Методическая статья

Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов

DOI:

10.3791/60503

⸱

18 декабря 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает микрорассечение лазерного захвата для изоляции хряща и кости от свежезамороженных секций эмбриона мыши. Хрящ и кости могут быть быстро визуализированы кресилфиолетовым окрашиванием и собраны именно для получения высококачественной РНК для транскриптомического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции конкретных типов клеток или областей, представляющих интерес от неоднородных тканей. Клеточная и молекулярная сложность скелетных элементов возрастает с развитием. Неоднородность тканей, например, на стыке хрящевых и косых элементов друг с другом или с окружающими тканями, является одним из препятствий для изучения развития хряща и костей. Наш протокол обеспечивает быстрый метод обработки тканей и изоляции хряща и кости, что дает высокое качество РНК для анализа экспрессии генов. Свежие замороженные ткани эмбрионов мыши разделены и краткое кресиловое фиолетовое окрашивание используется для визуализации хряща и кости с цветами, отличными от окружающих тканей. Слайды затем быстро обезвоживаются, и хрящи и кости изолированы впоследствии LCM. Минимизация воздействия вавных растворов в ходе этого процесса поддерживает целостность РНК. Хрящ мыши Мекеля и мандибулярная кость на E16.5 были успешно собраны, а анализ экспрессии генов показал дифференциальное выражение генов маркеров остеобластов, остеоцитов, остеокластов и хондроцитов. Высокое качество РНК также было выделено из целого ряда тканей и эмбрионального возраста. Этот протокол детали образца подготовки для LCM в том числе криоэмбеддинг, секции, окрашивания и обезвоживания свежих замороженных тканей, а также точной изоляции хряща и кости LCM в результате чего высокое качество РНК для транскриптомического анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опорно-крестеская система представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из мышц, соединительной ткани, сухожилия, связок, хряща и кости, иннерватизованной нервами и васкуляризованной кровеносными сосудами1. Скелетные ткани развиваются с возрастающей клеточной неоднородностью и структурной сложностью. Хрящ и кости развиваются из той же линии остеохондропрогенитора и тесно связаны между собой. Эмбриональный хрящ и кости развиваются в сочетании с мышцами, нервами, кровеносными сосудами и недифференцированным мезенхимом. Хрящ также может быть окружен кости, такие как хрящ Мекель и кондилярный хрящ в челюстно-прилежной кости. Эти ткани анатомически связаны и взаимодействуют друг с другом через внеклеточные сигналы во время развития. При изучении экспрессии генов при развитии хряща и костей одним из препятствий является неоднородность скелетных структур, состоящих из нескольких типов тканей. Точная изоляция конкретной ткани интереса является ключом к успешному транскрипционного анализа.

Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции типов клеток или регионов, представляющих интерес в неоднородных тканях, и воспроизводимый и чувствителен к одноклеточному уровню2. Он может точно цели и захвата клеток, представляющих интерес для широкого спектра вниз по течению анализы в транскриптомике, геномике и протеомике3,4. Качество изолированной РНК, ДНК или белка можно оценить с помощью биоанализа или эквивалентной платформы. Например, качество РНК указывается номером целостности РНК (RIN)5.

Здесь мы предоставляем протокол для быстрого окрашивания и изоляции хряща и кости LCM от свежих замороженных тканей. Мы используем эмбрион мыши, чтобы продемонстрировать, что этот протокол дает высококачественную РНК для последующего транскриптомического анализа, такого как секвенирование РНК (РНК-сек).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткани мышей были получены в соответствии с Национальным иринститутам Здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и протоколы исследования были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета в Icahn школы медицины на горе Синай.

1. Подготовка свежих замороженных specimen

  1. Вскрыть эмбрион или ткани, представляющие интерес. Встраивайте образец в одноразовую форму для встраивания с оптимальной температурой резки (OCT). Отрегулируйте ориентацию образца наконечником или иглой.
  2. Быстро замораживать образцы в сухом льду / метил-2-бутана ванны. Продолжайте следующий шаг или храните при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

