2 (54,9 мМ D-сорбитол, 43,4 мм сахарозы в DPBS). Встряхните вручную (80 коктейлей/мин).
    6. Возьмите 20 капель ногой буфера 2 содержимого после встряхивания и проинспектировать под микроскопом.
    7. Фильтр буфера 2 содержимое с 70 мкм стерильной ячейки ситечко, а затем собрать фильтрованный буфер с 50 мл конической трубки.
    8. Пипетка 20 л фильтрана на слайде, чтобы подсчитать склепы. Перенесите достаточный объем буфера 2 со шага 1.1.7, чтобы обеспечить наличие склепов/скважин ы 500 евро.
    9. Спин вниз на 150 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. После того, как спиннинг закончен, тщательно аспирируйте супернатант.
    10. Приостановить склепы в 50 qL подвала мембранной матрицы (например, Matrigel) на 500 склепов, пипетка вверх и вниз (будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков), а затем поместить 50 л капли подвала мембраны матрицы / крипто смеси в центре одного колодца в 24 хорошо пластины. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию для полимеризации мембранной матрицы подвала.
    11. После 30 минут полимеризации, тщательно добавьте 600 л минигут-носителей (продвинутый dulbecco в модифицированных Eagle среды "DMEM"/F12, 2 мМ L-аланин-L-глутамамин, перо / стрептококк 100 единиц / мл, 10 мМ hepes, N2 дополнение «1:100», Дополнение B27 (1:50) с эпидермальным фактором роста (EGF; 50 нг/мл), Noggin «100 нг/мл», R-спондин (500 нг/мл) и Y27632 »10 м/м) в каждом колодце, затем верните пластину к каждому. Наблюдайте под микроскопом каждый день и меняйте носители каждые 2–3 дня.
  2. Энтероид проходив
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для длинных культур, enteroids должны быть разделены примерно каждую неделю.
    1. Для прохождения входоидов поместите пластину культуры тканей на лед. Аспирировать средства массовой информации и добавить 1 мл холодного DPBS к каждой скважине. Используйте p1000 наконечник пипетка вверх и вниз, пока не твердых подвале мембраны матрицы куски остаются.
    2. Проходите вверх и вниз один раз через 1 мл инсулина шприц (27 G) и в 15 мл конической трубки. Спин вниз в течение 5 мин при 150 х г при 4 градусах По Цельсию.
    3. Используйте пипетку для удаления DPBS. Повторное в 50 зл ес подвальной мембранной матрицы/ хорошо.
    4. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы позволить мембранной матрице подвала полимеризоваться. Наложить каждую скважину с 600 мл носителей ENR (минигут-медиа, 50 нг/мЛ EGF, 100 нг/мл Ноггин, 500 нг/мл R-спондин), затем верните пластину в инкубатор.

2. Анализ цитометрии потока EdU-положительных клеток в Enteroids

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс для анализа цитометрии потока в энтероидах.

  1. Инкубация энтероидов с EdU
    1. Расти введите от шага 1.2.4 в течение 5-7 дней. Проход введите в новую 24 скважину пластины в разделении соотношение 1:2. Добавьте 600 л среды ENR к каждой скважине. Инкубировать ветроииды в течение 4-5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
    2. Установите контрольную группу (необработанные ветероиды) и экспериментальную группу (энтероиды, обработанные 5 нг/мл интерлейкина 22 «IL-22»). Подготовьте по крайней мере три реплики для каждой группы.
    3. Добавьте EdU к среде ENR, чтобы подготовить среду EdU с концентрацией 50 мкм. Добавьте 600 кL среды EdU к каждой скважине и инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Установите один колодец enteroids без лечения EdU в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания.
  2. Сбор энтероидов из мембранной матрицы подвала
    1. Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать среду EdU и мыть 1x с DPBS. Добавьте 1 мл DPBS.
    2. Используйте P1000 пипетка отзыв и пипетка вверх и вниз, пока не твердых подвале мембраны матрицы куски остаются. Перенесите на трубку 15 мл и вращайтесь при 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
    3. Добавьте 500 qL клеточных диссоциационных ферментов(Таблица Материалов)и инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия. Используйте P200 пипетка отзыв и пипетка вверх и вниз, чтобы сломать enteroids в одиночные клетки.
    4. Добавьте 3 мл среды DMEM, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и неоднократно пипетку с наконечником пипетки P1000.
    5. Спин вниз на 300 х г в течение 5 минут и аспирации супернатант среды. Приостанавливайте клетки с 1 мл DPBS.
  3. Фиксация и пермяки клеток
    1. Перенесите суспензию клетки в трубку 1,5 мл, снесите 300 х г в течение 5 минут и отбросьте супернатант.
    2. Resuspend клетки с 1 мл 4% параформальдегида (PFA), исправить в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), и спина вниз на 300 х г в течение 5 минут.
    3. Resuspend клетки с 1 мл 0,5% неионический сурфактант. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
    4. Спин вниз на 300 х г в течение 5 минут и аспирации супернатанта. Вымойте 1x с DPBS и спина вниз, чтобы удалить супернатант.
  4. Обнаружение EdU
    1. Подготовьте фондовые решения для каждого компонента заранее: 1) рабочее решение Alexa Fluor azide, 2) рабочее решение 1x EdU буферреакции, и 3) 10x стоковое решение буферной добавки EdU.
    2. Приготовьте буферную добавку 1x EdU, разбавив 10-x раствор 1:10 в деионизированной воде. Приготовьте это решение свежим.
    3. Подготовка реакции коктейль в соответствии с таблицей 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте ингредиенты в порядок, указанный в таблице. Используйте реакционный коктейль в течение 15 минут после приготовления.
    4. Добавьте 100 юаней реакционных коктейлей к каждой трубке 1,5 мл. Приготовите клетки, защитите от света, инкубируют в течение 30 мин на РТ.
    5. Центрифуга при 300 х г в течение 5 минут и аспирируй раствор реакции с помощью наконечника пипетки мягко.
    6. Добавьте 0,5% неионического сурфактанта пенантанта к каждой трубке, чтобы вымыть 1x на RT. Центрифуга при 300 х г в течение 5 минут, аспирировать супернатант с кончиком пипетки мягко, и resuspend клетки в 1 мл DPBS.
  5. Анализ клеток по цитометрии потока
    1. Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко, а затем собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки. Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия ограничены, образцы окрашенных клеток должны храниться в темноте при 4 градусах Цельсия и проверять поток в течение 3 дней.
    2. Выберите подходящий канал (в зависимости от типа азида Alexa Fluor в комплекте EdU; здесь, красный канал) и напряжение (здесь, 150-350 В) для анализа цитометрии потока.
    3. Стратегия Гатинга
      1. Нарисуйте fSC-A (x-оси) против псевдоцветного участка SSC-A (y-axis) и распределите большую часть ячеек в видимый диапазон точечной карты, регулируя напряжение. Выберите популяцию клеток (R1) и исключите мусор в левом нижнем углу.
      2. Из r1 ячейки населения, установить FSC-A (x-оси) против. FSC-H (y-axis) псевдоцвет участок, и установить ворота, чтобы выбрать одиночные ячейки (R2), чтобы исключить ячейки сгустки.
      3. Из R2 ячейки населения, установить интенсивность флуоресценции (x-оси) против. номер ячейки (y-оси) участок, и использовать отрицательный элемент управления, чтобы установить ворота. Область флуоресцентного сигнала является положительной клеточной областью (R3). Сравните соотношение EdU-положительных ячеек (R3) между экспериментальными и контрольными группами.

3. Анализ цитометрии потока PI-положительных клеток в Enteroids

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показан рабочий процесс для анализа цитометрии потока PI-положительных клеток в ветроидах.

  1. Инкубация энтероидных клеток с Pi
    1. Расти введите от шага 1.2.4 в течение 5-7 дней. Проход введите в новую 24 скважину пластины в разделении соотношение 1:2. Добавьте 600 л среды ENR к каждой скважине. Инкубировать ветроииды в течение 4-5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
    2. Установите контрольную группу (необработанную) и экспериментальную группу (IL-22 обработанный), используя по крайней мере три реплики для каждой группы.
    3. Добавьте PI в среду ENR для подготовки PI-среды с концентрацией 3 мкм.
    4. Добавьте 600 qL среднего PI к каждой скважине и инкубировать в течение 30 минут в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Установите один колодец enteroids без лечения Pi в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания.
  2. Урожайные ветоиды из мембранной матрицы подвала следующие шаги 2.2.1-2.2.5.
  3. Анализ клеток по цитометрии потока
    1. Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко и собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки.
    2. Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия ограничены, образцы окрашенных клеток должны храниться в темноте при 4 градусах Цельсия и проверять поток в течение 3 дней.
    3. Выберите подходящий канал (здесь, красный канал) и напряжение (здесь, 150-350 В) для анализа цитометрии потока.
    4. Используйте ту же стратегию gating, описанную в разделе 2.5.3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Небольшие кишечные склепы были изолированы и культивированы как enteroids в подвальной мембранной матрице. Энтероиды начали образовывать бутоны через 2 дня после изоляции. На 6-й день, enteroids было много почек с большим количеством мусора (мертвые клетки) в просвете. Enteroids были готовы к прохождению на данном этапе(рисунок 3).