2. Криосекция для лазерного захвата микродиссекции

  1. Разморозьте криостат и очистите внутренние поверхности 70% этанола. Лечить анти-ролл пластины и пару щипков с RNase обеззараживания агента. Установите криостат до желаемой температуры резки (от 18 до -22 градусов по Цельсию). Приготовьте крышкой контейнер с сухим льдом, поместив лист алюминиевой фольги на сухой лед для временного хранения секционных проб слайдов во время криосекции.
    ПРЕДЕКТО: Сухой лед очень холодный. Всегда обрабатывать сухой лед с осторожностью и носить изолированные перчатки при обработке его.
  2. Перенесите свежий замороженный образец в ведро сухого льда. Поместите слой соединения OCT на держатель образца криостата и немедленно поместите образец на верхнюю часть OCT с мягким давлением. Когда OCT полностью заморожен, закрепите держатель образцом в криостат разрезание руки.
  3. Оставьте образец в криостате на 15 мин, чтобы уравновесить температуру резки.
  4. Раздел ткани и собирать ломтики на полиэтилен овый нафталат (PEN) мембраны слайды толщиной 12 мкм. Выравнивание последовательных секций на мембране. После того, как один слайд завершен, позволяют разделы высохнуть в течение нескольких минут и передать слайд на фольгу в сухом контейнере льда, пока все необходимые слайды собраны.
  5. Храните слайды при -80 градусов по Цельсию в слайд-поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина раздела выбрана для того чтобы увеличить количество ткани собранной пока позволяющ эффективную вырезыть ткани, и может поменять в зависимости от ткани интерес. Протокол можно приложить здесь. Держите слайды свободными от загрязнения RNase. Избегайте перепадов температуры. Хотя RINs РНК из слайдов, хранящихся до 6 месяцев, все еще могут указывать на высокое качество РНК, мы рекомендуем использовать слайды как можно скорее.

3. Подготовка образца для микродиссекции лазерного захвата

  1. Подготовьте решения для окрашивания и обезвоживания.
    1. Поместите 45 мл 80% этанола в каждой из трех 50 мл центрифуговых труб на льду. Этикетка их как #1, #2 и #3. Разбавить этанол свободной водой RNase/DNase.
    2. Поместите 45 мл 95% этанола в 50 мл центрифуги трубки на льду.
    3. Поместите 45 мл 100% этанола в 50 мл центрифуги трубки на льду.
    4. Поместите 45 мл ксилена в центрифугую трубку мощностью 50 мл при комнатной температуре.
      ПРЕДЕКТО: Ксилен следует использовать в дымящийся капюшон.
  2. Оттепель ПЕН мембраны слайд кратко, поместив его против руки в перчатках, а затем мыть дважды по 30 с каждый в 45 мл 80% этанола (#1 и #2) с возбуждением в 50 мл центрифуги труб для удаления OCT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы удалить OCT перед окрашиванием, чтобы предотвратить OCT ослаблены во время окрашивания от затемнения разделов. Силы могут быть использованы для облегчения удаления OCT, который не смывается агитации.
  3. Положите слайд на листе алюминиевой фольги. Пипетка 0,8 мл 0,1% кресилфийного фиолетового в 50% этанола на слайдике и пятно на 30 с. Вымойте слайд в 45 мл 80% этанола (#3) на 30 с, а затем обезвоживают проходом по 30 с каждый через 45 мл 95% этанола, 100% этанола, и ксилл.
  4. Стенд слайды на деликатной задачей стеклоочиститель в течение 5 минут, чтобы слить ксилена и сухих секций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды должны быть высушены полностью перед LCM.

4. Лазерная микродиссекция захвата

ПРИМЕЧАНИЕ: Носите порошок без нитрила перчатки при выполнении LCM.

  1. Включите LCM микроскоп, лазер и компьютер. Войти на компьютер и запустить программное обеспечение. Поверните ключ к положению "На", чтобы запустить лазер. Когда зеленый свет (Лазер) нажмете красную кнопку, чтобы активировать лазер, а затем свет (Лазер) становится красным, указывая лазер готов к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазеру нужно около 10 минут, чтобы согреться.
  2. Настройка коллекторских трубок.
    1. Вставьте крышку трубки полимеразы 0,5 мл полимеразы (ПЦР) в коллектор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий коллектор для нужных трубок ПЦР (0,2 или 0,5 мл).
    2. Пипетка 50 л извлечения буфера (предоставленного комплектом изоляции РНК, перечисленным в таблице материалов)в крышку трубки сбора 0,5 мл.
    3. Вставьте устройство сбора в микроскоп.
    4. В окне устройства коллектора изменений нажмите на кнопку Move to Reference Point, чтобы переместить коллектор в точку отсчета (RP). Отрегулируйте фокус, чтобы четко просмотреть RP. Нажмите на стрелки, чтобы переместить RP в центр представления.
  3. Нагрузка образца слайдов.
    1. Нажмите левую кнопку Разгрузки в панели инструментов, чтобы понизить держатель слайда.
    2. Поместите слайд в держатель, с разделом ткани, обращенным вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ориентация гарантирует, что захваченные участки ткани попадают в крышку коллекторской трубки под действием силы тяжести.
    3. Вставьте держатель обратно на сцену.
  4. Настройка параметров лазера.
    1. Выберите опцию управления лазерным меню или нажмите на значок Laser.
    2. Отрегулируйте эти параметры по желанию: мощность,мощность лазера; Диафрагма,ширина лазера; и скорость, скорость резки в Draw и Cut режиме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Испытать лазер в области из интереса. Более высокая мощность или большая диафрагма облегчает разрезание, но наносит больший ущерб клеткам. Отрегулируйте комбинацию мощности, диафрагмы и скорости, чтобы получить эффективную резку и минимальный ущерб ткани. Например, мощность No 40, диафрагма No 5, а скорость No 7 для хрящевой ткани на участке 12 мкм.
  5. Выберите и вырежьте области, представляющие интерес.
    1. Начните с 5x цели и найти области, представляющие интерес, а затем переключиться на цель (5x, 10x, или 40x), что лучше всего показывает область интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После кресилфийно-фиолетового окрашивания хрящи окрашены пурпурными, а минерализованные ткани кажутся коричневыми или черными, отличающимися от других тканей. Изображения могут быть сохранены с помощью Сохраненные изображения Как из меню файла.
    2. Выберите трубку для сбора (A, B, C, D), нажав на отметку на коллекторе.
    3. Выберите Переместить и вырезать или рисовать и вырезать. В режиме Move and Cut образец вырезается вручную, используя мышь или сенсорную ручку, чтобы рисовать фигуры от руки. В режиме Draw и Cut фигуры могут быть нарисованы от руки с помощью мыши или сенсорного экрана пера для последующей резки. Нажмите кнопку Start Cut, чтобы инициировать лазерную резку.
    4. Как только разрез завершен, целевая ткань с мембраной ПЕН-клуба попадает в крышку коллекторской трубки под действием силы тяжести. Повторите 4.5, чтобы объединить несколько областей, представляющих интерес, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторение порезов или увеличение мощности или диафрагмы может быть необходимо, если ткань не падает в крышку трубки сбора из-за неполной резки. Минерализованная кость (коричневая или черная) не может быть разрезана непосредственно лазером.
  6. Разгрузите коллектор и тщательно закройте трубку ПЦР. Поместите микрорасчленированные ткани в сухой лед. Продолжайте следующий шаг или храните при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Повторите 4,2 до 4,6 для следующей выборки.