Многочисленные исследования показали, что воспалительные цитокины имеют важное значение для поддержания кишечного эпителиального гомео...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол детализирует шаги, необходимые для культуры enteroids in vitro и количественной оценки EdU- и PI-положительных клеток в enteroids цитометрией потока. Есть несколько преимуществ этой стратегии. Во-первых, маркировка EdU используется для обнаружения размножающихся клеток в ветроидающих. По сравнению с традиционным исследующим выводом BrdU метод маркировки EdU быстрее, более чувствителен и точен. EdU очень похож на тимин (T), который заменяет тимин в синтезе ДНК во время деления клеток. По сравнению с антитела...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (31971062, 31900326 и 31601022), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20190043, BK20180838), Научно-исследовательским фондом Государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Нанкинский университет (KF-GN-202004). Фонд естественных наук высших учебных заведений Китая Цзянсу (19KJB320003), программа обеспечения жизни и технологии города Сучжоу (SYS2019030) и Программа научно-исследовательской инновационной программы для выпускников колледжей провинции Цзянсу (KYCX19-1981) . Эта работа также поддерживается Тан ученый Университета Soochow.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужная пробирка 15 млCorning430791
22 G gavage иглаVWR20068-608
24-луночная пластинаNunc142475
40 мм стерильный клеточный фильтрBD352340
50 мл центрифугаCorning430829
70 мм стерильный клеточный фильтрBD352350
Усовершенствованный DMEM/F-12GIBCO12634010
Attune NxT Акустический фокусирующий цитометрInvitrogenA24863
B-27 SupplementGIBCO17504044
Buffer 12 мМ EDTA в DPBS
Buffer 254,9 мМ D-сорбит, 43,4 мМ сахарозы у
DPBS C57/B6Нанкинский биомедицинский научно-исследовательский институт Нанкинского университета
Ферменты клеточной диссоциации (TrypLE)Life technologies12605-010
ЦентрифугаEppendorf5424
ЦентрифугаEppendorf5424R
ЦентрифугаEppendorf5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life технологииC10639
CO2 инкубаторPanasonicMCO-18AC
DPBSGIBCO
D-сорбитBBISB0491
EDTABBIEB0185
ENR mediaMinigut media, 50 нг/мл EGF, 100 нг/мл Noggin, 500 нг/мл R-спондин
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10270-106
Ножницы для тонкой радужной оболочкиглаза Tansoole2037454
Флуоресцентный микроскопOlympusFV1000
GlutaMAX ДобавкаGIBCO35050-061
Козья сывороткаLife technologies16210-064
HDMEMHycloneSH30243.01B
HEPESSigmaH4034
MatrigelCorning356231
Minigut mediaAdvanced DMEM/F12, 2 мМ Глутамакс, Penn/Strep (100 единиц/мл), 10 мМ Hepes, N2 добавка (1:100), B27 добавка (1:50)
N2добавка R& DAR009
Неионогенное поверхностно-активное вещество (Triton X)BBITB0198-500ML
Операционные ножницы (12,5 см)Тансоль2025785
параформальдегид (PFA)sigma158127-500g
Penn/StrepInvitrogen15140-148
Фазово-контрастный микроскопNikonTS1000
Пропидия йодидSigmaP4170-25MG
Рекомбинантная EGFPeproTech315-09
Рекомбинантная мышь NogginPeproTech250-38
Рекомбинантная мышь R-Spondin 1R& D3474-RS-050
Рекомбинантный мышиный IL-22PeproTech210-22-10
СахарозаBBISB0498
Щипцы для тканейTansoole2026704
Y-27632 2HC1SelleckS1049
мышей 14190144

Ссылки

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

EdUIL 22
Количественная оценка пролиферативной и мертвой клетки в Enteroids
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.