5. Лизиз микрорасчлененных тканей и изоляции РНК

  1. Оттепель микрорасчлененных тканей при комнатной температуре. Центрифуга кратко и инкубировать образцы в течение 30 минут при 42 градусах Цельсия.
  2. После инкубации, спина лисис буфера вниз в 0,5 мл ПЦР трубки. Выполните обработку DNase и экстракцию РНК с помощью комплекта изоляции РНК (см. Таблицу Материалов)в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Корональные секции свежих замороженных тканей мыши на E16.5 были использованы для демонстрации изоляции и сбора хряща Мекеля (MC), кондилярного хряща и мандибулярной кости LCM. Эмбрионы мыши на E16.5 были расчленены и встроены в криогенные формы с соединением OCT. Образцы в плесенях быстро замораживались в сухом льду и метил-2-бутановой ванне и хранились при -80 градусов по Цельсию.

Для демонстрации кресилофийного фиолетового окрашивания хряща и костей было проведено криосекция в корональной п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM позволяет обезолюрить обогащенные или однородные популяции клеток от неоднородных тканей. Его преимущества включают быстрый и точный захват клеток в контексте in vivo, в то время как потенциальные недостатки включают в себя его время, дорого, и ограничивается необходимостью для пользователя распознать различные субпопуляции в указанной выборке30. Этот протокол содержит подробную информацию о LCM эмбрионального хряща мыши и кости, подчеркивая использование кресилфийного фиолетового окр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований (R01DE022988) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD078233) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD07823). Авторы благодарят Biorepository и патологии Core для доступа к Leica LMD 6500 платформы в Icahn школы медицины на горе Синай.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-метилбутанThermoFisher ScientificO3551-4
БиоанализаторAgilentG2939BA
ЦентрифугаThermoFisher Scientific339653Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки, 50 мл
Крезил фиолетовый ацетатSigma-AldrichC5042
CryostatLeica BiosystemsCM3050 S
Салфетка для деликатных задачThermoFisher Scientific06-666
Одноразовая форма для встраиванияThermoFisher Scientific1220
Дистиллированная водаInvitrogen10977-015ДНКаза/РНКаза
Этанол, абсолютный (200 proof)ThermoFisher ScientificBP2818Класс молекулярной биологии
Стекло PEN мембранное слайдLeica Microsystems11505158
система LCMLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Покровное стекло для микроскопаThermoFisher Scientific12-545FP
Предметные стекла для микроскопаThermoFisher Scientific12-550-15
ОКТ-соединениеЭлектронная микроскопия Sciences102094-106
ПЦР-пробирка с плоским колпачком, 0,5 млAxygenPCR-05-CLCM Сборные пробирки
Постоянный монтажный материалVector LaboratoriesH-5000
ThermoFisher НаучноеKIT0204 средство для
обеззараживания РНКазы ThermoFisher Средство для обеззараживания РНКазыSigma-AldrichR2020РНКазное средство для очистки поверхностей
КсилолSigma-Aldrich214736
Набор для выделения РНК

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17(2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи